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1、培育转基因抗虫棉的简要过程与载体与载体（质粒）（质粒）拼接拼接 普通棉花（无抗虫特性）（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉（有抗虫特性）（有抗虫特性）导入导入获得抗虫基因重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的 检测与鉴定自学指导1：阅读P76-P776-P77 7，限时3分钟1、培育转基因抗虫棉的步骤有哪些？2、目的基因的定义？实例有？3、目的基因的获取途径有哪些？最常用的是？4、筛选目的基因的方法有？最有效的是？5、简述Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程思考：Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？(1)概念：在基因工程的设计和操作中，用于
2、改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。(2)实例：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。1、目的基因资料：资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（BtBt抗虫蛋白）抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将科学家将“杀虫基因杀虫基因”转入棉花中，棉花产生转入棉花中，棉花产生Bt Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。抗虫蛋白抵抗虫害。目的基因主要指的是编码蛋白质的基因。那么如何筛选目的基因？筛选方法：筛选方法：从相关的从相关的已知结构和功能清晰已知结构和功能清晰的基因中进
3、行筛选的基因中进行筛选已知结构：已知结构：功能清晰：功能清晰：2、目的基因的筛选科学家掌握了科学家掌握了BtBt基因的序列信息基因的序列信息 Bt Bt抗虫蛋白抗虫蛋白只在只在某类昆虫肠道的碱性环境中才表某类昆虫肠道的碱性环境中才表现出毒性现出毒性，对人和牲畜无影响对人和牲畜无影响利用测序技术、序列数据库（如利用测序技术、序列数据库（如GenBankGenBank）、序列对比工具（如）、序列对比工具（如BLASTBLAST）等，找）等，找到合适的目的基因到合适的目的基因Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，实例：Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程苏云金杆菌（Bt）制成的
4、生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因Bt抗虫蛋白的抗虫原理：当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。思考：Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？那么如何获取目的基因？（1）人工合成：3、目的基因的获取 在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中
5、，科学家采用的是过程中，科学家采用的是人工合成人工合成的方法。的方法。前提：DNADNA合成仪合成仪转基因抗虫棉转基因抗虫棉基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成（2）利用PCR获取和扩增目的基因（常用）（3）从基因文库中获取基因文库：将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段，导入到受体菌的群体中储存，片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞第一步第一步第一步第一步第二步第二步第二步第二步第三步第三步第三步第三步第
6、四步第四步第四步第四步目的基因的检测与鉴定1、目的基因的筛选方法：从相关的从相关的已知结构和功能清晰已知结构和功能清晰的基因中进行筛选的基因中进行筛选2、目的基因的获取方法：（1）人工合成（2）利用PCR获取和扩增目的基因（3）从基因文库中获取利用测序技术、序列数据库（如利用测序技术、序列数据库（如GenBankGenBank）、序列对比工具（如）、序列对比工具（如BLASTBLAST）等，找）等，找到合适的目的基因到合适的目的基因1、聚合酶链式反应缩写为？定义是？原理是？该技术是由谁发明的？2、结合表3-1体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？3、结合表3-5，PCR扩增的过程分
7、为几步？扩增结果结果是？扩增模板是？扩增方式？自学指导2：阅读P7 77 7-P7-P78 8，限时4分钟扩增次数第1次第2次第3次第n次DNA分子数含引物A(或B)的DNA分子数同时含引物A、B的DNA分子数共消耗的引物数量思考：PCRPCR聚合酶链式反应聚合酶链式反应苏云金杆菌苏云金杆菌Bt基因基因？快速获得大量快速获得大量Bt基因基因提取提取（2）利用PCR获取和扩增目的基因3、目的基因的获取PCRPCR由由穆里斯穆里斯等人于等人于19851985年发明，为此，年发明，为此，穆里斯于穆里斯于19931993年获年获得诺贝尔化学奖。得诺贝尔化学奖。原理原理：定义定义：DNADNA半保留复制
8、半保留复制在在体体外外提提供供参参与与DNADNA复复制制的的各各种种组组分分与与反反应应条条件件，对对目目的的基基因因的的核核苷苷酸酸序序列进行大量复制的技术。列进行大量复制的技术。思考思考1 1：结合体内结合体内DNADNA复制过程，思考复制过程，思考PCRPCR的进行需要哪些条件？的进行需要哪些条件？体内体内DNADNA复制复制参与的组分参与的组分在在DNADNA复制中的作用复制中的作用PCRPCR中参与的组分中参与的组分4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸引物引物（通常为小的（通常为小的单链单链RNARNA）用高温代替用高温代替DNADNA（目的基因）模板（目的基因）模板4 4种脱氧核苷酸种
9、脱氧核苷酸(dNTP)耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）与模板与模板DNADNA相结合的相结合的2 2种种引物引物（通常为小的（通常为小的单链单链D DNANA）反应还需要其它条件，如缓冲液（一般添加Mg2+2+，激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶）、和控温设备DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA母链母链解旋酶解旋酶打开打开DNADNA双链双链提供提供DNADNA复制的模板复制的模板合成子链的原料合成子链的原料催化合成催化合成DNADNA子链子链使使DNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的33端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸知识归类PCR技术与细胞内
10、DNA复制的比较比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化DNA在高温下变性解旋场所主要在细胞核内细胞外(主要在PCR扩增仪内)酶解旋酶、DNA聚合酶等耐高温的DNA聚合酶温度细胞内温和条件控制温度，需在不同温度下进行结果合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因联系模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板原料:均为四种脱氧核苷酸酶:均需DNA聚合酶引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成原则：碱基互补配对目的基因的筛选与获取脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸dATP 腺嘌呤脱氧核苷酸 dADP腺苷（A)腺嘌呤脱氧核糖PPPOHH 在PCR过程中实际加入的为dNTP（即d
11、ATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料原料，又可为DNA的合成提供能量提供能量,因此因此不需要不需要额额外添加外添加。拓展引物相关知识1、概念：是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核（2030个核苷酸）。2、作用：引物能使耐高温的DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸。3、结合部位：引物结合在模板链的_。3端拓展35DNA母链135DNA母链235引物135引物235DNA母链135DNA母链2子链延伸方向5 34、PCR扩增时至少需要_种引物，原因是_2DNA的两条链是反向平行的，用2种引物才能保证DNA的两条链同时被扩增5、PCR扩增的前提
12、是：根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物6、设计引物时必须依据：目的基因的核苷酸序列7、设计引物的要求：同种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：_2种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：_。防止引物自身折叠防止引物之间配对，导致引物不能与模板链结合引物相关知识拓展两种引物的要求？（理解）引物自身不能环化 两种引物之间不能互补配对引物长度不宜过短，防止引物随机结合耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（DNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）55变性复性延伸温度上升到90以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72
13、左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3端合成新的DNA链。72是Taq酶的最适温度PCR扩增过程第二轮循环的产物第三轮的产物35353535第一轮循环的产物3535【特别提示】PCR扩增过程中引物、原料需要一次性加入。扩增次数第1次第2次第3次第n次DNA分子数含引物A(或B)的DNA分子数同时含引物A、B的DNA分子数共消耗的引物数量22046814262n2n+1-22n-21372n-1PCR扩增DNA规律 由于一个一个循环得到的产物产物又可以作为下一个下一个循环的模板模板，因而每一每一次循环后次循环后目的基因的量可以增加一倍增加一倍。即成即成指数形式扩
14、增形式扩增（约为约为2n，其中，其中n n为为扩增循环的次数扩增循环的次数）。结果：结果：思考思考3 3：PCRPCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNADNA分分 子中分离出目的基因？子中分离出目的基因？5355第一次循环第二次循环35第三次循环33用PCR可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。1.1.逆转录酶以逆转录酶以RNARNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNARNA互补的互补的DNADNA链，形成链，形成RNA-DNARNA-DNA杂交分子；杂交分子；2.2.核酸酶核酸酶H H降解降解
15、RNA-DNARNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNARNA链，使之变成单链链，使之变成单链DNADNA；3.3.以单链以单链DNADNA为模板，在为模板，在DNADNA聚合酶的作用下合成另一条互补的聚合酶的作用下合成另一条互补的DNADNA链，形成双链链，形成双链DNADNA分分子，即子，即cDNAcDNAPCRPCR反应的条件和过程反应的条件和过程变性复性延伸加热到90以上，DNA双链解旋为单链降到50左右，引物通过碱基互补配对与单链DNA结合升温到72左右，4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链整理知识、背诵记忆整理知识、背诵记忆1、培育转
16、基因抗虫棉的步骤2、目的基因的定义、获取途径3、聚合酶链式反应定义4、DNA复制和PCR所需的基本条件5、PCR扩增的过程、扩增模板、循环结果、扩增方式1PCR技术扩增DNA，需要的条件是（）目的基因引物四种脱氧核苷酸mRNADNA聚合酶等核糖体ABCDD当堂巩固获得了足量的目的基因后，是否能获得了足量的目的基因后，是否能直接直接将目的基因导入受体细胞呢？将目的基因导入受体细胞呢？核心步骤核心步骤基因表达载体构建基因表达载体构建学习目标1、阐述基因表达载体构建的目的2、掌握基因表达载体的构建过程自学指导：阅读P80，限时5分钟1、基因工程的基本操作程序的核心步骤是？2、基因表达载体构建的目的？
17、需要的元件有哪些？作用是？3、辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”4、结合图3-6，概述基因表达载体构建的流程？切割目的基因的方法有哪两种？该过程需要用到哪些工具酶？5、阅读课时练P86页过程建构：使用一种限制酶进行切割目的基因和质粒，共有几种连接情况？那如何避免上述问题？6、将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更便捷吗？如果这么做，效果会怎样？确保基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；使目的基因能够表达和发挥作用。1、目的：-基因工程的核心思考：思考：要使要使BtBt基因在受体细胞中稳定存在，并能够表达和发挥作用，基因在受体细胞中稳定存在，并能够表达和发挥作用，载体还
18、需要哪些结构？载体还需要哪些结构？2、基因表达载体的组成思考：思考：要各个元件有什么作用要各个元件有什么作用？目的基因：能控制表达所需要的特殊性状(必须插到启动子和终止子之间)复制原点：DNA复制的起始位点终止子：本质：有特殊序列结构的DNA片段位置：基因的下游功能：终止转录四环素抗性基因、荧光蛋白基因等启动子：本质：有特殊序列结构的DNA片段位置：基因的上游功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA标记基因：作用为鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来-基因工程的核心注意事项：1、目的基因应插入启动子和终止子之间的部位，并且不能破坏启动子、终止子、复
19、制原点和标记基因。2、载体表达载体：相同点：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。区别：表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。易错提醒项目项目启动子启动子终止子终止子起始密码子起始密码子终止密码子终止密码子本质本质_位置位置目的基因上游目的基因上游目的基因下游目的基因下游mRNAmRNA首端首端mRNAmRNA尾端尾端功能功能_ _ _DNADNAmRNAmRNARNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号(编码氨基酸)翻译的结束信号(不编码氨基酸)回忆旧知：启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 用一定的限制酶
20、切割载体，使其出现一个切口。用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。将切下的Bt基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。载体基因表达载体3.3.基因表达载体基因表达载体构建过程构建过程：单酶切为了产生相同的黏性末端，以便进行连接请文字和箭头表示基因表达载体的构建过程？请文字和箭头表示基因表达载体的构建过程？载体（质粒）DNA分子（含目的基因）限制酶处理带有黏性末端或平末端的切口带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种3、基因表达载体的构建过程问题：该过程需要用到哪些工具酶？限制酶、限制酶、
21、DNADNA连接酶连接酶自连自连片段间片段间连接连接目的基因自连目的基因自连质粒自连质粒自连目的基因与质粒目的基因与质粒目的基因与目的基因连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接质粒与质粒连接目的基因目的基因11载体载体2212212211使用一种限制酶进行切割目的基因和质粒，共有几种连接情况？探究探究活动：活动：正向连接正向连接 反向连接反向连接单酶切缺点：质粒重新环化质粒重新环化、目的基因自身环化目的基因自身环化、质粒与目的基因反向连接质粒与目的基因反向连接选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割-G-CTTAA-A-TCTAG-G-CTTAA-A-TCTAG那如何避免上述问题？那如何
22、避免上述问题？双酶切！思考讨论2.2.双酶切时是否能用双酶切时是否能用EcoR 和和BamH？为什？为什么？么？四环素抗性基因EcoR Hind BamH 不能不能 因为因为BamH 会破坏质粒的抗性基因，会破坏质粒的抗性基因，无法进行重组无法进行重组DNA筛选。同时筛选。同时BamH 切切割位点在目的基因上，也会破坏目的基因。割位点在目的基因上，也会破坏目的基因。EcoR Hind BamH 用EcoR 和和Hind 根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因等来确定限制酶的种类。拓展：限制酶的选择方法(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，
23、如图甲可选择Pst；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma。(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用Pst和EcoR两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和筛选，如图乙中的质粒不能使用Sma切割。（同理保留启动子、终止子、复制原点）（4）目的基因需要插入启动子和终止子之间将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？这种方法针对性差，完全
24、靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体细胞 由于不同转基因产品所需要的目的基因不同，受体细胞又有植物、动物、微生物之分，因此基因表达载体的构建方法不是千篇一律的,将目的基因导入受体细胞的方法也不是完全相同的。确保目的基因在受体细胞中能稳定存在和表达，并能遗传给下一代。确保目的基因在受体细胞中能稳定存在和表达，并能遗传给下一代。基因表达载体构建的目的：基因表达载体构建的目的：1 12 2启动子启动子上游上游RNARNA聚合酶聚合酶转录转录终止子终止子下游下游RNARNA聚合酶聚合酶转录转录标记标记目的基因目的基因基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：整理知识、背诵记忆整理知识、背诵记忆1、培育转
25、基因抗虫棉的步骤2、目的基因的定义、获取途径3、聚合酶链式反应定义4、DNA复制所需的基本条件是5、PCR的进行需要条件6、PCR扩增的过程、扩增模板、循环结果、扩增方式7、循环的步骤1.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是A.二者子链的延伸方向相同，均为5端3端B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量D.二者遵循的碱基互补配对原则相同2.(2022天津一中高二期中)下图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3端B.在第三轮循环产物
26、中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/43.3.下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是A.A.启启动动子子是是RNARNA聚聚合合酶酶识识别别和和结结合合的的位位点点，组组成成它它的的基基本本单单位位是是脱氧核苷酸脱氧核苷酸B.B.基基因因表表达达载载体体的的组组成成包包括括目目的的基基因因、启启动动子子、终终止止密密码码子子、标标记基因等组件记基因等组件C.C.人人工工构构建建的的诱诱导导型型启启动动子子，当当诱诱导导物物存存在在时时，可可激激活活或或抑抑制制目目的基因的表达的基因的表达D.D.由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别4.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述不正确的是A.在构建重组质粒时，可用Pst和Hind 切割质粒和外源DNAB.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因C.若只用Pst处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长