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1、知识回顾知识回顾限制性内切核酸酶（限制酶）重组DNA技术的基本工具DNA连接酶 载体 “分子手术刀”“分子缝合针”“分子运输车”基因工程的基本操作程序授课教师：喻秀晶授课教师：沈垚情景任务：资料资料1 1：我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。资料资料2 2：苏云金杆菌能产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（BtBt抗虫蛋白抗虫蛋白），Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。因此，B
2、t抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。如果你是科学家，你想帮助棉农解决这一难题，如何能培育出自身自身就能抵抗虫害就能抵抗虫害的棉花新品种呢？1.目的基因的筛选与获取4.目的基因的检测与鉴定2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞基因工程的基本操作程序探究一、目的基因的筛选与获取探究一、目的基因的筛选与获取目的基因目的基因用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因；与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。（Bt抗虫蛋白基因：转基因抗虫棉）。主要是编码特定蛋白质的基因实例【活动【活动1 1】阅读课本76页和77页1-3段及第一个相关信息；（1）明确目的基因的概念和
3、实例概念和实例；（2）筛选合适的目的基因的方法方法。探究一、目的基因的筛选与获取探究一、目的基因的筛选与获取筛选方法【活动【活动1 1】阅读课本76页和77页1-3段及第一个相关信息；（1）明确目的基因的概念和实例概念和实例；（2）筛选合适的目的基因的方法方法。从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。测序技术序 列 数 据 库序列比对工具PCRPCR技术技术获取获取一个一个BtBt基因之后，是否就该立即开始准备转基因操作？基因之后，是否就该立即开始准备转基因操作？苏云金杆菌提取提取Bt基因快速获得大量Bt基因【活动【活动2 2】自主阅读教材P76-77“PCR”相关内容，思考下列问题：（1）P
4、CR的概念概念；（2）PCR的条件条件；（3）PCR的具体过程具体过程。uPCR的概念聚合酶链式反应，根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。DNA的半保留复制特点？利用利用PCRPCR获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因体内DNA复制条件PCR需要的条件DNA母链DNA母链4种脱氧核苷酸4种脱氧核苷酸解旋酶高温（90以上）DNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶小段单链RNA分子（引物）小段单链DNA分子（引物）资料资料1 1：在80-100（高温高温）条件下，DNA双螺旋结构解体，双链打开，这一现象叫做DNADNA的热变的
5、热变性性；当温度降低后，双螺旋结构又会重新合成，即复性。资料资料2 2：引物是一小段与母链互补配对的核苷酸序列（单链），通常分为RNA引物和DNA引物，能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸。PCRPCR过程过程01耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶）4种脱氧核苷酸（dNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）55变性复性延伸温度上升到90以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。P PCRCR反应过程反应过程待扩增的DNA片段3 33 35 55 5
6、3 35 53 35 5变性P PCRCR反应过程反应过程1）变性（不需要解旋酶）：当温度上升到_以上时，断裂，双链DNA解聚为两条。思考：变性的温度为何是90以上的一个温度范围，而不是95？因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。90氢键单链DNA第二步：复性引物1引物2DNA引物3 35 53 35 55 55 5思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？因为Taq酶（耐高温的DNA聚合酶）不能从0开始添加核苷酸。引物结合在DNA模板链3端位置，引导子链从5端3端方向复制。3 33 3P PCRCR反应过程反应过程
7、2）复性：当温度下降到50左右时，两种引物通过与两条单链DNA结合。碱基互补配对第三步：延伸引物1引物2Taq酶Taq酶3 35 53 35 55 55 53 33 33 33 3P PCRCR反应过程反应过程3）延伸：当温度上升到_左右时，溶液中的4种_在耐高温的_的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。脱氧核苷酸DNA聚合酶7272是Taq酶的最适温度Taq酶结合在引物的3端思考1：为什么温度要上升至72？思考2：Taq酶结合在引物的3还是5端？5-CCAGAGATGGGTACGCGAAA-3 3-GGTCTCTACCCATGCGCTTT-5Bt 基因1、设计引物时，是否需要知道整
8、个目的基因的碱基序列？只需知道目的基因两侧的核苷酸序列即可2、要保证两条链同时被扩增，引物至少需要几种？2种学以致用学以致用利用PCR扩增Bt基因 5-CCAGAGATGGGTACGCGAAA-3 3-GGTCTCTACCCATGCGCTTT-5Bt 基因3、子链合成的方向是 5-3，那么引物的结合位置是？5-CCAGAGATGGGTACGCGAAA-3(2)(1)3-GGTCTCTACCCATGCGCTTT-5(4)(3)5-CCAGAGATGGGTACGCGAAA-3 3-GGTCTCTACCCATGCGCTTT-5Bt 基因现学现用现学现用（多选）利用PCR扩增Bt 基因时，选择的引物是
9、（)引物1：5-CCAGAG-3引物3：3-CCAGAG-5引物2：3-CGCTTT-5引物4：5-CGCTTT-3引物1、2 5-CCAGAGATGGGTACGCGAAA-3 3-GGTCTCTACCCATGCGCTTT-5Bt 基因【活动【活动3 3】，：（1）完成导学案PCR过程（三轮）；（2）小组合作交流总结PCR过程；（3）派一名成员阐述与展示PCR过程。总结：PCR扩增规律（1）若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为个。（2）若开始有N个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为个。2nN2nuPCR扩增方式：以指数方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）2n1.目的基因的筛选与获取4.目的基因的检测与鉴定2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞基因工程的基本操作程序思考：思考：能不能能不能直接直接将目的基因导将目的基因导入受体细胞，为什么入受体细胞，为什么？