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1、第三章基因工程第2节基因工程的基本操作程序选必三P76课标内容要求课标内容要求核心素养对接核心素养对接阐明基因工程的基本操作程序主要阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的包括目的基因的筛选与筛选与获取、基因获取、基因表达载体的构建、表达载体的构建、将将目的基因导入目的基因导入受体细胞和目的基因的检测受体细胞和目的基因的检测与与鉴定。鉴定。1.科学思维：结合生产实例，举例科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。说出基因工程的基本操作程序。2科学探究：针对人类生产和生活的科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步
2、设计。程构想，完成初步设计。从社会中来1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？转基因抗虫棉转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡使棉铃虫死亡)普通棉花普通棉花1.目的基因的筛选与获取第一步：目的基因的筛选与获取1.目的基因的概念：（1）方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。2.筛选合适的目的基因 在基因工程的设计和操作中，用于_或_等的基因就是目的基因，根据不同的需要，目的基因是不同的
3、，主要是指_；改变受体细胞性状获得预期表达产物编码蛋白质的基因与生物与生物抗逆性抗逆性(Bt(Bt抗虫基因抗虫基因等等)、优良品质优良品质(xx(xx产量高的基因等产量高的基因等)、生产药物、生产药物(胰岛胰岛素、干扰素基因素、干扰素基因等等)、毒物降解、工业用酶、毒物降解、工业用酶等相关的基因等相关的基因认识基因结构和功能的技术方法认识基因结构和功能的技术方法：_技术、技术、_数据库、数据库、_工具。工具。测序测序序列序列（如（如GenBank）序列比对序列比对（如（如BLAST）DNA序列序列自动测序仪自动测序仪第一步：目的基因的筛选与获取（2）实例：2.筛选合适的目的基因Bt抗虫蛋白抗虫
4、蛋白基因基因（Bt基因）的筛选过程基因）的筛选过程苏云金杆菌（苏云金杆菌（Bt）制成的生物杀制成的生物杀虫剂虫剂广泛用于防治棉花虫害广泛用于防治棉花虫害对对Bt基因的基因的表达产物表达产物Bt抗虫蛋白抗虫蛋白有较为深入的了解：有较为深入的了解：苏云金杆菌苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫昆虫的消化系统来杀死棉铃虫苏云金杆菌的杀虫作用于苏云金杆菌的杀虫作用于Bt基因基因有关有关掌握了掌握了Bt基因的基因的序列信息序列信息Bt基因基因是培育是培育转基因转基因抗虫棉抗虫棉较为合较为合适的
5、目适的目的基因的基因【P77相关信息】当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。第一步：目的基因的筛选与获取（1）PCR的概念:3.利用 PCR 获取和扩增目的基因PCR是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术；全称：原理：操作环境：目的：优点：聚合酶链式反应DNA半保留复制体外（PC
6、R扩增仪/PCR仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制可以在短时间内大量扩增目的基因 PCR由由穆里斯穆里斯等人于等人于1985年发明，为此，年发明，为此，穆里斯于穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖年获得诺贝尔化学奖 如果说，沃森和克里克发现如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分技术则标志着分子生物学的腾飞子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。因为他，分子生物学被划分为两个
7、时代【凯利穆利斯】https:/ 解旋解旋酶DNA母母链 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNA聚合聚合酶引物引物提供提供DNADNA复制的模板复制的模板合成合成DNADNA子链的原料子链的原料打开打开DNADNA双链双链催化合成催化合成DNADNA子链子链使使DNADNA聚合酶能够从聚合酶能够从引物的引物的3 3端端开始连接脱氧核苷酸开始连接脱氧核苷酸（体外用耐高温的（体外用耐高温的DNA聚合聚合酶，如，如Taq酶酶）（体外用高温代替）（体外用高温代替）引物是一小段能与引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。在细胞内进行在细胞内进行DN
8、A复制时，引物多为短复制时，引物多为短RNA单链（由引物酶合成）。单链（由引物酶合成）。在体外在体外PCR中，引物为人工设计、合成的短中，引物为人工设计、合成的短DNA单链单链，长度通常为，长度通常为20 30个核苷酸。个核苷酸。（体外用dNTP）引物引物(2种种)DNA模板模板耐高温的耐高温的DNA聚合聚合酶Taq酶酶4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸 实际为实际为dNTP35353535变性性 当温度上升到当温度上升到90以上以上时，双双链DNA解聚解聚为单链复性复性当温度下降到当温度下降到50左右左右时，两种引物通两种引物通过碱基互碱基互补配配对与两条与两条单链DNA结合合延伸延伸当温度上升到当
9、温度上升到72左右左右时，溶液溶液中的中的4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸在在耐高温的耐高温的DNA聚合聚合酶的作用下，根据的作用下，根据碱基碱基互互补配配对原原则合成新的合成新的DNA链（3）PCR反应过程条条件件3535353535353535缓冲液缓冲液（含（含Mg2+)Mg2+激活激活真核细胞和真核细胞和细菌的细菌的DNA聚合酶聚合酶第一轮循环的第一轮循环的产产物物作为第二轮反作为第二轮反应的应的模板模板，经过，经过变性、复性和延变性、复性和延伸伸三步产生第二三步产生第二轮循环的产物；轮循环的产物；第二轮循环的第二轮循环的产物产物作为第三作为第三轮反应的轮反应的模板模板，经过经过变性、复变性
10、、复性和延伸性和延伸三步三步产生第三轮的产生第三轮的产物；产物；第二轮循环的产物第二轮循环的产物第三轮的产物第三轮的产物完成以后，完成以后，常采用常采用琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳电泳来鉴来鉴定定PCRPCR的的产物产物（3）PCR反应过程变性（9095）复性（5055）延伸（72左右）PCR 的每一次循环：（3）PCR反应过程变性（9095）：双链DNA模板在高温的作用下 受热变性，_键断裂，形成_复性（复性50左右）：温度降低，_与DNA模板 互补配对，结合形成局部_。延伸（72左右）：_在 _酶的作用下，合成与模板互补的DNA链。氢单链DNA双链引物Taq4种游离的脱氧核苷酸/dNTP每次循
11、环一般可以分为_、_、_三步。变性复性延伸重复循环多次。由于延伸后得到的_又可以作为下一个循环的_，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成_形式扩增。产物模板指数（约为2n，其中n为扩增循环的次数）目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合(复性)；然后以目的基因的两条单链DNA为模板在DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3端，如此重复循环多次。（3）PCR反应过程上述过程可以在PCR扩增仪（PCR仪）中自动完成，完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。【P79旁栏旁栏思考思考题】用】用PCR可以可以扩增增mRNA吗？mRNAmRNA不可
12、以直接扩增，需要将它不可以直接扩增，需要将它逆转录逆转录成成cDNAcDNA再进行扩增。再进行扩增。1.1.逆转录酶逆转录酶以以RNARNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNARNA互补的互补的DNADNA链链，形成，形成 RNA-DNARNA-DNA杂交分子杂交分子；2.2.核酸酶核酸酶H H降解降解RNA-DNARNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNARNA链链，使之变成，使之变成单链单链DNADNA；3.3.以单链以单链DNADNA为模板，在为模板，在DNADNA聚合酶聚合酶的作用下合成另一条互补的的作用下合成另一条互补的 DNADNA链，形成链，形成双链双链DNADNA分子分子，
13、即，即cDNAcDNA。目的基因第1轮复制【思考】加入PCR扩增仪的DNA片段一般比目的基因要长，用PCR技术至少经过几次循环才能从DNA片段中分离出目的基因？3次第2轮复制55第3轮复制高温解决了打开双链的问题，但是，又导致高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐聚合酶失活的问题，耐高温的高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化技术的自动化2）Taq DNA聚合酶的应用聚合酶的应用DNA模板，模板，四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸/dNTP，分别与两条模板链，分别与两条模板链相结合
14、的两种引物，相结合的两种引物，Taq 酶酶4)PCR和和细胞内细胞内DNA复制的异同复制的异同1）DNA聚合酶特性聚合酶特性不能从头合成不能从头合成DNA，只有当引物与，只有当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶才能从引物的聚合酶才能从引物的3端开始延伸端开始延伸DNA链，链，DNA的合成方向总是的合成方向总是从子链的从子链的5端向端向3端延伸端延伸。关于关于PCR的说明：的说明：3)缓冲液需要为缓冲液需要为PCR反应提供的物质反应提供的物质PCR技术与细胞内DNA复制的比较比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋特点解旋方式场所酶温度结果联系先解
15、旋后复制边解旋边复制DNA在高温(超过90)下变性解旋解旋酶催化体外/PCR扩增仪主要在细胞核内耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)解旋酶、DNA聚合酶 等控制不同温度(变性、复性、延伸)细胞内温和条件大量的DNA片段或基因合成整个DNA分子原理都是DNA的半保留复制；都遵循碱基互补配对原则模板：均需要DNA的双链作为模板原料：均为四种脱氧核苷酸(dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP)酶：均需DNA聚合酶引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3端开始进行互补链的合成(PCR的引物是人工设计、合成的短DNA片段)均需要能量1.下列有关PCR技术的说法，错误的是（）A.PCR是一项在生物
16、体外复制特定DNA片段的核酸合成技术 B.PCR技术的原理是DNA分子半保留复制 C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D.PCR扩增中需要解旋酶解开双链DNA2.下列有关PCR扩增目的基因的叙述，错误的是（）A.PCR扩增一般需要经历多个循环，每个循环分为变性、复性和延伸3步 B.PCR扩增时，需要向PCR管中加入4种游离的脱氧核苷酸 C.PCR过程需要耐高温的Taq酶和DNA连接酶 D.PCR扩增区域由2种引物来决定D随堂练习C3.下列关于PCR的叙述，正确的是（）A.PCR是体外复制DNA的技术，关键酶是解旋酶和DNA聚合酶 B.DNA聚合酶从引物的5端开始连接脱氧核苷酸
17、 C.第三轮循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段 D.延伸过程需要酶和4种核糖核苷酸4.应用PCR技术扩增DNA，需要的条件是（）目的基因 引物 四种脱氧核苷酸 四种核糖核苷酸耐热的DNA聚合酶 核糖体 mRNA A.B.C.D.C随堂练习D第二步：基因表达载体的构建(核心步骤)1.构建基因表达载体的目的：通过PCR技术获取了足够量的Bt基因后，下一步要做什么？（1）让目的基因在受体细胞中_并可以_给下一代；（2）使目的基因能够_和发挥作用。稳定存在表达遗传基因表达载体是载体的一种，除基因表达载体是载体的一种，除_、_外，它还必须有外，它还必须有_、_等。等。2.基因表达载体目的基因选必
18、三P80标记基因启动子终止子第二步：基因表达载体的构建2.基因表达载体当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达(1)启动子转录开始一段有特殊序列结构的_片段DNA本质：位置：位于基因的_，紧挨_上游转录的起始位点功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA人工构建的诱导型启动子：操纵基因操纵基因结构基因结构基因 启动子启动子RNARNA聚合酶聚合酶第二步：基因表达载体的构建2.基因表达载体(2)终止子转录结束：本质：一段有特殊序列结构的_片段DNA位置：位于基因的_下游功能：使转录在所需要的地方停下来(3)标记基因：作用：便于重组DNA分子的筛选(4)目的基因：常见类型：抗生
19、素抗性基因、荧光蛋白基因等。如Bt基因。(5)复制原点：使能完成自主复制 DNA复制的起点复制的起点DNA聚合酶的结合位点聚合酶的结合位点启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别项目启动子终止子起始密码子 终止密码子化学成分位置作用DNADNA片段片段 DNADNA片段片段mRNAmRNA上上三个相邻三个相邻碱基碱基mRNAmRNA上上三个相邻三个相邻碱基碱基目的基因目的基因首端首端目的基因目的基因尾端尾端mRNAmRNA首端首端mRNAmRNA尾端尾端RNARNA聚合聚合酶识别和酶识别和结合的部结合的部位，驱动位，驱动基因转录基因转录出出RNARNA决定转录决定转录的结束的结束决定翻译决
20、定翻译的开始的开始决定翻译决定翻译的结束的结束载体载体与与表达表达载体载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因（、启动子、终止子）表达载体在载体基础上增加了目的基因（、启动子、终止子）。注意：注意：启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。对于目的基因表达必不可少。目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。必需以表达载体的方式携带进去。【思考】表达载体为什么一定要有启动子？【思考】表达载体为什么一定要有启动子？(1)启动子是启动子是RNA聚
21、合酶识别和结合的部位，有启动子，才能驱动基聚合酶识别和结合的部位，有启动子，才能驱动基因转录出因转录出mRNA。生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自。生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；身基因的启动子才能有利于基因的表达；(2)通过通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，如果只将编码序列文库获得的目的基因没有启动子，如果只将编码序列导入受体细胞无法转录，需要将启动子、编码基因、终止子都导导入受体细胞无法转录，需要将启动子、编码基因、终止子都导入受体细胞。入受体细胞。DNA连接酶连接酶3.基因表达载体的构建过程重组重组DNA分子分子/基因表达载体基因
22、表达载体限制酶限制酶目的基因目的基因限制酶限制酶切割位点切割位点获取目的基因获取目的基因基因表达载体构建模式图基因表达载体构建模式图限制酶限制酶启动子启动子限制酶切割位点限制酶切割位点终止子终止子标记标记基因基因复制复制原点原点质粒质粒/载体载体要求？要求？在构建基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；用_或_切割含有目的基因的DNA片段同种限制酶能产生相同末端的限制酶/同尾酶利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。1.切割载体和切割含有目的基因的DNA片段为什么要用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶？产生相同的黏性末端或平末端
23、，以便通过DNA连接酶连接；思考与讨论2.用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶处理后，会出现几种产物？(只考虑两两结合)一定会形成符合要求的重组DNA分子吗？不一定，载体和目的基因都可能出现自环化或自身与自身连接；目的基因也可能会出现反向连接3.如何避免上述问题？同时用两种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体（使得目的基因的一端与载体一端的黏性末端相同，而目的基因的另一端与载体另一端的黏性末端相同）1 1、运载体上运载体上和和目的基因两端目的基因两端都必须的限制酶的切位点；都必须的限制酶的切位点；2 2、限制酶的切位点、限制酶的切位点不能破坏不能破坏目的基因以及标记
24、基因（运载体上目的基因以及标记基因（运载体上至少保留一个标记基因）至少保留一个标记基因）3 3、最好、最好同时用两种限制酶，避免载体和目的基因出现自环化，避免载体和目的基因出现自环化，避免目的基因出现反向连接。避免目的基因出现反向连接。选择限制酶的原则：选择限制酶的原则：随堂练习图图甲甲是是含含有有目目的的基基因因的的外外源源DNA片片段段，图图乙乙是是用用于于将将目目的的基基因因导导入入受受体体细细胞胞的的质质粒粒（阴阴影影部部分分表表示示四四环环素素抗抗性性基基因因），相相关关限限制制酶酶的的作作用用部部位位如如图图所所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。示，现欲培养转基因抗病植株，
25、回答下列问题。（1）上述操作中不宜选用）上述操作中不宜选用Sma I，原因是，原因是Sma I会破坏会破坏_。（2）上述操作中上述操作中不宜选用不宜选用EcoR I，原因是用，原因是用EcoR I切割外源切割外源DNA片段后，片段后，_。目的基因(抗病基因)和标记基因(四环素抗性基因)目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中用图用图1 1中的质粒和图中的质粒和图2 2中的外源中的外源DNADNA构建重组构建重组质粒，不能使用质粒，不能使用SmaSma切割，原因是切割，原因是 。不选用不选用EcoEcoRR切割，原因是切割，原因是 。SmaSma会破坏会破坏目的基因目的基因和和质粒中的抗性
26、基因质粒中的抗性基因防止目的基因和质粒自身环化防止目的基因和质粒自身环化随堂练习思考与讨论【P80旁栏思考题】将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体细胞有人采用总 DNA 注射法进行遗传转化，即将一个生物的总 DNA 提取出来，通过注射或花粉管通道法将这些 DNA 导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。随堂练习1.在基因表达载体的构建中，下列叙述正确的是（）A.必须在细胞内进行B.有了启动子才能驱动基因转录出mRNAC.所有基因表达载体的构建是完全相同的D.一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动
27、子、终止子2.下列关于基因表达载体的构建，描述错误的是（）A.基因表达载体的构建是基因工程的核心B.基因表达载体上的标记基因不一定是抗生素抗性基因C.目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因D.终止密码子的作用是使转录在所需要的地方停止BD随堂练习3.下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是（）A.切割含抗虫基因的DNA片段和载体必须用同种限制酶B.抗虫基因表达载体中要有起始密码子C.抗虫基因表达载体必须具备标记基因，其作用是筛选含有目的基因的受体细胞D.抗虫基因的表达开始于复制原点C第三步：将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入受体细胞的常用方法：阅读阅读81页和页和82页倒数第二段的内容，找
28、出页倒数第二段的内容，找出将将目的基因导入目的基因导入不同不同受体细胞的受体细胞的常用常用方法方法。农杆菌转化法基因枪法基因枪法(多用于单子叶植物多用于单子叶植物)花粉管通道法显微注射法Ca2+处理法/感受态细胞植物细胞动物细胞微生物细胞将目的基因导入将目的基因导入植物细胞的常用方法：(1)花粉管通道法：我国科学家独创用_将_直接注入_中；微量注射器含目的基因的DNA溶液子房在植物受粉后的一定时间内，剪去_，将_滴加在_上，使目的基因借助_进入_；柱头DNA溶液花柱切面花粉管通道胚囊子房花粉柱头花粉管精子卵细胞胚囊花粉管通道法的受体细胞：受精卵将目的基因导入植物细胞的常用方法：(2)农杆菌转化
29、法转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内_和_的过程。维持稳定表达例子：农杆菌转化法、肺炎链球菌转化实验。阅读阅读81页的资料卡，页的资料卡，思考下列问题思考下列问题。1.TDNA的的T是什么意思？为何要把目的基因接在是什么意思？为何要把目的基因接在TDNA中？中？2.目的基因发生了几次剪切和拼接？目的基因发生了几次剪切和拼接？3.农杆菌转化法能有效应用于单子叶植物吗？为什么？农杆菌转化法能有效应用于单子叶植物吗？为什么？(2)农杆菌转化法转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。将目的基因插入_中，通过农杆菌的_作用，就可以使目的基因_农杆菌特点：a.能在自然条
30、件下侵染_和_，而对大多数_没有侵染能力；双子叶植物裸子植物单子叶植物b.农杆菌细胞内含有_，当它侵染植物细胞后，能将_上的_（_）转移到被侵染的细胞，并且将其_；Ti质粒Ti质粒TDNA可转移的DNA整合到该细胞的染色体DNA上利用农杆菌进行转化的思路：Ti质粒的TDNA转化进入植物细胞转化的实质：将目的基因整合到受体细胞的基因组中，使其成功表达(2)农杆菌转化法过程：两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体DNA上。两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入(非人工操作
31、)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。(2)农杆菌转化法转化的具体方法：a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与_的农杆菌共培养，然后_，并利用_技术得到表现出新性状的植株；受体细胞为_导入了重组Ti质粒筛选转化细胞植物组织培养体细胞b.可以将花序直接浸没在含有_的农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得_，再进行_、_等；受体细胞为_导入了重组Ti质粒种子筛选鉴定受精卵(3)基因枪法基因枪法(多用于单子叶植物多用于单子叶植物)基因枪法又称微弹轰击法，是基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩利用压缩气体产生的动力气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表，将包裹在金属颗粒表面的表达载体面的表达载体D
32、NA打入受体细胞中打入受体细胞中，使，使目的基因与其整合并表达的方法。目的基因与其整合并表达的方法。目的基因导入动物细胞不适合用基因枪法，动物细胞易被杀伤。将目的基因导入动物细胞的常用方法 显微注射法（1）受体细胞：受精卵(因为受精卵易表现出全能性)（2）过程：2024/4/24构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物将目的基因导入微生物细胞的常用方法 Ca2+处理法（1）受体细胞：常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛（2）原核生物的优点:繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养（3）一般过程:2024/4/24Ca
33、2+处理大肠杆菌使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态将重组的基因表达载体导入其中Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性这种细胞称为感受态细胞随堂练习1.下列有关目的基因导入受体细胞的说法中，正确的是（）A.大肠杆菌作为受体细胞时通常需要使用钠离子处理 B.通过显微注射法可将目的基因直接导入受体细胞中 C.将目的基因导入受体细胞，并在受体细胞维持稳定和表达的过程，称为转化 D.可用基因枪法将目的基因导入动物受精卵中2.将目的基因导人受体细胞是实施基因工程的第三步，下列有关说法不正确的是（）A.将目的基因导入裸子植物和单子叶植物细胞常用农杆菌转化法 B.转基因动物的培育过程中受体细胞一般
34、选择受精卵 C.用Ca2+处理受体细胞是将目的基因导入微生物细胞中采用最多的方法 D.基因枪法是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高CA随堂练习3.受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同。下列受体细胞与导入方法匹配错误的是（）4.通过转基因技术可以使人的胰岛素基因得以表达，合成有活性的胰岛素的受体细胞是（）A大肠杆菌 B酵母菌 C肺炎双球菌 D乳酸菌选项受体细胞导入方法A棉花细胞花粉管通道法B大肠杆菌农杆菌转化法C羊受精卵显微注射技术D大豆细胞农杆菌转化法B大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞，具有内质网、高尔基体等大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞，具有内质网、
35、高尔基体等多种细胞器，所以在，生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠多种细胞器，所以在，生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠杆菌更具优势。杆菌更具优势。B若利用转基因大肠杆菌生产人的胰岛素 原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性类型检测内容方法分子水平的检测个体生物学水平的鉴定受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因目的基因是否转录出了mRNAPCR等技术DNA探针、RNA探针目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交技术个体是否具有相应性状病原体接种实验等 1.目的：第四步：目的基因的检
36、测与鉴定2.检测内容及方法:个体生物学水平的鉴定具体方法举例转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）接种实验未染病盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常第四步：目的基因的检测与鉴定随堂练习1下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是()A培育“黄金大米”可用花粉管通道法导入目的基因 B显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法 C目的基因导入大肠杆菌最常用的方法是Ca2处理法 D农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法A提示：水稻的花很小
37、，不适合用花粉管通道法导入目的基因，A错误；将目的基因导入动物细胞常用显微注射法，B正确；将目的基因导入微生物细胞最常用的方法是用Ca2处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态，C正确；将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法，此外还有基因枪法和花粉管通道法，D正确。归纳总结归纳总结第四步：目的基因的检测与鉴定随堂练习1基因工程主要操作步骤的顺序是()基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的获取 A B C DC【思考】基因表达载体中具备标记基因，已经对受体细胞进行了筛选，为什么在基因工程的第四步还要对目的基因进行检测和鉴定？基因表达载体
38、中的标记基因（如抗生素抗性基因）可以对受体细胞进行初次筛选：利用含抗生素的选择培养基培养细胞，在这种培养基上能生长的是具有抗生素抗性的细胞，即导入了载体的细胞，这里的载体可能是基因表达载体，也可能是未插入目的基因的空载体。因此第四步需要对目的基因是否成功导入进行进一步的检测。此外，虽然在选择培养基上能生长的细胞中导入的是基因表达载体，但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正确，能否正确表达，因此也需要在转录和翻译及个体水平上进行检测和鉴定。随堂练习判断对错(正确的打“”，错误的打“”)1从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。（）2Taq酶是用PCR仪对DN
39、A分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。（）3基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。（）4将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。（）5转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。()6可通过PCR等技术检测棉花的染色体上是否插入了Bt基因。（）Taq酶是耐高温的DNA聚合酶RNA个体水平的检测个体水平的检测随堂练习1下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。下列相关叙述正确的是()DA的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与B侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到的染色体上C的染色体上若含抗虫基因，则就表现出抗虫性状D只要表现出抗虫性状就表明植株发生了
40、可遗传变异随堂练习2下图是将某细菌的基因A导入大肠杆菌内制备“工程菌”的示意图。据图回答：(1)获得A有两条途径：一是以A的mRNA为模板，在_酶的催化下，合成互补的单链DNA，然后在_酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的_序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的_序列，再通过化学方法合成所需基因。逆转录DNA聚合氨基酸脱氧核苷酸随堂练习2下图是将某细菌的基因A导入大肠杆菌内制备“工程菌”的示意图。据图回答：(2)利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有_、_、4种脱氧核糖核苷三磷酸和耐高温的DNA聚合酶，扩增过程
41、可以在PCR扩增仪中完成。(3)由A和载体B拼接形成的C通常称为_。(4)在基因工程中，常用Ca2处理D，其目的是_。引物模板(A基因)基因表达载体使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态到社会中去转基因抗虫棉在世界范围内被广泛种植，有效控制了棉铃虫的种群数量，显著减少了农药的用量。面对棉铃虫的危害，有了抗虫棉是否就可以一劳永逸、高枕无忧呢？根据棉铃虫对传统农药产生抗性的发展历史，科研人员推测棉铃虫存在对Bt抗虫蛋白产生抗性的可能。请你查阅资料，了解以下问题。1在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？2科研工作者在发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应
42、对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？这是一个开放性的问题，需要学生查找资料来回答。随着田间监测这是一个开放性的问题，需要学生查找资料来回答。随着田间监测数据的更新及新的科研论文发表，每年学生获得的证据是不一样的。例数据的更新及新的科研论文发表，每年学生获得的证据是不一样的。例如，科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，如，科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011 2011 年的数年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013 2013
43、 年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转红铃虫等并未对转 Bt Bt 基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，科研人员通过毒素的连续性抗性筛选，已经印度等国的多个实验室中，科研人员通过毒素的连续性抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。教师要注意引导学生搜集科培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。教师要注意引导学生搜集科学、可靠的证据，如科研论文、权威的官方报道等。学、可靠的证据，如科研论文、权威的官方报道等。
44、1在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？科研人员想出的延缓棉铃虫对科研人员想出的延缓棉铃虫对 Bt Bt 抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。可以分为以下几个方面。（1 1）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全性评价等。进行严格的安全性评价等。（2 2）基因策略基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性，包括在棉花中持久性，包括
45、在棉花中转入多个杀虫基因转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种 Bt Bt 基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的 Bt Bt 基因（如基因（如 Cry1Aa Cry1Aa 和和 Cry1Ac Cry1Ac 基因）同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以基因）同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的延缓害虫抗性的产生和发展，
46、还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。互补作用扩大抗虫范围。2科研工作者在发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？（3 3）田间策略田间策略。这是在种植时采取的措施，如。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮提供庇护所、与其他作物轮作或套种等作或套种等。例如，澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基因棉田。例如，澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基因棉田中，总面积的中，总面积的4%4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周
47、围种植周围种植 20%30%20%30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；在印度，一面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5 5 行或者行或者 20%20%面积的非转基因棉面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度（如将转基因抗虫棉与番茄、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度（如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高粱、玉米、辣椒等棉铃虫宿主作物混作），这些作物可以构
48、成向日葵、高粱、玉米、辣椒等棉铃虫宿主作物混作），这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。这样做的原理是天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种群群。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。至于迅速
49、增加。2科研工作者在发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？一、概念检测1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。（）（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。（）（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。()练习与应用（书本P83）一、概念检测2利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PC
50、R的叙述错误的是（）APCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶B变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶C复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸练习与应用（书本P83）D二、拓展应用研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。外外源源基基因因插插入入基基因因组组中中可可能能为为单单位位点点插插入入，或或者者同同一一染染色色体体多多位位点点插插入入，或或者者不不同同染染