《【生物】基因工程的基本操作程序课件-2023-2024学年高二下人教版（2019）选择性必修3.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《【生物】基因工程的基本操作程序课件-2023-2024学年高二下人教版（2019）选择性必修3.pptx（44页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、3.2基基因因工工程程的的基基本本操操作作程程序序目目 录录/CONTENTS第一步：目的第一步：目的基因的筛选与基因的筛选与获取获取01第二步：第二步：基因基因表达载体的构表达载体的构建建02第三步：将目第三步：将目的基因导入受的基因导入受体细胞体细胞03第四步：目的第四步：目的基因的检测与基因的检测与鉴定鉴定0401课课堂堂导导入入转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡，左）与非转基因抗虫棉（右）科学家将科学家将苏云金杆菌的苏云金杆菌的“杀虫基因杀虫基因”BtBt抗虫蛋白抗虫蛋白基因基因转到棉花里，转到棉花里，让让棉花也能产生棉花也能产生BtBt抗虫蛋白抗虫蛋白（苏云金杆菌苏云金杆菌伴胞晶体蛋白伴胞晶
2、体蛋白）破坏鳞翅目破坏鳞翅目昆虫的昆虫的消化系统消化系统来杀死棉铃虫。来杀死棉铃虫。1997 1997年，我国政府首次批准商业化种植年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉转基因抗虫棉。到。到20152015年，我国年，我国已育成转基因抗虫棉新品种已育成转基因抗虫棉新品种100100多个，减少农药用量多个，减少农药用量4040万吨，增收节支社会万吨，增收节支社会经济效益经济效益450450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植的过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其植的过
3、程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。棉铃虫可以使棉花产量中以棉铃虫最为常见。棉铃虫可以使棉花产量减少三分之一，严重时，甚至能使一片棉田绝减少三分之一，严重时，甚至能使一片棉田绝收。大量施用农药杀虫，不仅会提高生产成本，收。大量施用农药杀虫，不仅会提高生产成本，还可能造成农产品和环境的污染。还可能造成农产品和环境的污染。课课堂堂导导入入01苏云金杆菌与载体拼接普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞提取导入重组DNA分子1.1.目的基因的目的基因的筛选与获取筛选与获取2.2.基因表达基因表达载体的构建载体的构建3.3.将目的基因将目的基因导入受体细胞导入受体细胞4.4.目的基因的目的基因
4、的 检测与鉴定检测与鉴定(含抗虫基因）（含有并表达抗虫基因）第一步：目的基因第一步：目的基因的筛选与获取的筛选与获取Part 0101第第一一步步：目目的的基基因因的的筛筛选选与与获获取取用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，用于防治棉花虫害已有多年历史用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，用于防治棉花虫害已有多年历史苏云金杆苏云金杆菌的杀虫菌的杀虫作用与作用与Bt基因有关基因有关掌握了掌握了Bt基因的序列信息基因的序列信息Bt基因是培基因是培育转基因育转基因抗虫棉较抗虫棉较为合适的为合适的目的基因目的基因 从相关从相关已知结构和功能清晰的基因已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。中进行筛选
5、是较为有效的方法之一。Bt蛋白分解为多肽后，与害虫肠上皮细胞的特异性受蛋白分解为多肽后，与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，造成害虫死亡。体结合，导致细胞膜穿孔，造成害虫死亡。Bt蛋蛋白白只只有有在在某某类类昆昆虫虫肠肠道道的的碱碱性性环环境境中中才才表表现现出出毒毒性性，人人和和牲牲畜畜的的胃胃液液呈呈酸酸性性，肠肠道道细细胞胞也也没没有有特特异异性性受体。受体。用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要指编码蛋白质的基因。主要指编码蛋白质的基因。目的基因目的基因01第第一一步步：目目的的基基因因的的筛筛选选与与获获取取
6、筛选目的基因最有效的方法之一是从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。筛选目的基因最有效的方法之一是从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。随着测序技术的发展，以及序列数据库（随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。了更多的机会和可能。苏云金杆菌的杀虫作用于苏云金杆菌的杀虫作用于BtBt基因有关基因有关掌握了掌握了BtBt基因的序列信息基因的序列信息对对BtBt基
7、因的表达产物基因的表达产物-Bt-Bt抗虫蛋白抗虫蛋白有较为深入的了解有较为深入的了解苏云金杆菌制剂可防治棉花虫害苏云金杆菌制剂可防治棉花虫害BtBt基因是培育转基因基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目抗虫棉较为合适的目的基因的基因实例：01第第一一步步：目目的的基基因因的的筛筛选选与与获获取取获取目的基因的方法：获取目的基因的方法：从从基因文库基因文库中获取中获取人工合成人工合成利用利用PCR获取获取和和扩增扩增目的基因目的基因前提前提：方法：方法：基因比较小、核苷酸序列已知基因比较小、核苷酸序列已知通过通过DNA合成仪合成仪用用化学方法化学方法直接合成直接合成基因组文库（某生物基因组文库（某
8、生物全部全部基因）基因）部分部分基因文库（主要是基因文库（主要是）01DNA的的复复制制解旋酶解旋酶DNA聚合酶聚合酶母链母链(模板链模板链)子链子链(新合成的链新合成的链)四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸33535535(2)条件条件:4种游离的脱氧核苷酸种游离的脱氧核苷酸DNA的两条链的两条链DNA解旋酶、解旋酶、DNA聚合酶等聚合酶等ATP(3)复制原则复制原则:碱基互补配对原则（碱基互补配对原则（A与与T、C与与G配对保证复制的准确进行）配对保证复制的准确进行）能量：能量：模板：模板：原料：原料：酶：酶：半保留复制、边解旋边复制半保留复制、边解旋边复制(1)特点特点:01CCGTAGTAT
9、ACGGCTAGCCGTATA CGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA35A CGCAAGCTAGTCATTAT A TGC A TGA T CGAGC T TA CGCAAGCTAGTCATTADNA聚聚合合酶酶53T A T GC A T GA TCGAGCT T53ATP只能从只能从5端端3端端延伸，细胞内有延伸，细胞内有RNA引物结合到模板引物结合到模板3端端引发子链的延伸引发子链的延伸5端到端到3端端ATPDNA的的复复制制01利利 用用PCR获获取取和和扩扩增增目目的的基基因因1.原理：原理：DNA半保留复制半保留复制2.条件：条件：模板（目的基因）、模板
10、（目的基因）、2种引物、种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、聚合酶、缓冲溶液（含缓冲溶液（含Mg2+)3.过程：过程：耐高温的耐高温的DNA聚合酶聚合酶(Taq酶）酶）4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸（dNTP）引物引物待扩增的待扩增的DNA片段片段（模板）（模板）55变性变性复性复性延伸延伸温度上升到温度上升到90以上以上，双链，双链DNA解聚解聚为单链为单链当温度下降到当温度下降到50左右左右时，两种引物时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链通过碱基互补配对与两条单链DNA结结合。合。温度上升到温度上升到72左右左右时，溶液中的时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的
11、种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶聚合酶的作用下合成新的的作用下合成新的DNA链。链。01利利 用用PCR获获取取和和扩扩增增目目的的基基因因DNA解链为单链解链为单链引物结合到互补引物结合到互补DNA链链Taq酶从引物起始酶从引物起始进行进行子子链的合成链的合成PCR过程可以在过程可以在PCR扩扩增仪增仪(PCR仪仪)中自动完成。中自动完成。01利利 用用PCR获获取取和和扩扩增增目目的的基基因因第第1步：变性步：变性当温度超过当温度超过90时，时，双链双链DNA解旋为单链。解旋为单链。53355335预变性预变性90 以上以上增加大分子模板增加大分子模板DNA彻底变性的概率彻底变性的概率长
12、度相同但长度相同但CG含量高的含量高的DNA需要设定的变性温度较高。需要设定的变性温度较高。01利利 用用PCR获获取取和和扩扩增增目目的的基基因因当温度下降到50左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。5 53 33 35 5第2步：复性3 35 501利利 用用PCR获获取取和和扩扩增增目目的的基基因因当温度上升到当温度上升到72左右时，溶液中的左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在种脱氧核苷酸在耐高温的耐高温的DNA聚合酶聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的合成新的DNA链。链。533553353553第第3步：延伸步：延伸01利利 用用PC
13、R获获取取和和扩扩增增目目的的基基因因第一轮循环的第一轮循环的产物产物作为第二轮反应作为第二轮反应模模板板，经过变性、复性和延伸三步产生，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。第二轮循环产物。533535533553355335533501利利 用用PCR获获取取和和扩扩增增目目的的基基因因第二轮循环的产物作为第三轮反应模第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。第三轮循环产物。533553355335533553355335533553355335533553355335每次循环后目的基因的量可以增加一倍，即形成每次
14、循环后目的基因的量可以增加一倍，即形成指数式扩增指数式扩增(2n)。01利利 用用PCR获获取取和和扩扩增增目目的的基基因因项目项目PCR技术技术体内体内DNA复制复制不不同同点点场所场所解旋方式解旋方式酶酶引物引物特点特点ATP温度条件温度条件结果结果细胞外细胞外（主要在（主要在PCR仪内）仪内）细胞内（主要在细胞核内）细胞内（主要在细胞核内）耐高温的耐高温的DNA聚合酶聚合酶解旋酶催化解旋酶催化DNA在在高温下变性解旋高温下变性解旋解旋酶、解旋酶、DNA聚合酶聚合酶小段小段RNA或单链或单链DNA分子分子一小段一小段RNA体外迅速扩增体外迅速扩增生物体内边解旋边复制生物体内边解旋边复制不需
15、要不需要需要需要在较高温度下进行在较高温度下进行细胞内温和的条件细胞内温和的条件短时间形成大量短时间形成大量DNA片段片段形成完整的形成完整的DNA分子分子第二步：基因表达第二步：基因表达载体的构建载体的构建Part 0202第第二二步步：基基因因表表达达载载体体的的构构建建1.基因表达载体的目的基因表达载体的目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。在受体细胞中表达和发挥作用。2.基因表达载体的组成基因表达载体的组成目的基因启动子终止子标记基因目的基因启动子
16、终止子标记基因+复制原点复制原点（1）启动子：）启动子：（2）终止子：）终止子：（3）标记基因：）标记基因：（4）复制原点：）复制原点：一段有特殊一段有特殊序列序列结构的结构的DNA片段；片段；本质：本质：位置：位置：位于基因的上游，紧挨转录的起始位点；位于基因的上游，紧挨转录的起始位点；功能：功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。一段有特殊一段有特殊序列序列结构的结构的DNA片段；片段；本质：本质：位置：位置：位于基因的下游；位于基因的下游；功能：功能：使转录在所需要的地方停下来使转录在所需要的地方停下来作用：作用：便于重组便于重组
17、DNA分子的筛选分子的筛选DNA复制开始的地方，复制开始的地方，使能完成自主复制使能完成自主复制02第第二二步步：基基因因表表达达载载体体的的构构建建 用一定的限制酶切割用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口载体，使其出现一个切口。用用同种同种限制酶或能产生限制酶或能产生相同末端相同末端的限制酶切割含的限制酶切割含有有目的目的基因的基因的DNA片段。片段。将切下的将切下的Bt基因片段拼基因片段拼接到载体的切口处，再加接到载体的切口处，再加入适量入适量DNA连接酶，形成连接酶，形成了一个了一个重组重组DNA分子分子。载体载体基因表达载体基因表达载体第三步：将目的基第三步：将目的基因导入受体细胞
18、因导入受体细胞Part 03第第三三步步：将将目目的的基基因因导导入入受受体体细细胞胞03导入导入植物细胞植物细胞导入导入动物细胞动物细胞导导入入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法（双子叶双子叶植物和植物和裸子裸子植物植物常用）常用）基因枪法（基因枪法（单子叶单子叶植物常用）植物常用）花粉管通道法花粉管通道法2.将目的基因将目的基因导入导入受体细胞的受体细胞的方法方法显微注射法显微注射法 Ca2+转化法转化法（我国我国科学家科学家独创独创）1.转化转化的概念：的概念：目的基因进入目的基因进入_内，并且在受体细胞内内，并且在受体细胞内_ 和和_ 的过程。的过程。受体细胞受体细胞维持稳定
19、维持稳定表达表达（受精卵）（受精卵）（原核生物）（原核生物）第第三三步步：将将目目的的基基因因导导入入受受体体细细胞胞03（2）农杆菌转化法农杆菌转化法转化转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程体细胞内维持稳定和表达的过程。特点：特点：a.能在自然条能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力植物没有侵染能力。b.农杆菌细胞内含有农杆菌细胞内含有Ti质粒质粒，当它侵染植物细胞后，能将，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒质粒上的上的TDNA（可转移的（可转移的DNA
20、）转移转移到被侵染的细胞，并且将其到被侵染的细胞，并且将其整合到该整合到该细胞的染色体细胞的染色体DNA上上。此处此处“转化转化”与肺炎链球菌转化实验中的与肺炎链球菌转化实验中的“转化转化”含义相同，含义相同，实质都是基因重组实质都是基因重组。1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞第第三三步步：将将目目的的基基因因导导入入受受体体细细胞胞03导入导入1.将目的基因导入将目的基因导入植物植物细胞细胞（2）农杆菌转化法农杆菌转化法过程：过程：两次拼接两次拼接和和两次导入两次导入a.两次拼接：两次拼接：第一次拼接是将第一次拼接是将目的基因目的基因拼接拼接到到Ti质粒质粒的的 上；上；第二次
21、拼接（非人工操作）指被第二次拼接（非人工操作）指被插入目的基插入目的基因的因的TDNA拼接拼接到受体细胞到受体细胞 上。上。b.两次导入：两次导入：第一次导入是将第一次导入是将含目的基因的重组含目的基因的重组Ti质粒质粒导入导入 ；第二次导入（非人工操作）是指含目的基因第二次导入（非人工操作）是指含目的基因的的 导入导入受体细胞受体细胞。TDNA染色体染色体DNATDNA农杆菌农杆菌第第三三步步：将将目目的的基基因因导导入入受受体体细细胞胞032.将目的基因导入动物细胞（1）导入方法：（2）受体细胞:显微注射法受精卵原因：原因：体积大，易操作；体积大，易操作；易表现出全能性。易表现出全能性。（
22、3）过程：构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物第第三三步步：将将目目的的基基因因导导入入受受体体细细胞胞033.将目的基因导入将目的基因导入微生物微生物细胞细胞（1）常用方法：）常用方法：Ca2+处理处理原核细胞（常选择大肠杆菌）原核细胞（常选择大肠杆菌）可使细胞处于一种可使细胞处于一种能吸收周围环境中能吸收周围环境中DNA分子分子的生理状态。的生理状态。（3）过程：）过程：（目的？）（目的？）（2）受体细胞：）受体细胞：繁殖繁殖快快，多多为单细胞，遗传物质相对较为单细胞，遗传物质相对较少少，易易于培养。于培养。Ca2+处理
23、处理细胞细胞感受态感受态细胞细胞表达载体与感表达载体与感受态细胞混合受态细胞混合感受态细胞吸感受态细胞吸收重组收重组DNA增加细胞壁增加细胞壁的通透性的通透性一般利用温一般利用温度变化导入度变化导入第四步：目的基因第四步：目的基因的检测与鉴定的检测与鉴定Part 04第第四四步步：目目的的基基因因的的检检测测与与鉴鉴定定04目的基因进入受体细胞后目的基因进入受体细胞后，是否，是否稳定维持稳定维持和和表达其遗传特性表达其遗传特性，只有通过检，只有通过检测与鉴定才能知道。测与鉴定才能知道。1.检测与鉴定的方法检测与鉴定的方法分子水平的检测分子水平的检测个体水平的鉴定个体水平的鉴定第第四四步步：目目
24、的的基基因因的的检检测测与与鉴鉴定定04（1）分子水平的检测）分子水平的检测电泳检测法电泳检测法方法方法2：可以以质粒为模板进行可以以质粒为模板进行PCR扩增扩增，之后，之后再再进行进行电泳检测电泳检测。设计设计PCR的的一对引物一对引物时，最好时，最好一个引物与质粒一个引物与质粒DNA互补结合互补结合，另一个引物与目另一个引物与目的基因的基因DNA互补结合互补结合，这样只有以，这样只有以重组重组DNA为模板为模板才能才能获得获得扩增扩增产物产物（也可以（也可以都都跟目的基因互补结合跟目的基因互补结合，这样只有，这样只有含有目的基因含有目的基因，才能才能获得扩增产物），之后获得扩增产物），之后
25、再进行电泳检测；再进行电泳检测；方法方法1：体细胞中的质粒体细胞中的质粒直接直接进行进行电泳检测电泳检测或者选择合适的或者选择合适的限制酶限制酶对质粒进行对质粒进行酶酶切后再进行电泳检测切后再进行电泳检测，同时可借助指示分子大小的标准参照物来进一步确认目，同时可借助指示分子大小的标准参照物来进一步确认目的基因。的基因。方法方法3：提取提取受体细胞的受体细胞的mRNA，进行，进行逆转录逆转录，获得，获得cDNA，用上述，用上述方法方法2进行进行PCR扩增扩增，之后再进行电泳检测；，之后再进行电泳检测；第第四四步步：目目的的基基因因的的检检测测与与鉴鉴定定04（1）分子水平的检测）分子水平的检测核
26、酸杂交检测法（原理）核酸杂交检测法（原理）在含有在含有目的基因的目的基因的DNA片段片段上用上用放射性同位素放射性同位素等等作标记作标记，以此作为，以此作为探针探针，使探针与使探针与基因组基因组DNA或或mRNA杂交（遵循碱基互补配对原则）杂交（遵循碱基互补配对原则），若，若出现杂交带出现杂交带，则目的基因插，则目的基因插入成功或转录出入成功或转录出mRNA。第第四四步步：目目的的基基因因的的检检测测与与鉴鉴定定04（1）分子水平的检测）分子水平的检测抗原抗原抗体杂交技术抗体杂交技术在抗原在抗原抗体杂交中，目的蛋白是作为抗原还是抗体？抗体杂交中，目的蛋白是作为抗原还是抗体？从转基因棉花中提取从
27、转基因棉花中提取蛋白质，用相应的蛋白质，用相应的抗抗体体进行抗原进行抗原抗体杂交，抗体杂交，若若出现杂交带出现杂交带，则目，则目的基因成功翻译出蛋的基因成功翻译出蛋白质。白质。抗原抗原苏云金芽孢苏云金芽孢杆菌杆菌提取提取Bt毒蛋白毒蛋白注射小鼠体内注射小鼠体内抗体抗体标记抗体标记抗体提取蛋白提取蛋白电泳分离电泳分离抗原抗原抗体抗体杂交杂交脱分化脱分化第第四四步步：目目的的基基因因的的检检测测与与鉴鉴定定04（2）个体水平的检测）个体水平的检测转基因生物转基因生物检测方法检测方法观察目标观察目标抗虫植物抗虫植物害虫吞食害虫吞食害虫是否死亡害虫是否死亡抗病植物抗病植物病毒病毒(菌菌)感染感染是否出
28、现病斑是否出现病斑抗盐植物抗盐植物盐水浇灌盐水浇灌是否正常生长是否正常生长抗除草剂植物抗除草剂植物喷洒除草剂喷洒除草剂是否正常生长是否正常生长获取目的基因产物的转获取目的基因产物的转基因生物基因生物提取细胞产物，与天然提取细胞产物，与天然产品进行功能活性比较产品进行功能活性比较细胞产物的功能活性是细胞产物的功能活性是否正常否正常DNA片段的扩增与片段的扩增与电泳鉴定电泳鉴定Part 05DNA片片段段的的扩扩增增与与电电泳泳鉴鉴定定051.DNA体外扩增（体外扩增（PCR）的原理的原理uPCR利用了利用了DNA热变性热变性原理，通过原理，通过调节温度调节温度来控制来控制DNA双链的双链的 与与
29、 。uPCR仪实质上就是一台能够仪实质上就是一台能够自动调控温度自动调控温度的仪器，一次的仪器，一次PCR一般要经历一般要经历30次循环次循环。PCR 的产物一般通过的产物一般通过 来鉴定。来鉴定。2.DNA片段片段电泳鉴定电泳鉴定的原理的原理uDNA分子具有可解离的基团，在一定的分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动，这个的电极移动，这个过程就是过程就是电泳电泳。u在凝胶中在凝胶中DNA分子的分子的迁移速率迁移速率与与 等
30、有关。等有关。u凝胶中的凝胶中的DNA分子通过分子通过染色染色，可以在波长为，可以在波长为300nm的的 下被检测出来。下被检测出来。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳相反相反解聚解聚结合结合凝胶的浓度、凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像分子的大小和构像紫外灯紫外灯DNA片片段段的的扩扩增增与与电电泳泳鉴鉴定定05用用微量移液器微量移液器按照按照PCR反应体系配方或反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在试剂盒的说明书，在微微量离心管量离心管中依次加入各组分。中依次加入各组分。待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心
31、约机里，离心约10s，使，使 。参照下表的参数，设置好参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入离心管放入PCR仪仪中进行反应。中进行反应。循环程序循环程序变性变性复性复性延伸延伸预变性预变性940C，5min30 次次 940C,30s550C,30s720C，1min最后一次最后一次940C，1min550C,30s720C，1min移液移液离心离心扩增扩增反应液集中在离心管的底部反应液集中在离心管的底部使使DNA充分变性，以利于充分变性，以利于引物更好地与模板结合引物更好地与模板结合DNA片片段段的的扩扩增增与与电电泳泳鉴鉴定定
32、05制备制备凝胶凝胶融化融化倒模倒模凝固凝固用电泳缓冲液用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比，一般配制质量体积比0.8%0.8%1.2%1.2%的琼脂的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化熔化。稍。稍冷却后冷却后，加入加入适量适量的的核酸染料核酸染料混匀。混匀。将温热的琼脂糖溶液迅速将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具倒入模具，并，并插入插入合适大小的合适大小的梳子梳子，以形成，以形成加加样孔样孔。待凝胶溶液完全待凝胶溶液完全凝固凝固，小心，小心拔出梳子拔出梳子，取出凝胶，取出凝胶放入电泳槽内放入电泳槽内。进行进行电泳电泳加液加
33、液加样加样电泳电泳将将电泳缓冲液加入电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶过凝胶1mm1mm为宜。为宜。将扩增得到的将扩增得到的PCRPCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微，再用微量移液器将混合液缓慢量移液器将混合液缓慢注入注入凝胶的凝胶的加样孔加样孔内。留一个加样孔内。留一个加样孔加入加入指示指示分子大小的分子大小的标准参照物标准参照物。接通电源，接通电源，根据根据电泳槽阳极至阴极之间的电泳槽阳极至阴极之间的距离距离来来设定电压设定电压，一般为，一般为1 15V/cm5V/cm。待。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘指示
34、剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳时，停止电泳观察观察鉴定鉴定取出凝胶置于取出凝胶置于紫外灯紫外灯下观察和照相。下观察和照相。DNA片片段段的的扩扩增增与与电电泳泳鉴鉴定定05 注意：注意：1.为为避免外源避免外源DNA等因素的污染等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份缓冲液和酶应分装成小份，并，并在在20储存储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，
35、放在冰块上缓慢融化缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要在进行操作时，一定要戴好一次性手套。戴好一次性手套。5.PCR扩增扩增不能随意加大不能随意加大试剂用量。试剂用量。习习 题题 练练 习习1.下列对下列对DNA连接酶的功能描述正确的是连接酶的功能描述正确的是()A.将碱基、脱氧核糖、磷酸连接起来将碱基、脱氧核糖、磷酸连接起来B.在基因工程中只作用于两个黏性末端在基因工程中只作用于两个黏性末端C.与与DNA聚合酶作用的部位相同，作用对象不同聚合
36、酶作用的部位相同，作用对象不同D.用于用于DNA复制时母链与子链间形成氢键复制时母链与子链间形成氢键答案：答案：C解析：解析：DNA连接酶的作用是在相邻两个核苷酸的磷酸和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键，连接酶的作用是在相邻两个核苷酸的磷酸和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键，A、D错误；错误；DNA连连接酶在基因工程中作用于两个黏性末端或两个平末端，接酶在基因工程中作用于两个黏性末端或两个平末端，B错误；错误；DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶作用的部位相同，聚合酶作用的部位相同，均在磷酸和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键，作用对象不同，均在磷酸和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键，作用对象不同，DNA连接酶作用于连接
37、酶作用于DNA片段，片段，DNA聚合酶作用聚合酶作用于单个游离的脱氧核苷酸，于单个游离的脱氧核苷酸，C正确。正确。06习习 题题 练练 习习1.下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达()A.在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因B.通过通过PCR等技术检测受体细胞的等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因分子上是否含有目的基因C.提取受体细胞合成的相应蛋白质提取受体细胞合成的相应蛋白质,利用抗原一抗体杂交技术进行检测利用抗原一抗体杂交技术进行检测D.抗虫基因导入植物细胞后
38、，检测植物是否具有抗虫特性抗虫基因导入植物细胞后，检测植物是否具有抗虫特性答案：答案：A解析：解析：检测目的基因是否成功导入或表达的方法有多种。检测目的基因是否成功导入或表达的方法有多种。分子水平上的检测：通过分子水平上的检测：通过PCR等技术检测转基等技术检测转基因生物的因生物的DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；检测目的基因是否翻译成蛋白质；检测目的基因是否翻译成蛋白质用抗原一抗体杂交技术。用抗原一抗体杂交技术。个体生物学水平的鉴定；检测生物个体是否具有抗性及抗性程度；检测基因工程个体生物学水平的鉴定；检测生物个体是否
39、具有抗性及抗性程度；检测基因工程产品与天然产品的活性是否相同等。在显微镜下无法观察到受体细胞中是否含有目的基因，故选产品与天然产品的活性是否相同等。在显微镜下无法观察到受体细胞中是否含有目的基因，故选A。06习习 题题 练练 习习2.下列关于目的基因导入受体细胞的相关叙述错误的是下列关于目的基因导入受体细胞的相关叙述错误的是()A.目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化B.可以用可以用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使其能吸收周围环境中的处理大肠杆菌细胞，使其能吸收周围环境中的DNA分子，有利于重分子，有利
40、于重组的基因表达载体导入其中组的基因表达载体导入其中C.可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊使目的基因借助花粉管通道进入胚囊D.将目的基因导入动物细胞常用的方法是农杆菌转化法将目的基因导入动物细胞常用的方法是农杆菌转化法06答案：答案：D解析：解析：基因工程中的转化是指目的基因进入受体细胞并在受体细胞中维持稳定和表达的过程，基因工程中的转化是指目的基因进入受体细胞并在受体细胞中维持稳定和表达的过程，A正确；可以正确；可以用用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使它处于一种能吸
41、收周围环境中处理大肠杆菌细胞，使它处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，有利于重组的基因表达载分子的生理状态，有利于重组的基因表达载体导入其中，体导入其中，B正确；花粉管通道法是用微量注射器将含目的基因的正确；花粉管通道法是用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注射入子房中，也可以在溶液直接注射入子房中，也可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊，溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊，C正确；将目的基因导入动物细胞常采用显微注射法，将目的基因导入植物细胞常采用的是农杆菌
42、转化法，正确；将目的基因导入动物细胞常采用显微注射法，将目的基因导入植物细胞常采用的是农杆菌转化法，D错误。错误。习习 题题 练练 习习3.基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，是成功的关键，下列相关说法不基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，是成功的关键，下列相关说法不正确的是正确的是()A.构建基因表达载体的目的包括使目的基因在受体细胞中能稳定存在且遗传给下构建基因表达载体的目的包括使目的基因在受体细胞中能稳定存在且遗传给下一代一代B.基因工程中使用的标记基因有许多种，有的标记基因是质粒上固有的基因工程中使用的标记基因有许多种，有的标记基因是质粒上固有的C.一个基因表达载体一般包括目的
43、基因、标记基因、起始密码和终止密码等结构一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、起始密码和终止密码等结构D.基因表达载体中的复制原点是质粒基因表达载体中的复制原点是质粒DNA的复制的起点的复制的起点答案：答案：C解析：解析：基因表达载体的构建的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使基因表达载体的构建的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用，目的基因能够表达和发挥作用，A正确；质粒上的标记基因有的是固有的，也可以是人为加上去的，正确；质粒上的标记基因有的是固有的，也可以是人为加上去的，B正确；正确；一个基因
44、表达载体一般包括目的基因、标记基因、启动子和终止子等结构，一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、启动子和终止子等结构，C错误；复制原点是错误；复制原点是DNA复制的复制的起点，起点，D正确。正确。06习习 题题 练练 习习4.几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化其水解。将几丁质酶基几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化其水解。将几丁质酶基因转入菊花体内，可增强其抗真菌病的能力。下列有关叙述错误的是因转入菊花体内，可增强其抗真菌病的能力。下列有关叙述错误的是()A.将几丁质酶基因插入将几丁质酶基因插入Ti质粒的质粒的TDNA上构建表达载体上构建表达载体B.可通过显微注
45、射法将农杆菌导入菊花受体细胞可通过显微注射法将农杆菌导入菊花受体细胞C.可用可用PCR技术或技术或DNA分子杂交检测目的基因是否成功导入分子杂交检测目的基因是否成功导入D.可用真菌接种实验检测转基因菊花对真菌的抗性程度可用真菌接种实验检测转基因菊花对真菌的抗性程度答案：答案：B解析：解析：A、Ti质粒的质粒的TDNA可以转移到受体细胞中，并且整合到受体细胞染色体的可以转移到受体细胞中，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，根据这一特点，上，根据这一特点，构建表达载体时，应该将几丁质酶基因插入到构建表达载体时，应该将几丁质酶基因插入到T质粒的质粒的TDNA上，上，A正确；正确；B、将目的基因导入动
46、物细胞常用、将目的基因导入动物细胞常用显微注射法，而将目的基因导入到植物细胞常用农杆菌转化法，显微注射法，而将目的基因导入到植物细胞常用农杆菌转化法，B错误；错误；C、可用、可用PCR技术或技术或DNA分子杂交分子杂交检测目的基因是否成功导入，检测目的基因是否成功导入，C正确；正确；D、几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，可用真菌接种实验检测转、几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，可用真菌接种实验检测转基因菊花对真菌的抗性程度，基因菊花对真菌的抗性程度，D正确。故选：正确。故选：B。06课课 堂堂 总总 结结071.目的基因的筛选和获取目的基因的筛选和获取前提前提u利用利用PCR获取和扩增获取和扩
47、增u化学方法人工合成化学方法人工合成2.构建基因表达载体构建基因表达载体核心核心u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞关键关键u农杆菌转化法农杆菌转化法(植物植物)、显微注射法、显微注射法(动物动物)、感受态细胞转化法感受态细胞转化法(微生物微生物);4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定保证保证u分子检测：是否插入、转录、翻译分子检测：是否插入、转录、翻译u个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。有了目的基因，我们才能赋予一种有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。并可进行遗传、表达和发挥作用。载体进入受体细胞稳定表达，才能载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。细胞中稳定遗传和正确表达。