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1、第二节第二节 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序苏云金杆菌苏云金杆菌与载体拼接与载体拼接 普通棉花普通棉花（无抗虫特性）（无抗虫特性）棉花细胞棉花细胞抗虫棉抗虫棉提取提取表达表达BtBt基因基因导入导入BtBt基因基因重组重组DNA分子分子培育转基因抗虫棉的简要过程培育转基因抗虫棉的简要过程问题探讨1.1.目的基因的目的基因的筛选与获取筛选与获取2.2.基因表达载基因表达载体的构建体的构建目的基因目的基因受体细胞受体细胞3.3.将目的基因将目的基因导入受体细胞导入受体细胞4.4.目的基因的目的基因的检测与鉴定检测与鉴定第一步：目的基因的第一步：目的基因的筛选与与获取取什么是基因什么是
2、基因?基因通常是有基因通常是有遗传效效应的的DNA片段片段基因定基因定义：基因片段基因片段非基因片段非基因片段u原核生物的基因结构原核生物的基因结构非非编码区区非非编码区区编码区区编码区上游：区上游：启启动子子编码蛋白蛋白质，连续不不间断断编码区下游：区下游：终止子止子u真核生物的基因结构真核生物的基因结构非非编码区区编码区区非非编码区区外外显子：子：编码蛋白蛋白质内含子：不内含子：不编码蛋白蛋白质初初级转录产物物成熟成熟mRNA剪接剪接mRNA逆逆转录cDNA无剪接无剪接过程程第一步：目的基因的第一步：目的基因的筛选与与获取取一、目的基因一、目的基因（1）概念：用于改变受体细胞性状或获得预期
3、表达产物等的基因；与生物抗逆性、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的与生物抗逆性、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。（基因。（Bt抗虫蛋白基因抗虫蛋白基因）。）。主要是主要是编码特定蛋白质编码特定蛋白质的基因的基因（2）实例：如何如何筛选目的基因目的基因?用苏云金杆菌制成的用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂生物杀虫剂，广泛用于防治，广泛用于防治棉花虫害已有多年历史棉花虫害已有多年历史苏云金杆菌苏云金杆菌的杀虫作用的杀虫作用与与Bt基因基因有有关关掌握了掌握了Bt基因的序列信息基因的序列信息对对Bt基因的表达产物基因的表达产物-对对Bt抗虫蛋白抗虫蛋白有了较为深入的了解有了较为深入的了解Bt基
4、因基因是培育转是培育转基因抗虫棉较为基因抗虫棉较为合适的目的基因合适的目的基因二、二、筛选合适的目的基因合适的目的基因第一步：目的基因的第一步：目的基因的筛选与与获取取l方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。二、二、筛选合适的目的基因合适的目的基因DNADNA测序仪测序仪核苷酸序列比对核苷酸序列比对氨基酸序列比对氨基酸序列比对美国国家生物信息中心美国国家生物信息中心第一步：目的基因的第一步：目的基因的筛选与与获取取 随着随着测序技术测序技术的发展，以及序列数据库（如的发展，以及序列数据库（如GenBankGenBank）、序列）、序列比比对工具（如对工具（如BLASTBLAST）等的应
5、用，）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为科学家找到合适的，为科学家找到合适的目的基因提供更多机会和可能。目的基因提供更多机会和可能。目的基因如何目的基因如何获取取?第一步：目的基因的第一步：目的基因的筛选与与获取取三、目的基因的三、目的基因的获取取u方法：1.人工合成2.PCR获取和扩增目的基因3.构建基因文库（p82）基因组文库cDNA文库基因文库基因文库：把某种生物基因DNA通过酶切获得大量DNA片段，然后将这些片段与载体连接，再转入受体菌中，这样整个菌群克隆就包含该生物的全部基因片段，称为基因文库。PCR技术第一步：目的基因的第一步：目
6、的基因的筛选与与获取取 聚合酶链式反应聚合酶链式反应，根据根据DNADNA半保留复制半保留复制的原理的原理，在，在体外（体外（PCRPCR扩增仪扩增仪）提供参与提供参与DNADNA复制的复制的各种组分各种组分与与反应条件反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制大量复制的的技术。技术。u概念概念：体外模拟DNA复制，实现快速扩增DNAPCRPCR扩增仪扩增仪第一步：目的基因的第一步：目的基因的筛选与与获取取uDNA复制所需的基本条件：复制所需的基本条件：参与参与组分分在在DNA复制中的作用复制中的作用解旋解旋酶（体外用高温代替）（体外用高温代替）DNA母母链4种脱
7、氧核苷酸种脱氧核苷酸DNA聚合聚合酶引物引物提供提供DNA复制的复制的模板模板打开打开DNA双双链使使DNA聚合聚合酶能能够从引物的从引物的3端端开始开始连接脱氧核苷酸接脱氧核苷酸合成合成DNA子子链的的原料原料催化合成催化合成DNA子子链DNA聚合聚合酶不能直接不能直接发起子起子链的的合成，只能催化合成，只能催化单个核苷酸加到个核苷酸加到3端而延伸子端而延伸子链什么是引物？什么是引物？第一步：目的基因的第一步：目的基因的筛选与与获取取uPCR反反应体系中有哪些必需的物体系中有哪些必需的物质：DNA模板模板2种种引物引物原料：原料：耐高温耐高温的的DNA聚合聚合酶Mg+：激活激活DNA聚合聚合
8、酶有两条模板有两条模板链四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸uPCR扩增的增的过程程：1.目的基因目的基因DNA受受热变性性后解后解为单链（解旋）（解旋）变性性2.引物与引物与单链相相应互互补序列序列结合合3.以以单链DNA为模板，在模板，在DNA聚合聚合酶的作用下的作用下延伸延伸，即将四种脱氧，即将四种脱氧核苷酸加到引物的核苷酸加到引物的3端端。复性复性延伸延伸uPCR反反应过程示意程示意图：第一轮循环：（每次循环分为第一轮循环：（每次循环分为变性变性、复性、和延伸三步。）、复性、和延伸三步。）变性：解旋变性：解旋uPCR反反应过程示意程示意图：第一轮循环：（每次循环分为变性、第一轮循环：（每次循环
9、分为变性、复性复性、和延伸三步。）、和延伸三步。）复性的复性的过程只有程只有引物与引物与DNA模板模板链结合合吗？不不一一定定，也也存存在在解解开开的的两两条条DNA单单链链的的结结合合，原原因因：引引物物较较短短，更更容容易易结结合合；引引物物量量多多，引引物物与与模模板板的的碰撞结合机会更高。碰撞结合机会更高。引物结合概率更高。引物结合概率更高。uPCR反反应过程示意程示意图：第一轮循环：（每次循环分为变性、复性、和第一轮循环：（每次循环分为变性、复性、和延伸延伸三步。）三步。）子链延伸方向从子链延伸方向从5端到端到3端端第一第一轮循循环的的产物作物作为第二第二轮反反应的模板，的模板，经过
10、变性、复性和延伸性、复性和延伸三步三步产生第二生第二轮循循环的的产物。物。第二第二轮循循环的的产物作物作为第第三三轮反反应的模板，的模板，经过变性、复性和延伸性、复性和延伸三步三步产生生第三第三轮循循环的的产物。物。第二轮循环第二轮循环第第三三轮轮循循环环指数形式扩增：指数形式扩增：2n（n代表扩增循环代表扩增循环的次数）的次数）uPCR反反应过程示意程示意图：uPCR扩增形式增形式：PCR反应过程都在反应过程都在PCR扩增仪扩增仪中自动完成。中自动完成。uPCR反反应过程程：变性、复性和延伸性、复性和延伸常采用常采用琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳来鉴定来鉴定PCR的产物。的产物。如何判断如何判
11、断PCR扩增增是否成功？是否成功？一次成功的一次成功的PCR扩增应扩增应产生与预期大小一致的产生与预期大小一致的DNA片段片段。Marker旁栏思考旁栏思考用用PCR可以扩增可以扩增mRNA吗？吗？不能，不能，RNA不稳定，不能直接作为模板不稳定，不能直接作为模板，需要将，需要将mRNA逆转录为逆转录为cDNA（RT-PCR），然后再进行扩增。然后再进行扩增。mRNA逆转录酶逆转录酶杂交双链杂交双链DNA链链mRNA链链核酸酶核酸酶H单链单链DNADNA聚合酶聚合酶cDNA 一一般般不不可可以以，游游离离的的DNA片片段段容容易易被被分分解解，并并且且无无法法进进行行复复制，更不能遗传给下一代
12、制，更不能遗传给下一代。获得目的基因之后可以直接得目的基因之后可以直接导入受体入受体细胞胞吗？第二步：基因表达第二步：基因表达载体的构建体的构建（核心）（核心）一、基因表达一、基因表达载体的目的体的目的（1 1）使目的基因在受体细胞中）使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在，且，且可以遗传可以遗传给下一代；给下一代；（2 2）使目的基因能够使目的基因能够在受体细胞中在受体细胞中表达和发挥作用表达和发挥作用。二、基因表达二、基因表达载体的体的组成成位置：位置：功能：功能：RNA聚合酶聚合酶识别和结合识别和结合的部位，的部位，驱动基因转录驱动基因转录基因的上游基因的上游（一段有特殊（一段有特殊结构
13、的结构的DNA片段）片段）人们所需要的基因人们所需要的基因位置：位置：功能：功能：基因的下游（一段基因的下游（一段特殊的特殊的DNA片断）片断）终止转录终止转录便于重组便于重组DNA分子的分子的筛选和鉴定筛选和鉴定 三、基因表达三、基因表达载体的构建体的构建过程程基因表达载体构建模式图基因表达载体构建模式图产生相同末端生相同末端（同一种限制（同一种限制酶）培育抗虫棉的简要过程培育抗虫棉的简要过程只使用一种只使用一种DNADNA限制酶进行切割（限制酶进行切割（单酶切单酶切），会有那些连接情况？，会有那些连接情况？使用使用2种限制酶（种限制酶（双酶切双酶切）同时）同时对目的基因和质粒对目的基因和质
14、粒切割，防止自连环化和随意连接。切割，防止自连环化和随意连接。载体体目的基因目的基因自自连环化化片段片段间的的连接接目的基因自目的基因自连质粒自粒自连目的基因与目的基因与质粒粒连接接目的基因与目的基因目的基因与目的基因连接接质粒与粒与质粒粒连接接22正向正向连接接12212211思考反向反向连接接1方法方法植物细胞植物细胞农杆菌转化法（常用）农杆菌转化法（常用）花粉管通道法（我国独创）花粉管通道法（我国独创）显微注射法显微注射法(p82)Ca2+处理法处理法(p82)第三步：将目的基因第三步：将目的基因导入受体入受体细胞胞动物细胞动物细胞微生物细胞微生物细胞花粉管通道法花粉管通道法植物植物细胞
15、胞在植物授粉后一定时间内，在植物授粉后一定时间内，剪去柱剪去柱头头，将，将DNADNA溶溶液滴在花柱切面液滴在花柱切面，使目，使目的基因通过的基因通过花粉管通道花粉管通道进入胚囊。进入胚囊。用微量注射器将含用微量注射器将含目的基因目的基因的的DNADNA溶液直接注入溶液直接注入子房子房中；中；花粉管通道法导入外源花粉管通道法导入外源DNA第三步：将目的基因第三步：将目的基因导入受体入受体细胞胞农杆菌杆菌转化法示意化法示意图显微注射法微注射法动物物细胞胞目的基因的表达载体目的基因的表达载体显微注射显微注射到到受精卵受精卵中中受精卵发育受精卵发育获得具有新性状的动物获得具有新性状的动物显微注射技术
16、显微注射技术体积大，易操作体积大，易操作全能性高全能性高第三步：将目的基因第三步：将目的基因导入受体入受体细胞胞Ca2+处理法理法-原核原核细胞胞（1 1）使用）使用Ca2+处理：处理：可使细胞处于一种可使细胞处于一种能吸收周围环境中能吸收周围环境中DNA分子分子的生理状态。的生理状态。（2 2）过程）过程Ca2+处理细胞处理细胞感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态细胞吸感受态细胞吸收收DNA分子分子大肠杆菌细胞大肠杆菌细胞第三步：将目的基因第三步：将目的基因导入受体入受体细胞胞感受感受态繁殖繁殖快快，结构简单，结构简单大大肠杆菌（杆菌（p82）检测是否插
17、入检测是否插入目的基因目的基因 检测目的基因是否检测目的基因是否转录转录 检测目的基因是否检测目的基因是否翻译翻译基因表达的过程基因表达的过程 生物是否具有新性状生物是否具有新性状第四步：目的基因的第四步：目的基因的检测和和鉴定定分子水平的分子水平的检测 个体生物学水平的个体生物学水平的检测DNA蛋白质蛋白质mRNA性状性状 检测检测目的基因目的基因进进入受体入受体细细胞后，是否胞后，是否稳稳定定维维持持和和表达表达其其遗传遗传特性特性u目的：目的：u检测内容：检测内容：分子水平的分子水平的检测（1）基因是否插入(DNA)（2）目的基因是否转录(mRNA)方法：1.PCR技技术2.分子分子杂交
18、技交技术需逆转录为cDNA再进行PCR鉴定探针探针32P P变变性性性性变变性性性性碱基互补配对原则杂杂交交交交DNADNADNADNA分子分子分子分子（可（可检测检测）32P P目的目的DNA目的目的RNA（3）目的基因是否翻译方法:抗原抗原-抗体杂交技术抗体杂交技术 个体生物学水平的个体生物学水平的检测抗抗虫鉴定、抗病鉴定、抗逆鉴定虫鉴定、抗病鉴定、抗逆鉴定等等转基因生物转基因生物鉴定方法鉴定方法成功标志成功标志抗虫植物抗虫植物抗病毒植物抗病毒植物抗盐植物抗盐植物抗除草剂植物抗除草剂植物饲喂害虫饲喂害虫害虫死亡害虫死亡病毒感染（病毒接种实验）病毒感染（病毒接种实验）未出现病斑未出现病斑盐水
19、浇灌盐水浇灌正常生长正常生长喷洒除草剂喷洒除草剂正常生长正常生长第四步：目的基因的检测与鉴定第四步：目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序（基因工程的基本操作程序（4 4个步骤）个步骤）第一步：目的基因的筛选和获取第一步：目的基因的筛选和获取第二步：基因表达载体的构建第二步：基因表达载体的构建第三步：将目的基因导入受体细胞第三步：将目的基因导入受体细胞u利用利用PCR获取和扩增获取和扩增u人工合成；构建基因文库人工合成；构建基因文库u目的基因、标记基因、启动子、终止子目的基因、标记基因、启动子、终止子u农杆菌转化法农杆菌转化法(植物植物)、显微注射法、显微注射法(动物动物)、Ca2+处理法
20、处理法(微生物微生物)u分子检测：是否插入、转录、翻译分子检测：是否插入、转录、翻译u个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。-核心核心DNADNA片段的扩增及电泳鉴定片段的扩增及电泳鉴定1 1、DNADNA体外扩增的原理体外扩增的原理 PCR PCR利用了利用了DNADNA热变性热变性的原理，通过的原理，通过调节温度来控制调节温度来控制DNADNA双链的解聚与结合双链的解聚与结合 PCR PCR仪实质上就是一台能够仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器自动调控温度的仪器，一次，一次PCRPCR一般要经历一般要经历3030次循环次循环2 2、DNADNA片段
21、电泳鉴定的原理片段电泳鉴定的原理 DNADNA分子具有可解离的基团，在一定的分子具有可解离的基团，在一定的pHpH下，这些基团可以带上正电荷或负电下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动电荷相反的电极移动，这个过，这个过程就是程就是电泳电泳 在凝胶中在凝胶中DNADNA分子的迁移速率与分子的迁移速率与凝胶的浓度、凝胶的浓度、DNADNA分子的大小分子的大小和构象和构象等有关等有关 凝胶中的凝胶中的DNADNA分子通过分子通过染色染色，可以在波长为，可以在波长为300nm300nm的紫外灯的紫外
22、灯下被检测出来下被检测出来一、实验原理：二、材料用具DNADNA片段的扩增及电泳鉴定片段的扩增及电泳鉴定PCRPCR仪仪微量移液器微量移液器电泳装置电泳装置4 4种脱氧核苷酸的等量混合液、种脱氧核苷酸的等量混合液、2 2种引物、种引物、TaqTaqDNADNA聚合酶（耐高温）聚合酶（耐高温）、模板、模板DNA DNA 扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖、核酸染料等扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖、核酸染料等微量离心管微量离心管电泳槽电泳槽电泳仪电泳仪PCR反反应应体系的配方体系的配方10倍倍浓缩浓缩的的扩扩增增缓缓冲液冲液5ul20mmol/l 的的4
23、种脱氧核苷酸的等量混合液种脱氧核苷酸的等量混合液1ul20umol/l 的引物的引物I2.5ul20umol/l 的引物的引物II2.5ulH2O28-33ul1-5U/ul 的的Taq DNA聚合聚合酶酶1-2U模板模板DNA 5-10ul总体体积50ul最后加最后加三、方法步骤DNADNA片段的扩增及电泳鉴定片段的扩增及电泳鉴定DNADNA片段的扩增及电泳鉴定片段的扩增及电泳鉴定循循环程序程序变性性复性复性延伸延伸预变性94，5min30次94，30s55，30s72，1min最后一次94，1min55，30s72，1min 5-10min5-10min确保模板确保模板DNADNA完全变性
24、完全变性总延伸：确保所有总延伸：确保所有片段充分延伸片段充分延伸三、方法步骤与与DNADNA结合，使其在紫外灯下发出荧光结合，使其在紫外灯下发出荧光8 8：凝胶：凝胶载样载样缓冲液（内含缓冲液（内含指示剂指示剂）4 4：核酸染料：核酸染料：1.1.指示电泳进度指示电泳进度溴酚蓝溴酚蓝2.2.增加增加PCRPCR产物密度产物密度,确保其均匀沉入加样孔内确保其均匀沉入加样孔内指示分子大小的标准参照物：指示分子大小的标准参照物：MarkerMarkerDNADNA片段的扩增及电泳鉴定片段的扩增及电泳鉴定三、方法步骤保持试剂最大活性及稳定性保持试剂最大活性及稳定性注意注意2 2：冰上缓慢融化：冰上缓慢
25、融化：四、注意DNADNA片段的扩增及电泳鉴定片段的扩增及电泳鉴定五、结果分析与评价1.1.你是否成功扩增出你是否成功扩增出DNADNA片段？判断的依据是什么？片段？判断的依据是什么？在紫外灯下观察：在紫外灯下观察：DNADNA条带的分布及粗细程度条带的分布及粗细程度2.2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？结果的可能原因？1.1.没有条带：没有条带：期望只有一条目的带期望只有一条目的带漏加了漏加了PCRPCR组分；组分；各组分用量不当；各组分用量不当；PCRPCR程序设置不当程序设置不当2.2.不止一条条带：不止一条条带：引物设计不合理：引物设计不合理：模板受到污染模板受到污染退火（复性）温度过低退火（复性）温度过低引物在模板链上不止一个结合位点引物在模板链上不止一个结合位点引物太短引物太短