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1、第第1 1节节 重组重组DNADNA技术的基本工具技术的基本工具1.1.什么叫基因工程？什么叫基因工程？P65P65基因工程的原理是什么？基因工程有什么优点？基因工程的原理是什么？基因工程有什么优点？2.2.重组重组DNADNA技术的用到的基本工具是哪三个？技术的用到的基本工具是哪三个？3.3.限制酶的主要从哪类生物中分离纯化出来限制酶的主要从哪类生物中分离纯化出来的？切割的化学键是？的？切割的化学键是？4.EcoR4.EcoR限制酶和限制酶和SmaSma限制酶切割限制酶切割DNADNA后，分别产生什么样的末端后，分别产生什么样的末端？5.DNA5.DNA连接酶的作用？作用的化学键？连接酶的作
2、用？作用的化学键？6.Ecoli DNA6.Ecoli DNA连接酶和连接酶和T4 DNAT4 DNA连接酶分别来自什连接酶分别来自什么生物？它们连接的末端有什么差异？么生物？它们连接的末端有什么差异？7.7.基因工程中用的载体起什么作用？作为载体要具备哪些条件？种类有哪些？基因工程中用的载体起什么作用？作为载体要具备哪些条件？种类有哪些？8.8.质粒的化学本质是什么？只有原核生物才有质粒吗质粒的化学本质是什么？只有原核生物才有质粒吗9.9.限制酶、限制酶、DNADNA连接酶、连接酶、DNADNA聚合酶、解旋酶、聚合酶、解旋酶、DNADNA酶的作用分别是什么？酶的作用分别是什么？10.DNA1
3、0.DNA粗提取的粗提取的原理？原理？11.DNA11.DNA和蛋白质在酒精中溶解性有什么差异？和蛋白质在酒精中溶解性有什么差异？12.DNA12.DNA在在NaClNaCl溶液中溶解度与溶液中溶解度与NaClNaCl溶溶液的浓度液的浓度有何有何关系？关系？13.13.鉴定鉴定DNADNA的原理？（条件？试剂？现象？）的原理？（条件？试剂？现象？）阅读第二节：阅读第二节：基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序：76-7776-77，80-8280-82面面第三章第三章 基因工程基因工程第第2 2节节基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的
4、基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定 基因工程的基本操作程序从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。利用序列数据库和序列比对工具1.目的基因的筛选与获取二、基因工程的基本操作程序筛选：1.1.抗虫棉的抗虫基因如何筛选的？抗虫棉的抗虫基因如何筛选的？2.2.BtBt抗虫蛋白的抗虫机理是什么？抗虫蛋白的抗虫机理是什么？会不会对人畜产生危害？会不会对人畜产生危害？1.人工合成3.利用PCR技术获取和扩增（常用）在在已知序列且基因较小时已知序列且基因较小时，利用利用DNADNA合成仪合成仪自动合成自动合成2.从基因文库中获取将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的
5、群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要主要指的是指的是编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因，也可以是一些具有也可以是一些具有调控作用的因子调控作用的因子。目的基因获取(1)基因表达载体的目的使使目的基因在受体细胞中目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在，且，且可以遗传可以遗传给给下一代；下一代；使目的基因能够使目的基因能够在受体细胞中在受体细胞中表达表达和发挥作用和发挥作用。(2)基因表达载体的组成位置：功能：RNARNA聚合酶聚合酶识别和结合的识别和结合的部位部位，驱动驱动基因转录出基因转录出mRNAmRNA，最终获得最
6、终获得蛋白质蛋白质。基因的首端基因的首端（一段有特殊（一段有特殊结构的结构的DNADNA片段）片段）位置：位置：功能：功能：基因基因的尾的尾端（一段端（一段特殊的特殊的DNA片断）片断）终止终止mRNA的转录的转录用来鉴别用来鉴别或筛选或筛选含有重组含有重组DNA分子的分子的细胞细胞2.基因表达载体的构建二、基因工程的基本操作程序获取获取BtBt基因后，为什么基因后，为什么没有没有直接把目的基因导入受体直接把目的基因导入受体细胞，细胞，而是通过载体将其导入受体细胞而是通过载体将其导入受体细胞?(3)基因表达载体的构建过程诱导型启动子？将目的基因导入受体细胞的方法将目的基因导入植物细胞将目的基因
7、导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法CaCa2+2+处理法处理法我国科学家独创我国科学家独创3.将目的基因导入受体细胞转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。二、基因工程的基本操作程序操作方法？操作方法？受精卵受精卵使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工的原因？加工的原因？原核生物缺乏去除内含子的酶和蛋白质加工系统4.目的基因的检测
8、与鉴定二、基因工程的基本操作程序1.分子水平检测2.个体生物学水平鉴定检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等检测目的基因是否转录出了mRNA检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因PCRPCR等技术等技术（电泳结果）（电泳结果）抗原抗原-抗体杂交技术抗体杂交技术DNADNA分子杂交分子杂交（杂交带）（杂交带）PCRPCR等技术等技术DNADNA和和mRNAmRNA分子杂交分子杂交某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用
9、BamH I酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有 （答出两点即可）。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有 。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞不能区分的，其原因是 ；并且含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞也是不能区分的，其原
10、因是 。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有 的固体培养基。启动子和终止子(2)二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不能生长 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素(3)基因工程中的检测筛选是一个重要的步骤。为筛选出导入了重组质粒的大肠杆菌，下图表示运用影印培养法（使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法）检测基因表达载体是否导入。将得到的大肠杆菌B涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上得到如图a的结果（黑点表示菌落），能够生长的细菌中已导入了 ，反之则没有导入；再将灭菌绒布按到培养基a上，使绒布表面沾
11、上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图b的结果（空圈表示与a对照无菌落的位置）。与图b空圈相对应的图a中的菌落表现型是 ，这些细菌中导入了 。普通质粒或重组质粒 抗氨苄青霉素，不抗四环素重组质粒第第1 1节节 重组重组DNADNA技术的基本工具技术的基本工具1.1.什么叫基因工程？什么叫基因工程？P65P65基因工程的原理是什么？基因工程有什么优点？基因工程的原理是什么？基因工程有什么优点？2.2.重组重组DNADNA技术的用到的基本工具是哪三个？技术的用到的基本工具是哪三个？3.3.限制酶的主要从哪类生物中分离纯化出来的？切割的化学键限制酶的主要从哪类生物中分离纯化出来的？切
12、割的化学键是？是？4.EcoR4.EcoR限制酶和限制酶和SmaSma限制酶切割限制酶切割DNADNA后，分别产生什么样的末端？后，分别产生什么样的末端？5.DNA5.DNA连接酶的作用？作用的化学连接酶的作用？作用的化学键？键？6.Ecoli DNA6.Ecoli DNA连接酶和连接酶和T4 DNAT4 DNA连接酶分别来自什么生物？它们连接的末端有什么差异？连接酶分别来自什么生物？它们连接的末端有什么差异？7.7.基因工程中用的载体起什么作用？作为载体要具备哪些条件？种类有哪些？基因工程中用的载体起什么作用？作为载体要具备哪些条件？种类有哪些？8.8.质粒的化学本质是什么？只有原核生物才有
13、质粒吗质粒的化学本质是什么？只有原核生物才有质粒吗9.9.限制酶、限制酶、DNADNA连接酶、连接酶、DNADNA聚合酶、解旋酶、聚合酶、解旋酶、DNADNA酶的作用分别是什么？酶的作用分别是什么？10.DNA10.DNA粗提取的原理？粗提取的原理？11.DNA11.DNA和蛋和蛋白质在酒精中溶解性有什么差异？白质在酒精中溶解性有什么差异？12.DNA12.DNA在在NaClNaCl溶液中溶解度与溶液中溶解度与NaClNaCl溶液的浓度溶液的浓度有何有何关系？关系？13.13.鉴定鉴定DNADNA的原理？（条件？试剂？现象？）的原理？（条件？试剂？现象？）1.1.基因工程的基本操作程序基因工程
14、的基本操作程序分为哪四个步骤？分为哪四个步骤？2.2.什么叫目的基因？获得目的基因的方法有哪些？什么叫目的基因？获得目的基因的方法有哪些？13.13.构建基因表达载体的目的是什么？构建基因表达载体的目的是什么？14.14.构建好的基因表达载体主要由哪些部分组成？每个部分作用是什么？构建基因表达载构建好的基因表达载体主要由哪些部分组成？每个部分作用是什么？构建基因表达载体的过程是怎样的？体的过程是怎样的？15.15.启动子和起始密码子启动子和起始密码子、终止子和终止密码子终止子和终止密码子有什么区别？有什么区别？17.17.把目的基因导入植物细胞、动物细胞和大肠杆菌的方法分别是什么？把目的基因导
15、入植物细胞、动物细胞和大肠杆菌的方法分别是什么？18.18.农杆菌转化法适合把目的基因导入什么样的植物细胞？农杆菌转化法适合把目的基因导入什么样的植物细胞？19.19.为什么要把目的基因插入农为什么要把目的基因插入农杆菌的杆菌的T-DNAT-DNA？20.20.把目的基因导入大肠杆菌为什么要先用把目的基因导入大肠杆菌为什么要先用Ca2+Ca2+处理大肠杆菌？处理大肠杆菌？21.21.怎样检测目的基因是否导入受体细胞？是否转录出怎样检测目的基因是否导入受体细胞？是否转录出mRNAmRNA和翻译出蛋白质？和翻译出蛋白质？22.22.如何从个体水平检测植物是否出现了抗病（虫）特性？如何从个体水平检测植物是否出现了抗病（虫）特性？