《【生物】基因工程的基本操作程序-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《【生物】基因工程的基本操作程序-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3.pptx（56页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、基因工程的基本操作程序 新课导入1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？转基因抗虫棉与普通棉花基因工程的步骤苏云金杆菌与载体拼接普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入Bt基因重组DNA分子【培育转基因抗虫棉的简要过程】1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定基因工程的一般操作程序主要包括四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的
2、构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。（核心步骤）基因工程的基本操作原核细胞的基因结构非编码区非编码区启动子编码区终止子启动子：RNA聚合酶结合位点，转录起始的信号，驱动基因转录出mRNA终止子：终止RNA的合成非编码区功能：不能编码蛋白质，调控调控遗传信息的表达编码区：编码蛋白质的合成与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点A G G U C A C G U C GA G G U C A C G U C GA G G U C A C G U C GA G G U C A C G U C GRNARNARNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶RNARNARNARNA聚合酶聚合酶聚
3、合酶聚合酶RNARNARNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶A G G T C A C G T C GA G G T C A C G T C GA G G T C A C G T C GA G G T C A C G T C GT C C A G T G C A G CT C C A G T G C A G CT C C A G T G C A G CT C C A G T G C A G C二、真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游间隔的、不连续的外显子：内含子：数量关系：外显子=内含子+1能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列能转录
4、相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列编码区非编码区非编码区启动子终止子编码区上游编码区下游初级RNA成熟mRNA蛋白质内含子外显子一.目的基因的筛选与获取（一）、目的基因1.概念:在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物的基因。2.作用:根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因。3.实例:与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统杀死棉铃虫。当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造
5、成害虫死亡。【相关信息】P77Bt抗虫蛋白的抗虫原理？抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响培育转基因抗虫棉用到的目的基因Bt抗虫蛋白基因简称Bt基因1.实例：Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害也对Bt基因的表达产物Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关不仅掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因一.目的基因的筛选与获取（二）、筛选合适
6、的目的基因从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。（三）利用PCR获取和扩增目的基因PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。目的基因的筛选与获取一.1.PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。2.PCR的原理：DNA半保留复制PCR扩增仪（三）
7、、利用PCR获取和扩增目的基因目的基因的筛选与获取一.DNA聚合酶只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键，需要模板 A A T T G A A T T GC CAATTA AA AT TT TDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶方向：只能从5端3端延伸（1）解旋DNA半保留复制（2）合成子链（3）重新螺旋条件:能量亲代DNA的两条链4种游离的脱氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶等由细胞代谢提供的ATP等模板原料酶体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用PCR中参与的组分打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3端
8、开始连接脱氧核苷酸解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常为小的单链RNA）无需解旋酶，用高温代替DNA母链4种脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）人工合成的2种引物（通常为小的单链DNA）反应还需要其它条件，如能量、缓冲液、温度控制等PCR和DNA的体内复制是否完全相同？引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。35DNA母链135DNA母链235引物135引物2引物35DNA母链135DNA母链2用于PCR的引物长度通常为2030个核苷酸。引物结合在模板链的3端作用：使DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸u过程951.变性：加热至9095，双链D
9、NA间的氢键断裂，解旋为单链。变性复性延伸（三）目的基因的获取 利用PCR获取和扩增目的基因使用耐高温的Taq酶保证高温条件下仍具有活性。模板DNA5533一.目的基因的筛选与获取50引物1引物2DNA引物2.复性：冷却至50左右时，两条引物与单链DNA结合（三）、目的基因的获取 利用PCR获取和扩增目的基因5353l引物结合在模板DNA链的3端u过程 变性复性延伸引物1引物272Taq酶Taq酶3.延伸：加热至7075，以目的基因为模板，合成互补的新DNA链。三、目的基因的获取（三）、目的基因的获取 利用PCR获取和扩增目的基因53533553u过程 变性复性延伸一.目的基因的筛选与获取第二
10、次循环955072TaqTaqTaqTaq变性复性延伸延伸变性复性9250753553Taq聚合酶引物1引物2原料模板DNA目的基因（四）PCR技术扩增目的基因（实际）925075变性3553925075退火(复性）925075延伸925075变性变性变性925075退火(复性）925075延伸925075变性925075退火(复性）925075延伸【三点提醒】在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段
11、；PCR引物一般为DNA片段。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2。脱氧核苷三磷酸目的基因：启动子：终止子：标记基因：控制特定性状或表达特定产物。位于基因的首端,是RNA聚合酶结合位点，基因转录的开始。位于基因的末端，终止转录。检测目的基因是否导入受体细胞，筛选含有目的基因的受体细胞。复制原点：DNA聚合酶结合位点。二、基因表达载体的构建（一）、基因表达载体的目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。二、基因表达载体的构建（二）基因表达载体的构建过程载体（质粒）DNA分子（含
12、目的基因）限制酶处理带有黏性末端或平末端的切口带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种使用一种限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？问题探讨载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接反向连接112212 2212211应用中往往选择2种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，减少自连情况出现三、将目的基因导入受体细胞转化：方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法显微注射法感受态细胞法（Ca2+处理法）目的
13、基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程受体细胞稳定表达1.花粉管通道法用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。（一）将目的基因导入植物细胞适用生物：双子叶植物构建表达载体含目的基因的重组Ti质粒表现出新性状的植株导入植物植物细胞细胞植物细胞将目的基因插入染色体DNA中目的基因Ti质粒T-DNA含重组Ti质粒的农杆菌转入农杆菌农杆菌转化法示意图Ti质粒目的基因构建基因表达载体转入农杆菌导入植物细胞T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中表达新性状植物组织培养2.农杆菌转化法两
14、次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。三、将目的基因导入受体细胞操作程序：（二）将目的基因导入动物细胞-显微注射法构建基因表达载体并提纯利用显微注射法将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植（移植到同期发情的母畜子宫内）获得具有新性状的动物体积大，易操作；全能性高，易培养成完整个体。三、将目的基因导入受体细胞（补充）（常用大肠杆菌）繁殖周期短体积小易于培养
15、操作多为单细胞遗传物质相对较少（三）将目的基因导入微生物细胞-Ca2+处理法使用Ca2+处理：增加细胞壁的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）。Ca2+感受态细胞吸收三、将目的基因导入受体细胞（补充）实例：利用转基因大肠杆菌生产药物u过程：Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子四、目的基因的检测与鉴定类型检测内容方法分子水平检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因PCR扩增DNA分子杂交技术目的基因是否转录出mRNAPCR扩增分子杂交技术目的基因是否翻译形成蛋白质抗原-抗体杂交技术个体水平鉴定抗虫或抗病的接种实验
16、抗性以及抗性程度抗性检测；基因工程产品与天然产品的功能活性比较功能活性。1.DNA分子杂交基因探针待测DNA基因探针：常用目的基因的单链DNA片断制成，带有某种（如放射性）标记。能与目的DNA的一条链或与RNA发生碱基互补配对。（一）分子水平的检测2.分子杂交RNA的PCR3.检测目的基因是否翻译成蛋白质方法：抗原-抗体杂交技术苏云金芽孢杆菌提取Bt毒蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白抗原抗体杂交电泳分离转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）接种实验未染病盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提
17、取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常u抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等（二）个体水平检测：抗性以及抗性程度【探究实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定（84-85）（一）实验原理1.PCR在体外进行DNA片段的扩增原理PCR利用了_和_的原理。DNA的热变性原理DNA半保留复制2.DNA片段电泳鉴定的原理DNA分子具有_，在一定的_下，这些基团可以带上_，在_的作用下，这些_会向着_的电极移动，这个过程就是_。可解离的基团pH正电荷或负电荷带电分子电泳与它所带电荷相反电场在凝胶中DNA分子的迁移速率与_、_和_等有关。凝胶中的DNA分子通过_，可以在波长为_的_下被检测出来。凝胶的浓度染
18、色300nm紫外灯DNA分子的大小构象（二）材料用具1.试剂（1）4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。（2）电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。（3）PCR反应体系的配方10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）5L20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP）1L20mol/L的引物2.5L20mol/L的引物2.5LH2O2833L1-5U/L的TaqDNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）12U模板DNA（用量为1pg-1g）510L总体积50L2.用具PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）微量离心管（实际上是进行PC
19、R反应的场所）微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）（注意：加不同样品时，需要更换枪头）（三）实验步骤1.DNA片段扩增的具体过程移液用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。离心待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。反应参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性94,5min/30次94,30s
20、55,30s 72,1min最后一次94,1min55,30s 72,1min预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。可根据目的片段长度适当调整延伸时间。2.PCR2.PCR扩增产物电泳鉴定的具体过程扩增产物电泳鉴定的具体过程制备凝胶融化倒模凝固用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%1.2%.加热至琼脂糖熔化，稍冷却后,加入适量的核酸染料混匀。将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。进行电泳加液加样电泳将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。将扩增得到的PCR产物与
21、凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为15V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳观察鉴定取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。电泳实验注意：1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更
22、换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。实验步骤（电泳鉴定）（四）实验结果及分析评价思考1你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带。思考2你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好；模板DNA出现污染；Mg2浓度过高等。谢谢！谢谢！