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1、 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序v目的基因的获取目的基因的获取v基因表达载体的构建（核心）基因表达载体的构建（核心）v将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞v目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定目的基因目的基因:主要是指主要是指编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因,也可也可以是一些具有以是一些具有调控作用的因子调控作用的因子。一、目的基因的获取一、目的基因的获取 目的基因可以目的基因可以从自然界中已有的物种中分离从自然界中已有的物种中分离出来出来，也可以用，也可以用人工的方法合成人工的方法合成。例如，与生物抗性相关的基因、与优良品相关的基因、例如，与生物抗性相关的基因、与优
2、良品相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒性相关的基因，以与生物药物和保健品相关的基因、与毒性相关的基因，以及与工业所需用酶相关的基因等，也可以是一些具有调控及与工业所需用酶相关的基因等，也可以是一些具有调控作用的因子。作用的因子。1、目的基因、目的基因将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到片断，导入到受体菌的群体受体菌的群体中，各中，各个受体菌分别含有这种生物的不同个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因，称为基因文库基因文库基因文库基因文库 基因组文库基因组文库(包含生物的全部基因）包含生物的全部基因）部分基因文库（部分基因文库（cDNA文库
3、）文库）（1）从）从基因文库基因文库中获取目的基因。中获取目的基因。2、获取方法、获取方法什么叫基因文库？什么叫基因文库？通通过过对对受受体体菌菌的的培培养养而而储储存存基基因因基基因因文文库库的的构构建建模模式式图图基因组文库基因组文库基因组文库的构建基因组文库的构建生物的全部基因生物的全部基因cDNAcDNA文库的构建文库的构建从基因组文库中获得的目从基因组文库中获得的目的基因和从的基因和从cDNA文库中文库中获得的目的基因一样吗？获得的目的基因一样吗？原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARN
4、A聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子 RNA RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。与其结合。转录开始后，转录开始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移动，并以分子移动，并以DNADNA分子的一条链为模板合成分子的一条链为模板合成RNARNA。转录完毕后，转录完毕后，RNARNA链释放出来，紧接着链释放出来，紧接着RNARNA聚合酶聚合酶也从也从DNADNA模板链上脱落下来。模板链上脱落下来。非编码区非编码区真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合
5、位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子：外显子：外显子：1.为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？不行吗？构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因
6、的生方式从含有该基因的生物的物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从方式从mRNA中获中获得，不一定要构建基因文库。得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生生物在个体发育的不同阶
7、段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。如何从基因文库中得到所需要的基因？如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性。基因翻译产物蛋白质等特性。原理：原理：DNADNA双链复制双链复制反应过程反应过程：1.加热加热至至909095 95 目的目的基因基因DNA解链；解链；2.冷却冷却至至55556
8、0 60，引，引物结合到互补物结合到互补DNADNA链链;3.3.加热至加热至707075 75，热热稳定稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶酶)从引物起始互补链的合从引物起始互补链的合成。成。（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCR技术技术聚合酶链式反应聚合酶链式反应前提：前提：条件：条件：场所：场所：结果：结果：PCR扩增仪扩增仪一段已知目的基因的核苷一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物酸序列，以便合成引物原料：四种脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷酸引物：一对引物引物：一对引物酶：酶：热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(TaqTaq酶酶）模板：模
9、板：DNADNA的两条链的两条链温度控制温度控制以指数方式扩增，即以指数方式扩增，即2n细胞外（细胞外（PCR扩增仪）扩增仪）（3）人工合成法）人工合成法条件：基因比较小，核苷酸序列已知条件：基因比较小，核苷酸序列已知方法：通过方法：通过DNA合成仪用化学方法直合成仪用化学方法直接人工合成接人工合成二、二、基因表达载体的构建基因表达载体的构建核心核心1 1、目的：、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代并且可以遗传给下一代使目的基因能表达和发挥作用使目的基因能表达和发挥作用2、过程：、过程：1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一）用一定的限制
10、酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。个切口，露出黏性末端。2）用同种限制酶切断目的基因，使其产生）用同种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端相同的黏性末端。3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个连接酶，形成了一个重重组组DNA分子分子（重组质粒）（重组质粒）基因表达载体的构建核心质粒质粒DNADNA分子分子一个一个切口切口两个两个黏性末端黏性末端两个两个切口切口获得目的基因获得目的基因DNA DNA 连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同种同种 限制酶限制酶（或产生
11、相同或产生相同 黏性末端的不同限制酶）黏性末端的不同限制酶）目的基因与运载体的结合过程，实际目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。上是不同来源的基因重组的过程。3、基因表达载体的组成：、基因表达载体的组成：a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因e、复制原点、复制原点注意注意:目的基因必需插入在启动子和终止子之间目的基因必需插入在启动子和终止子之间必必答答2.基因表达载体的构建:启动子、终止子和起始密码子、终止密码子比较启动子、终止子和起始密码子、终止密码子比较:结构方面：结构方面：(1)启动子、终止子是基因表达载体上的具有特殊启
12、动子、终止子是基因表达载体上的具有特殊结构结构_片段片段(2)(2)起始密起始密码子、子、终止密止密码子是子是_上的三个相上的三个相邻碱基。碱基。功能方面功能方面：启动子、终止子分别是驱动和终止启动子、终止子分别是驱动和终止_；起始密起始密码子、子、终止密止密码子分子分别是是驱动和和终止止_上的三个相邻碱基。DNAmRNA转录转录翻译翻译寻根问底寻根问底 将生物的所有的DNA直接导入受体细胞不是更简单吗？如果这么做，结果会怎样？有人采用总有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉提取出来，通过注射或花粉管通道法导入
13、受体植物，没有进行表达载体的构管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物定什么基因导入了受体植物,不好检测与筛选不好检测与筛选,同时同时也无法增强目的基因的表达水平也无法增强目的基因的表达水平,也不能确定目的也不能确定目的基因产物的存在部位。基因产物的存在部位。(三三)将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞l l常用的受体细胞：常用的受体细胞：动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌等。动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌等。动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌等。动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌
14、等。转化：转化：目的基因进入受体细胞内，并且在目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。受体细胞内维持稳定和表达的过程。1、将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法（最常用的方法）农杆菌转化法（最常用的方法）（双子叶或裸子植物）（双子叶或裸子植物）a.农杆菌特点：农杆菌特点：能在自然条件下感染能在自然条件下感染双子叶植物双子叶植物和和祼子植物祼子植物，对单子叶植物无感染能力；，对单子叶植物无感染能力；Ti质粒质粒的的TDNA可转移至受体细胞可转移至受体细胞并并整合到其染色体整合到其染色体DNA上上。2.农杆菌转化法分析:b、转化过程、转化过程:（2）基
15、因枪法（单子叶植物常用）基因枪法（单子叶植物常用）基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。的基因与其整合并表达的方法。（3）花粉通道发）花粉通道发 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加合前，剪去柱头，然后，滴加D
16、NA（含目的基因），使目的（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。基因借助花粉管通道进入受体细胞。2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞方法方法:显微注射技术显微注射技术受体细胞：受体细胞：受精卵受精卵操作程序操作程序:提纯含目的基提纯含目的基因表达载体因表达载体取取受精卵（受体细胞）受精卵（受体细胞）显微注射显微注射移植到子宫移植到子宫受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞 大肠杆菌细胞最常用的转化方法是大肠杆菌细胞最常用的转化方法是:首先用首先用CaCa2+2+处理细胞处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性以
17、增大细菌细胞壁的通透性以增大细菌细胞壁的通透性以增大细菌细胞壁的通透性,使使细胞处于一种能吸收周围环境中细胞处于一种能吸收周围环境中DNADNA分子的生理分子的生理状态状态,这种细胞称为这种细胞称为感受态细胞感受态细胞。第二步是将重组表达载体第二步是将重组表达载体DNADNA分子溶于缓冲分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收受态细胞吸收DNADNA分子，完成转化过程。分子，完成转化过程。目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，目的基因在受体细胞内，随其
18、繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。能获得大量的目的基因。能获得大量的目的基因。能获得大量的目的基因。原核生物常作为受体细胞原因：原核生物常作为受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少方法方法导入植物细胞导入植物细胞导入动物细胞导入动物细胞导入微生物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞法感受态细胞法(三三)将目
19、的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞(四四)目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测转基因生物检测转基因生物DNADNA上是否插上是否插 入了目的基因入了目的基因方法：方法：DNADNA分子杂交分子杂交工具：工具：放射性同位素标记的目的基因做探针放射性同位素标记的目的基因做探针结果：结果：显示杂交带显示杂交带DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。n n 如果显示出杂交带
20、，就表明待测样品如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因。含有目的基因。(四四)目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质方法：方法：分子杂交分子杂交方法：方法：抗原抗原-抗体杂交抗体杂交工具：工具：放射性同位素标记的目的基因做探针放射性同位素标记的目的基因做探针 结果：结果：显示杂交带显示杂交带结果：结果：显示杂交带显示杂交带除分子的检测外除分子的检测外，有时还需要进行，有时还需要进行个体生物学个体生物学水平水平的鉴定。例如，一个抗虫或抗病基因导入
21、植物的鉴定。例如，一个抗虫或抗病基因导入植物细胞后，需要做细胞后，需要做抗病或抗虫的接种实验抗病或抗虫的接种实验，以，以确定植物是否具有抗性以及抗性的程度。确定植物是否具有抗性以及抗性的程度。有的基因工程产品有的基因工程产品需要与天然产品的功能需要与天然产品的功能进行进行活性比较活性比较，以确定，以确定转基因产品的功能活性转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。是否与天然产品相同。3.目的基因的检测与鉴定的方法:(四四)目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定总结总结1.1.作为基因工程的运载体，只需含有目的基因就可以完作为基因工程的运载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？成任务吗？
22、为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用作用,还需要有其他控制元件还需要有其他控制元件,如如启动子启动子,终止子终止子和和标记基因标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是等。必须构建上述元件的主要理由是:(1)(1)生物之间进行基因交流生物之间进行基因交流,只有使用受体生物自身基因的只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；启动子才能比较有利于基因的表达；(2)(2)通过通过cDNAcDNA文库获得的目的基因没有启动子文库获得的目的基因没有启动子,只将编码序只将编码序列导入受体生物中无法转录；列导入受体生物中无法转
23、录；(3)(3)目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；(4)(4)为了增强目的基因的表达水平为了增强目的基因的表达水平,往往还要增加一些其他往往还要增加一些其他调控元件调控元件,如增强子等；如增强子等；(5)(5)有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位部位,往往要加上可以标识存在部位的基因往往要加上可以标识存在部位的基因,如绿色荧光蛋如绿色荧光蛋白基因等。白基因等。2.2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因
24、导入单子叶植物的原因能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物(如小麦），从如小麦），从理论上说，你认为应该怎么做？理论上说，你认为应该怎么做？根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物叶植物细
25、胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。原因。如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：用农杆菌，但要注意两点：要选择合适的农杆要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌
26、的Vir区（诱区（诱导）的基因，使导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体转移并插入到染色体DNA上。上。需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。3.3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面利用大肠杆菌可以生产出人的
27、胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。产这种糖蛋白是不可能的。
28、4.-4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋珠蛋白，想一想，应如何进行设计？白，想一想，应如何进行设计？(4)(4)培养进入了培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌珠蛋白基因的大肠杆菌,收集菌体收集菌体,破碎后破碎后从中提取从中提取-珠蛋白。珠蛋白。(1)(1)从小鼠中克隆出从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列珠蛋白基因的编码序列(cDNA)(c
29、DNA)。(2)(2)将将cDNAcDNA序列接上在大肠杆菌中可以适用的启动子序列接上在大肠杆菌中可以适用的启动子,另外加上另外加上抗四环素的基因等组件抗四环素的基因等组件,构建成一个表达载体。构建成一个表达载体。(3)(3)将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中,然后在含有然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌肠杆菌。如果表达载体未进四环素的培养基上培养大肠杆菌肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中入大肠杆菌中,大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落果培养基上长出大肠杆菌菌落,则表明则表明-珠蛋白基因已进入珠蛋白基因已进入其中。其中。