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1、目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞第一步第二步第三步第四步目的基因的检测与鉴定前提核心关键保证利用PCR获取和扩增目的基因、启动子、终止子、标记基因农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物)、感受态细胞转化法(微生物);分子检测：是否插入、转录、翻译个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。温故知新温故知新：基因工程的基本程序基因工程的基本程序四：目的基因的检测与鉴定 将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？1.目的：检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性四：目的基因的检测与鉴定思考：结合基因表达的过
2、程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？Bt基因mRNABt抗虫蛋白抗虫棉PCR等技术检测抗原 抗体杂交技术分子水平抗虫鉴定（个体水平）转录翻译四：目的基因的检测与鉴定思考：结合基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？类型检测内容方法分子水平的检测个体水平的鉴定受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因目的基因是否转录出mRNAPCR扩增、DNA分子杂交技术目的基因是否翻译成蛋白质抗原-抗体杂交技术个体是否具有相应性状抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等PCR扩增、分子杂交技术四：目的基因的检测与鉴定检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因（一）分子水平检测方法1：PCR扩增提取DNA
3、根据目的基因的序列设计PCR引物PCR操作是否扩增出目的基因电泳DNA测序技术M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果四：目的基因的检测与鉴定检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因（一）分子水平检测方法2：DNA分子杂交技术提取DNA样本基因组DNA酶切DNA片段电泳目标片段（事先不知道）转膜硝酸纤维素膜四：目的基因的检测与鉴定基因探针是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩瀚的基因组中把目的基因显示出来。硝酸纤维素膜含目的基因
4、的DNA片段基因探针四：目的基因的检测与鉴定检测目的基因是否转录出了mRNA（一）分子水平检测转基因生物PCR操作是否扩增出目的基因逆转录cDNA提取RNAmRNA作为模板方法1：PCR扩增RNA分子杂交(Northern Blot)流程图提取RNA转基因生物标记的基因探针方法2：分子杂交技术电泳DNA测序技术四：目的基因的检测与鉴定检测目的基因是否翻译出相应蛋白质（一）分子水平检测方法：抗原 抗体杂交过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 是否出现杂交带以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）苏云金芽孢杆菌提取BtBt抗虫抗虫蛋白蛋白注射小鼠体内抗体抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交转基
5、因生物放射性检测（杂交带）抗原与抗体的特异性结合原理：四：目的基因的检测与鉴定（二）个体生物学水平鉴定目的基因是否表现出相应的性状采摘抗虫棉叶片饲喂棉铃虫观察棉铃虫存活情况四：目的基因的检测与鉴定转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）感染（抗病接种实验）未出现病斑盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长功能、活性正常提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较（二）个体生物学水平鉴定总结1.目的基因的筛选和获取-前提u利用PCR获取和扩增u化学方法人工合成2.构建基因表达载体-核心u目的基因、启动子、终止
6、子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞-关键u农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物)、感受态细胞转化法(微生物);4.目的基因的检测与鉴定-保证u分子检测：是否插入、转录、翻译u个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。基因工程的基本操作程序（4个步骤）有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。五：DNA 片段的扩增及电泳鉴定1、实验原理（1）DNA体外扩增的原理：PCR仪PCR利用了DNA的热
7、变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理；PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。探究.实践五：DNA 片段的扩增及电泳鉴定（二）DNA片段电泳鉴定原理：电泳鉴定原理DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构
8、像等有关。琼脂糖凝琼脂糖凝胶电泳胶电泳DNADNA分子电泳分子电泳五：DNA 片段的扩增及电泳鉴定2.材料用具（一）仪器：PCR仪微量离心管电泳装置微量移液器自动控温，实现DNA的扩增实际上是进行PCR反应的场所用于向微量离心管转移PCR配方中的液体包括电泳仪、电泳槽等五：DNA 片段的扩增及电泳鉴定（二）试剂：（1）无菌水、琼脂糖；（2）电泳缓冲液（TAE或TBE）；（3）凝胶载样缓冲液（内含指示剂溴酚蓝）；（4）核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）。（5）PCR反应体系的配方材料用量10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）5L20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP）1L
9、20mol/L的引物2.5L20mol/L的引物2.5LH2O2833L1-5U/L的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）12U模板DNA（用量为1pg-1g）510L2.材料用具五：DNA 片段的扩增及电泳鉴定3、实验步骤（PCR）用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。移液离心扩增预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。循环程
10、序变性复性延伸预变性94,5min30次94,30s55,30s 72,1min最后一次 94,1min 55,30s 72,1min/（一）DNA片段的扩增：五：DNA 片段的扩增及电泳鉴定配制琼脂糖溶液根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀制备凝胶将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜加样将扩增得到的PCR产物与凝胶载样
11、缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物电泳接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为15V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳观察记录取出凝胶置于紫外灯下观察和照相（二）DNA片段的电泳鉴定：五：DNA 片段的扩增及电泳鉴定问题1:你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果问题2:你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不
12、止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。课堂练习一、概念检测1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因（）（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（）（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因
13、，就代表抗冻番茄培育成功。（）课堂练习2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（）A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸D课堂练习二、拓展应用1.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。外源基因插入基因组中可能为单位点插入
14、，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。课堂练习2.八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示）和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtl表示）参与-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtl基因转入水稻，使水稻胚乳中富含-胡萝卜素，由此生产出的大米称为“黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrl 和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN 12424。该项研究的目的基因是_，标记基因是_，质粒pSYN 12424的作用是_。ctrl 基因和psy基因Pmi基因 将目的基因送入水稻细胞