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1、 南京医科大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下，独立进行研宂工作 所取得的成果t除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和 集体，均己在文中以明确方式标明本人完全意识到本声明的法律后果由本人 承担。 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留并向国家存关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权南京医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存
2、和汇编本学位论文 s 本学位 论文属 f (诸在以下相应方框内打 “ V ”) ： 1、 保密 ，在年解密后适用本授权书 2、 不保密口 & 分类号： R44 密级： 单位代码 ： 10312 学 号 ： 20121624 题 目： 长链非编码 RNA 91H 在结 t 肠癌中的表达及 _ 其功能研究 _ 研 究 生 ： 邓齐文 指导教师： 王书查教授 学科专业： 临床检验诊断学 学院名称： 第三临床医学院 二 一 五 年 五月 完成时间 : 南京医科大学硕上学位论文 目 录 . 1 蚊 _ . 3 / . _ 目丨 J a . 5 麟 . 8 iH t . 9 1. 椒斗 . 9 2. 仪器
3、和试剂 . 9 3. 实验方法 . 14 4. 统计分析 . 25 第一部分长链非编码 RNA 91H 在结直肠癌中的表达及其临床意义 . 27 1. 關 . 27 2. i 寸 i 仑 . 34 3. 会吉 it . 36 第二部分长链非编码 RNA 91H 与拷贝数的关系及其生物学功能的研究 . 37 1. 關 . 37 2. i 寸 i 仑 . 43 3. 会吉 it . 44 #考 t 献卜） . 45 文献综述 . 51 附录 . 64 在读期间发表的学术论文及研究成果 . 66 至夂 ilf . 69 南京医科大学硕上学位论文 长链非编码 RNA91H在结直肠癌中的表达及其功能研究
4、 中文摘要 目的：近年大量的研究数据表明长链非编码 RNA (long non-coding RNA, IncRNA) 在恶性肿瘤的发生发展的过程中扮演了至关重要的作用。现有证据表明 IncRNA 91H 在乳腺癌组织中高表达，并且反式调控 IGF2 的表达。本研究拟通过检测 91H 在结直肠癌中的表达，探讨 IncRNA91H 的表达与结直肠癌的临床相关性及其生 物学功能，初步揭示 91H 在结直肠癌中的作用及相关的分子机制，为日后临床 分子靶向治疗结直肠癌提供理论依据。 方法： 1. 先后收集 72 例结直肠癌患者的癌组织及其癌旁组织标本，购买结直肠癌细 胞系 HCT-8、 HT-29、
5、HCT-116、 SW-620 以及正常肠黏膜上皮细胞 FHC; 2. 采用聚合酶链反应技术 （ PCR)检测结直肠癌组织样本的微卫星不稳定性； 3. 运用实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)对组织样本（结直肠癌组织和癌旁组织 ） 和四种结直肠癌细胞系及其正常细胞 FHC 的 91H 表达量进行检测，筛选出 表达最高的结直肠癌细胞株用于后续实验，同时也检测了组织样本的拷贝数 变异，分析 91H 表达量与其拷贝数变异及临床特征的相关性； 4. 构建 91H 干扰片段，利用 Lip2000脂质体瞬时转染 91H 表达量最高的结直肠 癌细胞株，并利用 RT-qPCR 检测其转染效率； 5. 运用
6、MTT、 流式细胞术、划痕、 Transwell 等实验观察 91H 对转染后细胞增 殖、凋亡、迁移及侵袭等生物学行为的影响。 结果： 1. 91H 在结直肠癌组织中的相对表达水平是癌旁组织的 6.103.12 倍，差异有 统计学意义 （ P0.05) 4. 与正常肠黏膜上皮细胞 FHC 相比， 91H 在 HCT-8、 HT-29、 HCT-116 细胞中 表达水平明显升高 （ P0.05)。 5. 体外实验结果表明：干扰 91H 的表达可抑制结直肠癌细胞的增殖、迀移和侵 袭，但对细胞的凋亡无明显影响。 结论： 1. 91H 高表达与肿瘤的转移及不良预后密切相关，可作为一个新的临床肿瘤标 志
7、物用于结直肠癌患者的预后判断。 2. 91H 高表达能促进结直肠癌细胞的增殖、迀移和侵袭。 关键词：长链非编码 RNA; 91H;结直肠癌；预后 2 南京医科大学硕上学位论文 The expression and function of long non-coding RNA 91H in colorectal cancer Abstract Objective: Recently, accumulated research data have shown that IncRNAs (long non-coding RNA) play a critical role in the carcin
8、ogenesis and development of malignancy. Moreover, the existing evidence showed that IncRNA 91H is overexpressed in the tissues of breast cancer, and involved in the regulation of IGF2 expression in trans. This study was performed to explore clinical relevance and biological functions of 91H in color
9、ectal cancer (CRC), and initially revealed the impact of 91H on CRC and its molecular mechanisms to provide a theoretical basis of clinical molecular targeted therapy for CRC. Methods: 1. 72 CRC tumor tissues and adjacent normal tissues were collected. CRC cell lines (HCT-8, HT-29, HCT-116, SW-620)
10、and FHC were obtained from Chinese Academy of Science. 2. The microsatellite instability was detected in CRC tumor tissues by PCR. 3. 91H expression were measured in tissue samples, four CRC cell lines and normal FHC cell line by real-time quantitative PCR (RT-qPCR) to make sure of the cell line wit
11、h the highest levels of 91H expression, and copy number variations (CNVs) were also measured in tissue samples by RT-qPCR to further analyze the correlation of 91H expression, CNV and clinical characteristics 4. 91H interference fragments were constructed and transfected into HCT-116 by Lip 2000 and
12、 the transfection efficiency was assessed by RT-qPCR. 5. The biological roles of 91H were evaluated by MTT, flow cytometry, scratch wound assay, migration and invasion assays. Results: 1. 91H relative expression levels in cancer tissues was 6.103.12 folds of the 3 南京医科大学硕士学位论文 adjacent normal tissue
13、s (P 0.05). 4. Compared with the normal cell line FHC, 91H was overexpressed in cell lines HCT-8, HT-29 and HCT-116 (P0.05 and 91H expression in HCT-116 was the highest levels among them. 5. Our results in vitro showed that knockdown of 91H inhibited the proliferation, migration, and invasiveness of
14、 CRC cells. Conclusions: 1. 91H overexpression was closely associated with tumor metastasis and poor prognosis, and could be considered as a novel biomarker to evaluate clinical prognosis for CRC patients. 2. 91H overexpression may promote the the proliferation, migration, and invasiveness of CRC ce
15、lls Key words: IncRNA; 91H; colorectal cancer; prognosis 4 南京医科大学硕士学位论文 刖 目 恶性肿瘤是 21 世纪严重威胁人类生命健康的杀手之一。据国际癌症研宄机 构 （ International Agency for Research on Cancer, IARC)统计， 2012 年全球共有 1410 万新发恶性肿瘤病例， 820 万人死于恶性肿瘤，并呈逐年上升趋势 W。 结直 肠癌 （ colorectal cancer， CRC)是临床常见的恶性肿瘤之一，随着社会经济的发 展、人们的生活环境、生活方式以及膳食结构的改变，
16、CRC 的发病率呈不断上 升趋势，近年来己上升至恶性肿瘤的第 3 位，病死率位居第 4 位 2，己严重威胁 到人类的身心健康。近年来，尽管在 CRC 的诊断和治疗上取得了巨大进展，但 由于其发现晚、进展快，其 5 年生存率仍然较低。 CRC 的临床诊断目前多依靠 影像学、肠镜以及粪便隐血试验等方法，但 CRC 患者早期症状不明显，极易漏 诊、误诊。因此深入研宄与 CRC 发病机制相关的基因，及时发现可治愈的癌前 病变或早期 CRC 的理想的生物标志物具有重要的临床意义。 结直肠癌的发生发展是一个长期的、多基因、多阶段的复杂过程。然而 CRC 确切的发病分子机制尚不清楚。随着分子生物学、基因诊断
17、技术等学科的快速 发展，目前其可能机制是遗传和环境因素长期交互作用而诱发细胞的恶性转化 和不可逆的基因改变，主要表现为致癌基因的激活和抑癌基因的失活，这些改 变最终导致涉及细胞关键性生理功能包括增殖、凋亡、分化等信号转导的失控 3。 尽管已取得了巨大的成果，但是否有其它基因或表观遗传调控等机制参与其发 生发展仍需要进一步探讨。 现阶段，基因组学和 转录组学研究表明，基因组中有 70-80%的 DNA 发生转 录，而编码蛋白的基因只占 1-2%，因此近 98%的基因组序列不能编码蛋白质， 并产生了大量非编码 RNA (non-coding RNA, ncRNA) 4，如小干扰 RNA (smal
18、l interfering RNA, siRNA)、 微小 RNA (micro-RNA, miRNA)、 piwi 相互作用 RNA (piwi-interacting RNA, piRNA)、 长链非编码 RNA (long non-coding RNA, IncRNA)。近年来研究发现 ncRNA 可能通过 DNA 复制、转录调控、染色体修 饰等在真核细胞生长调节中起着极其重要的调控作用 火根据转录本的长短， 5 南京医科大学硕上学位论文 ncRNA 大致被分为两类：短链 ncRNA 是小于 200 核苷酸 （ nucleotide， nt)的； IncRNA 是大于 200nt 的。目
19、前对于小分子调节性 RNA(miRNA、 siRNA)的研 究比较多， miRNA 是最常见的短链非编码 RNA 之一，它是在真核生物中发现 的一类内源性的具有调控作用的非编码 RNA， 其长度一般在 20-25 nt， 主要通过 结合靶基因 3 端非翻译区 （ 3 UTR)， 从而诱导 mRNA 的降解、抑制翻译， 实现基因组转录后的沉默 W。 LncRNA 与 miRNA 的结构相似，是由 RNA 聚合酶 II转录生成的，大多经过 RNA 剪切和 3 端多聚腺苷酸化修饰，因此没有开放 阅读框 （ Open Reading Frame， 0RF)和蛋白编码能力 7，它的转录一般起始于 基因的
20、内含子区、基因之间或编码蛋白基因的反义链。 LncRNA 曾一度被认为是 RNA聚合酶 II 转录的副产物，是基因组转录的 “ 噪音 ” ，不具有生物学功能。 然而，最近的大量报道表明， IncRNA 参与调节 DNA 甲基化、组蛋白修饰、作 为 miRNA前体、 mRNA 降解、磷酸化作用、染色质重塑、蛋白修饰等多种生物 学过程更重要的是 IncRNA 在疾病诊断和治疗领域表现出重要的研究价值， 其临床应用前景巨大。 越来越多的研究报道 IncRNA 在人类恶性肿瘤中异常表达，但多数 IncRNA 是通过调节细胞信号传导或相关通路在细胞恶性转化过程中发挥促癌或者抑癌 作用 9。既往研究表明，
21、 IncRNA 在癌组织中的表达水平主要有三种模式：上调、 下调、双向调节，其中以上调报道的最为多见。在癌组织中表达上调的 IncRNA 往往扮演着类似 “ 癌基因 ” 的作用，如肝细胞核因子 1A 反义链 1 (Hepatocyte Nuclear Factor 1 Alpha-antisense 1, HNF1A-AS1)在肺腺癌组织中明显过量表达， 通过结合 DNA 甲基转移酶 1 (DNAmethyltransferasel,ZWM77)调控钙黏蛋白 E(E-cadherin)的表达，从而影响肺腺癌的发生与转移而在肝细胞肝癌中， 上调的 IncRNA UCA1 (urothelial
22、carcinoma-associated 1)是通过抑制 miR-216b 的表达以及活化 FGFR1/ERK 信号通路影响肿瘤的的进展 LncRNA HOTAIR 在乳腺癌中表达上调，其通过结合 PRC2 复合物促进恶性肿瘤转移相关基因的表 达，在乳腺癌的侵袭转移的过程中发挥重要的调控作用 12。而表达下调的 IncRNA 则扮演类似 “ 抑癌基因 ” 的角色，如 MEG3 (maternally expressed gene 3) 6 南京医科大学硕上学位论文 下调可以促进 CRC 细胞的增殖，并且体内实验证实 MEG3过表达可以抑制 CRC 细胞的增殖而在宫颈癌中 IncRNA LET
23、呈现出低表达的现象，并且与肿瘤 的FIGO 分期、淋巴结转移、浸润深度密切相关 M。 然而亦有少数研究报道 IncRNA在不同肿瘤中发挥着截然相反的生物学效应，如 H19 在肝癌、乳腺癌、 膀胱癌中具有致癌作用，而在畸胎瘤起着抑癌作用 15a6，表明 IncRNA 可能具有 组织表达特异性。最近有研究报道 IncRNA 与恶性肿瘤的临床预后密切相关，如 PVT1的过表达可以作为结直肠癌患者的独立风险预后因子 17，而 HOTAIR 参与 多种肿瘤的表观遗传调控，可以用来预测原发性乳腺癌的转移及其患者的预后 18- 19。因此，这些在肿瘤中差异表达的尤其是具有组织特异性的 IncRNA， 有望成
24、 为肿瘤诊断、治疗及其评估肿瘤患者预后的新型分子标志物。 91H (H19的反义链 RNA)是在 H19/IGF2位点上发现的一个新的 IncRNA， 长度为 119 392 bp， 其部分序列可与母源性 IGF2基因的 H19/IGF2调控区域结合 2()，但其在肿瘤中确切的功能仍未可知。研究报道 91H 可参与 IGF2 反式调控从 而影响乳腺癌的发生这种促进 IGF2异常表达的现象提示了在 H19/IGF2区 域或许存在着一种新的调控机制。本课题组前期研究表明 IncRNA 91H 在食管鳞 状细胞癌 （ ESCC)中异常表达，并与 H19 差异甲基化区甲基化程度密切相关及 其对 IGF
25、2 的表达起抑制作用，可应用于 ESCC 的早期诊断 21。然而， 91H 在 CRC中的生物学功能及其与临床预后的关系目前国内外尚未见报道。 因此，本课题首先对 91H 进行逆转录，应用文献提供的引物，并经 BLAST 比对后进行 SYBR Green 实时荧光定量 PCR 扩增，检测 91H 在 72 例 CRC 患者 配对的癌组织及癌旁组织中的表达水平和拷贝数及其 CRC 的微卫星不稳定性， 以明确 91H 在 CRC 中的表达情况与拷贝数变异及其微卫星不稳定性的相关性， 并结合肿瘤分期、分级等临床指标进行相关性分析，同时评估了 91H 对 CRC 患 者临床预后的影响。最后，我们从体外
26、水平研究 91H 对 CRC 细胞的生长、凋亡、 迀移、侵袭等生物学行为的影响，初步探讨 91H 在 CRC 中的生物学作用，旨在 为CRC 的分子诊断和靶向治疗提供新思路。 7 南京医科大学硕士学位论文 8 南京医科大学硕士学位论文 1. 材料 1.1 结直肠癌组织的来源 本课题共纳入 72 例在南京医科大学附属南京医院普通外科和肿瘤外科就诊 并经手术切除的结直肠腺癌患者标本，均为配对的癌组织和癌旁组织 （ 距癌组 织 5 cm以上的边缘）。将手术切除的标本分为两份，一份立即置液氮中冷却，再 转移至-80C 超低温冰箱保存，用于提取 RNA 进行实时荧光定量聚合酶链反应 (Real-time
27、 quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)； 另一份常规置于 4C 冰箱保存，留作 DNA 提取以进行 PCR 等。所有患者均进行根治性手术，且术 前未进 行放化疗，术后组织标本均被病理明确诊断为结直肠腺癌，且排除其他 系统恶性肿瘤。 临床资料收集包括年龄、性别、肿瘤部位、 TNM 分期及肿瘤分级等。患者 的年龄跨度为 32-85 岁，平均年龄为 67.4512.29 岁，其中男 42 例，女 30 例； 结肠癌 52 例，直肠癌 20 例。临床病理分期依据 TNM 分期系统 （ AJCC 2009): I、 II 期 35 例， III
28、、 IV 期 37 例；有淋巴结转移者 29 例，无淋巴结转移者 43 例。CRC 组织分级：高、中分化 59 例，低分化 13 例。 我们也进行了病人的同期随访，随访以手术之日为起点，术后前 2 年每 3 个 月随访一次，术后第 3 年每半年随访一次，随访截止至 2014 年 3 月，计算 CRC 患者 3 年总生存期。本研究经本院医学伦理学委员会批准，所有受试者均在实 验前了解本实验的目的并签署知情同意书。 1.2 细胞株来源 结直肠癌细胞株 HCT-8、 HT-29、 HCT-116、 SW620 和肠黏膜上皮细胞株 FHC 购自中国科学院上海生科院细胞所。 9 2. 仪器和试剂 2.1
29、主要试剂及耗材 2.1.1 RNA 提取试剂 南京医科大学硕士学位论文 (1) Trizol (2) 无水乙醇 (3) 氯仿 (4) DEPC 水 (5) 异丙醇 2.1.2 DNA 提取试剂 E.Z.N.A. Tissue DNA Kit 2.1.3 RNA 逆转录试剂 (1) DNA Marker (2) 琼脂糖 (3) 5 xTAE 缓冲液 (4) lOxLoading buffer 2.1.4 RT-qPCR 试剂 SYBR Premix Ex Tag II 2.1.5 细胞培养试剂 (1) 胎牛血清 (2) 高糖型 DMEM 培养基 (3) 胰蛋白酶 (3) 二甲基亚砜 美国 Inv
30、itrogen 公司 上海化学试剂有限公司 上海化学试剂有限公司 北京鼎国生物技术公司 上海化学试剂有限公司 美国 Omega 公司 日本 Takara 公司 美国 Invitrogen 公司 北京天根公司 美国Invitrogen 公司 实验室配制 南京凯基生物公司 日本 Takara 公司 美国 Gibco 公司 美国 Gibco 公司 南京凯基生物公司 北京Promega 公司 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 2.1.6 琼脂糖凝胶电泳试剂 (5) 溴化乙锭 （ Ethidium bromide， EB) 10 南京医科大学硕上学位
31、论文 (4) PBS 缓冲液 南京凯基生物公司 2.1.7 细胞转染试剂 (1) Lipofectamine 2000 Transfection Reagent 2) Opti-MEM (加拿大 Invitrogen 公司 力口 Invitrogen 司 2.1.8 细胞增殖检测试剂 (1) MTT细胞增殖检测试剂盒 (2) 二甲基亚砜 (3) PBS 缓冲液 2.1.9 细胞凋亡检测试剂 南京凯基生物公司 北京 Promega 公司 南京凯基生物公司 (1) Annexin V-FITC and Propidium Iodide 加拿大 BD Biosciences 公司 (2) PBS 缓
32、冲液 南京凯基生物公司 2.1.10 细胞迁移侵袭检测试剂 (1) Matrigel 基底胶 （ 40 mg/ml) (2) 高糖型 DMEM 2.1.11 实验耗材 1.8 ml 冻存管 (2) EP 管 (3) 离心管 (4) 八连管 (5) 6、 24、 96 孔板 (6) 10、 20、 200、 1000、 5000ul 枪头 美国 Becton-Dickinson 公司 美国 Gibco 公司 美国 Coming 公司 美国AXYGEN 公司 美国 AXYGEN公司 美国 AXYGEN 公司 美国 Coming 公司 美国AXYGEN 公司 (7) PVDF 膜 北京 Millip
33、ore 公司 南京医科大学硕上学位论文 2.2 主要试剂配制 (1) PBS:分别称取如下原料，溶解于 800 ml 去离子水，充分搅拌使其溶解，后 准确定容至 1L， 调定 pH 至 7.2 7.4,高压蒸汽灭菌后室温保存备用。 NaCl 8.0g KC1 0.2g KH2P 4 0.2g Na2HP 4 2H2 1.56g 胎牛血清 ： -20 C 保存，使用之前均需 56 C 水浴 30 min 灭活。 (3) 冻存液：按下述比例配制，一般现用现配。 高糖 DMEM 培养基：胎牛血清：二甲基亚砜 =7 : 2 : 1 (4) DEPC 水： a) 浸泡实验所用器具的 DEPC 水：按下述
34、比例配制，混匀后静置 4 h， 室温 备用。 DEPC :双蒸水 = 1 : 1000 b) 用于 RNA 提取的 75%乙醇的 DEPC 水：按下述比例配制，混匀后 37 C 静置过夜，高压蒸汽灭菌后 4 C 保存备用。 DEPC 卿 1 双蒸水 25ml 无水乙醇 75ml (5) 75%乙醇：按下述比例现用现配 ， -20 C 保存备用。 DEPC :无水乙醇 = 1 : 3 (6) 5 xTAE 电泳缓冲液的配制：将 57 ml 冰醋酸， 242.2 g Tris， 100 ml EDTA 溶 液 （ 0.5M， pH=8.0) (EDTANa2.2H2Ol86.lg， NaOH21.
35、0g， 力口 ddH2 至 1000 ml)混合，稀释定容至 1L。 用前将溶液稀释 50 倍即可。 2.3 主要仪器 (1) 普通离心机 上海卢湘仪集团 (2) 冷冻高速离心机 德国 Eppendorf 公司 (3) 微型离心机 德国 Eppendorf 公司 (4) 自动平衡离心机 上海卢湘仪集团 (5) 超低温冰箱 日本三洋 MDF-382E 12 南京医科大学硕上学位论文 (1) 小型水浴锅 (2) 纯水系统 (3) 凝胶成像系统 (4) 核酸电泳系统 (5) 制冰机 (6) 高压蒸汽灭菌锅 (7) 紫外分光光度仪 (8) 温度梯度 PCR 扩增仪 (9) 移液器 (10) AL204
36、-IC 电子天平 (11) MM823ESJ-SA 微波炉 (12) WH-2 微型漩涡混匀仪 (13) 荧光定量 PCR 仪 （ 7500 型 ) (14) pH 计 (15) 液氮罐 (16) 酶标仪 (17) 生物安全柜 (18) 磁力搅拌器 常州国华仪器有限公司 美国Millipore 公司 美国 UVP 公司 美国 BIO-RAD 电流系统组合 美国 Grant XB 70 韩国大韩 WACS 60L 德国 Eppendorf 公司 德国Eppendorf 公司 德国 Eppendorf 公司 上海梅特勒 -托利多仪器有限公司 佛山美的微波电器有限公司 上海沪西分析仪器厂有限公司 美
37、国 ABI 公司 美国 METTLER TOLEDO 公司 成都 MPV 公司 美国 Bio-Rad 公司 上海力新 HFsafe-1500 上海大迈仪器有限公司 13 南京医科大学硕上学位论文 2.4 引物设计及序列、 siRNA 序列 2.4.1 普通 PCR 引物序歹 IJ 表 1.微卫星引物 基因名称 引物序列 （ 5-3 ） D2S123 F: GCTTGTCAGTAGAGTGCGCC R: CATCCAGTTGACCGAGCTTG D5S346 F: ACTCACTCTAGTGATAAATCGGG R: AGCAGATAAGACAGTATTACTAGTT D17S250 F: GG
38、AAGAATCAAATAGACAA R: GCTGGCCATATATATATTTAAACC BAT-26 F: CTGCGGTAATCAAGTTTTTAG R: AACCATTCAACATTTTTAACCC BAT-25 F: CTCGCCTCCAAGAATGTAAGT R: TCTGCATTTTAACTATGGCTC 2.4.2 RT-qPCR 引物序列 _ 表 2. 91H 引物及内参 基因名称 引物序列（ 5-3 ） 91H AAACAGGATGCCTGCCTTTA R: GGACTTTCCACCTATGGGAC (3-actin F: CAAGATCATTGCTCCTCCTGA R:
39、AGTCCGCCTAGAAGCATTTG 2.4.3 siRNA 序歹 IJ 表 3.91H 干扰序列 基因名称 干扰序列（ 5-3 ） si-91Hl GGCGUCAUUCUGAUGGGACTT si-91H2 UUCAGGAGCUUAAGAUGCUTT Negative control CGUGGGUGGAUGCAUGGAUTT 14 3. 实验方法 3.1 组织标本收集及 RNA 的提取 南京医科大学硕士学位论文 采集各研究对象的癌组织及癌旁组织， -80 C 超低温保存。 (1) 提取 RNA 的所有操作均需在 RNA 提取的专用的无 RNA 酶的操作台内进行， 移液器枪头、离心管和试
40、剂均需 DEPC 水处理后使用，以最大限度减少 RNA 的降解。 (2) 打开 4 C 低温离心机，设置好温度备用，同时计算需提取的样本数。准备双 份数量的 1.5ml 无菌无酶 EP 管，置于离心管架上备用。 (3) 组织研磨： a) 预先洗净研钵及研磨棒，并经 DEPC 水处理，高温蒸汽灭菌，于烘箱内 烘干备用。 b) 在研钵中倒入少量液氮预冷，取 50-100 mg 样本组织置入研钵中，边研 磨边加液氮，直至组织被研磨至粉末状。 (4) 加入 1 ml Trizol 到研钵中，继续研磨组织，使其与 Trizol 混勾。 (5) 静置待其液化，用移液器转移至无 RNA 酶的 1.5 ml
41、EP 管中，后加入氯仿200 (Xlo (6) 涡旋振荡 15 s， 使其充分混匀呈乳白色，室温静置 2-3 min。 (7) 4 C 12 000-14 000 g 离心 15 min， 此时管内液体分三层，即无色上清、中间 的蛋白层以及有颜色的有机下层。注意每次打开离心机，应及时关好盖子以 保证 4 C， 避免影响后续操作。 (8) 转移水相至新的 1.5 ml 无 RNA 酶的 EP 管中，每 1 ml Trizol 中需加入 500叫 异丙醇，轻微震荡混匀，室温放置 10 min。 并注意吸取水相以不吸到有机相 为宜。为确保所提 RNA 纯度，可适当预留一部分的体积。 (9) 4 C
42、12,000 g 离心 10 min， 预配清洗 RNA 的 75%乙醇（需用已高温灭菌的 DEPC 水配置）。 (10) 小心弃去上清液，每管中至少加入 1 ml 75%乙醇洗涤 RNA 沉淀，涡旋混匀。 (11) 4 C 7 500 g 离心 5 min， 小心弃去上清。 15 南京医科大学硕士学位论文 (12) 室温风干 RNA 沉淀，风干后 RNA 为无色，使用 DEPC 水溶解沉淀（依据 沉淀多少加入 20-40 左右），用枪头小心吹打混匀。 3.2 检测所提取的样本 RNA 浓度 (1) 将所测样本稀释 100 倍，即每个待测样本 1 Hi + 99 叫 DEPC 7K， 取 1叫
43、 DEPC 水进行校零。 (2) 利用紫外分光光度计检测各样本浓度。 (3) 依次检测并记录样本浓度和 A26Q/280 比值。（检测前应吸尽前一个样本留于比 色皿中的残液，并进行反复清洗，以确保不影响下一次结果）。 (4) RNA 样品八遞彻比值应在 1.8-2.0 之间最好。 (5) 具备以上条件的样本可以将其进行琼脂糖凝胶电泳，检测 28s, 18s, 5s 条带， 确定 RNA 样本是否降解。 3.3 RNA 逆转录 提取的 RNA 需测其浓度，按照浓度计算逆转录中所需 1 昭的 RNA 体积。 (1) 从 -20 C 冰箱中取出逆转录试剂盒，将酶放在冰里融化，其他试剂冰上融化， 水常
44、温融化备用。 (2) 根据所测 RNA 各样本的浓度，计算每管所需 RNA 的量，并计算出 DEPC 水用量， RNA 和 DEPC 水总体积不超过 7 叫。 注意 :RNA 反复冻融极易使其降解，一旦确定样本提取的 RNA 质量较好时， 应按照癌与癌旁配对相一致的标准尽可能的将 RNA 次性全部逆转录成用 于 RT-qPCR 的 cDNA， 如配对样本的 RNA 量较大，超过 10份逆转录的量， 考虑到逆转录的实验成本，可按 10 份的量的逆转录。 (3) 取 PCR 专用管架置于冰上，按需要摆放 200 nl 无 RNA 酶的 PCR 管并按编 号标记，移液器吸取已经计算好的 RNA 量后，将枪头垂直插入 PCR 管底， 匀速轻柔打出液体，可减少甚至不产生气泡，打完后确保枪头无明显残留， 以保证结果的稳定性。 (4) 移液器取适量 DEPC