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1、获得目的基因后获得目的基因后直接转入受体吗直接转入受体吗？基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序目的目的基因基因的的筛选与与获取取目的基因目的基因筛选方法方法获取方法取方法人工合成人工合成概念概念作用作用PCR扩增技增技术基因文基因文库 不是，游离的不是，游离的DNADNA片段进入受体细胞，片段进入受体细胞，一般会直一般会直接被分解接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的离的DNADNA片段也片段也无法无法随着细胞分裂随着细胞分裂进行复制进行复制，导致子，导致子代细胞不再含有目的基因。代细胞不再含有目的基因。1.1.为什么获得目的基因不能直接转
2、入受体细胞？为什么获得目的基因不能直接转入受体细胞？基因表达载体的构建是基因工程的基因表达载体的构建是基因工程的核心核心工作。工作。阅读课本80页的内容，回答下面问题：1 1构建基因表达载体的目的是什么？构建基因表达载体的目的是什么？2 2基因表达载体的组成有哪几部分？基因表达载体的组成有哪几部分？3 3标记基因的作用是什么？常用什么基因来作标记基因？标记基因的作用是什么？常用什么基因来作标记基因？4 4构建基因表达载体时，目的基因应在哪个位置？为什么构建基因表达载体时，目的基因应在哪个位置？为什么？5 5为什么不能将目的基因插入载体的标记基因中？为什么不能将目的基因插入载体的标记基因中？1
3、1构建基因表达载体的目的是什么？构建基因表达载体的目的是什么？使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。2 2基因表达载体的组成有哪几部分？基因表达载体的组成有哪几部分？目的基因、启动子、终止子、标记基因等。目的基因、启动子、终止子、标记基因等。质粒质粒标记基因标记基因复制原点复制原点启动子启动子终止子终止子限制酶切割位点限制酶切割位点位置：基因的上游功能：是RNA聚合酶聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录驱动基因转录的作用。位置：基因下游作用：使转录作
4、用：使转录在所需的地方停止停止下来。供目的基因插入载体中能够在受体细胞中自我复制自我复制或整合到整合到受体受体DNA上上基因表达载体的组成基因表达载体的组成3 3标记基因的作用是什么？常用什么基因来作标记基因？标记基因的作用是什么？常用什么基因来作标记基因？作用：鉴别受体细胞中是否含有目的基因常用的标记基因为抗生素抗性基因，如氨苄青霉常用的标记基因为抗生素抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因。素抗性基因、四环素抗性基因。质粒质粒4 4构建基因表达载体时，目的基因应在哪个位置？为什么？构建基因表达载体时，目的基因应在哪个位置？为什么？目的基因要目的基因要插入启动子和终止子插入启动子和终
5、止子之间之间，这是因为启动子使转录开，这是因为启动子使转录开始，是始，是RNARNA聚合酶识别和结合的聚合酶识别和结合的部位；终止子位于基因的尾端，部位；终止子位于基因的尾端，使转录终止；只有顺序正确目的使转录终止；只有顺序正确目的基因基因才能正常转录才能正常转录。5 5为什么不能将目的基因插入载为什么不能将目的基因插入载体的标记基因中？体的标记基因中？标记基因用于鉴定受体细胞是否标记基因用于鉴定受体细胞是否成功导入目的基因，以便将含目成功导入目的基因，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若有目的基因的细胞筛选出来，若有目的基因插入，则的基因插入，则标记基因被破坏，标记基因被破坏，无法进一步筛选无
6、法进一步筛选。基因表达载体构建的流程基因表达载体构建的流程同种限制酶同种限制酶或产生相同或产生相同黏性末端的黏性末端的限制酶切割限制酶切割DNA连接酶连接酶目的基因限制酶切割位点获取目的基因获取目的基因限制酶切割位点质粒重组DNA分子限制酶限制酶考点辨析1.1.限制酶的选择限制酶的选择1右右图图为为某某质质粒粒限限制制酶酶酶酶切切图图谱谱。某某基基因因不不含含图图中中限限制制酶酶识识别别序序列列。为为使使PCR扩扩增增的的该该基基因因重重组组进进该该质质粒粒，则则扩扩增增的的该该基基因因两两端端需需分分别别引入的两种限制酶的识别序列是引入的两种限制酶的识别序列是()A根据启动子和终止子的生理作
7、用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间。图中看出，两者之间存在于三种限制酶切点，但是由于Xba在质粒上不止一个酶切位点，因此为使PCR扩增的该基因重组进该质粒，扩增的该基因两端需分别引入Nde和BamH两种不同限制酶的识别序列。A.Nde和BamH B.Nde和XbaC.Xba和BamH D.EcoR和Kpn2图图1为为某某种种质质粒粒简简图图，图图2表表示示某某外外源源DNA上上的的目目的的基基因因，小小箭箭头头所所指指分分别别为为限限制制性性内内切切核核酸酸酶酶EcoR、BamH、Hind 的的酶酶切切位位点点。下下列列有有关关叙述错误的是叙述错误的是()A.在在基基因因工工程程中中若若
8、只只用用一一种种限限制制酶酶完完成成对对质质粒粒和和外外源源DNA的切割，则可选的切割，则可选EcoRB.如如果果将将一一个个外外源源DNA分分子子和和一一个个质质粒粒分分别别用用EcoR酶酶切切后后，再再用用DNA连连接接酶酶连连接接，形形成成一一个个含含有有目目的的基基因因的的重重组组DNA，此重组，此重组DNA中中EcoR酶切点有酶切点有1个个C.为为了了防防止止质质粒粒和和含含目目的的基基因因的的外外源源DNA片片段段自自身身环环化化，酶切时可使用酶切时可使用BamH和和Hind两种限制酶同时处理两种限制酶同时处理D.一一个个图图1所所示示的的质质粒粒分分子子经经EcoR切切割割后后，
9、含含有有2个个游游离的磷酸基团离的磷酸基团B载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接 反向连接1122122122111.将同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒混合后加DNA连接酶会出现的连接方式有：2.如何防止目的基因和载体的自身环化以及目的基因的反向连接？使用两种不同的限制酶：防止目的基因和载体的自身环化 防止目的基因与载体的反向连接归纳总结归纳总结选择限制酶的技巧选择限制酶的技巧(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类应选择应选择切点位于目的基因两端切点位于目的基因
10、两端的限制酶，如图甲可选择的限制酶，如图甲可选择Pst。为为避避免免目目的的基基因因和和质质粒粒的的自自身身环环化化和和随随意意连连接接，也也可可使使用用不不同同的的限限制制酶酶切切割割目目的的基基因因和和质质粒粒，如如图图甲甲也也可可选选择择用用Pst 和和EcoR 两种限制酶两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类根据质粒的特点确定限制酶的种类所所选选限限制制酶酶要要与与切切割割目目的的基基因因的的限限制制酶酶一一致致，以以确确保保具具有有相相同同的黏性末端。的黏性末端。质质粒粒作作为为载载体体必必须须具具备备标标
11、记记基基因因等等，所所以以所所选选择择的的限限制制酶酶尽尽量量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma会破坏标记基因。会破坏标记基因。考点辨析2.2.启动子、终止子、起始密码子、终止密码子辨析启动子、终止子、起始密码子、终止密码子辨析1.下列有关基因工程中启动子的说法正确的是下列有关基因工程中启动子的说法正确的是()A.启动子是一段特殊的启动子是一段特殊的RNA片段片段B.启动子是启动子是DNA聚合酶的识别和结合位点聚合酶的识别和结合位点C.启动子可以驱动基因的转录启动子可以驱动基因的转录D.启动子和起始密码子是同一概念启动子和起始密码子是同一概念B密密码码子子：
12、指指信信使使RNA上上决决定定一一个个氨氨基基酸酸的的三三个个相相邻邻的的碱碱基基。信信使使RNA上上四四种种碱碱基基的的组组合合方方式式有有64种种，其其中中，决决定定氨氨基基酸酸的的密密码子有码子有61种，另外种，另外3种是终止密码子。种是终止密码子。终止密码子：是信使终止密码子：是信使RNA上能够终止蛋白质合成的密码子。上能够终止蛋白质合成的密码子。起起始始密密码码子子：位位于于信信使使RNA上上，是是蛋蛋白白质质合合成成开开始始的的信信号号，有有两种：两种：AUG、GUG。(1)从定义上区分从定义上区分启启动动子子和和终终止止子子都都是是DNA分分子子中中具具有有调调控控作作用用的的脱
13、脱氧氧核核苷苷酸酸序序列列，而而起起始始密密码码子子和和终终止止密密码码子子都都位位于于信信使使RNA上上，分分别别是是翻翻译译的的起起始始位位置置和和终终止止位位置置，终终止止密密码码子子不不能能决决定定任任何何一种氨基酸。一种氨基酸。(2)从本质上区别从本质上区别位置位置作用作用启启动子子位于位于DNA分子上分子上RNA聚合聚合酶识别结合位点，合位点，启启动转录过程程起始起始密密码子子位于位于mRNA分子上分子上决定翻决定翻译的开始的开始终止子止子位于位于DNA分子上分子上决定决定转录的的结束束终止止密密码子子位于位于mRNA分子上分子上决定翻决定翻译的的结束束基基因因表表达达载体体的的构构建建载体构建原因体构建原因DNA片段无法片段无法稳定存在定存在DNA片段无法片段无法进行复制（行复制（遗传）载体体组成成限制限制酶切割位点切割位点启启动子子终止子止子复制起点复制起点标记基因基因位置：基因的上游位置：基因的上游功能：是功能：是RNA聚合聚合酶识别和和结合的部位，具合的部位，具有有驱动基因基因转录的作用。的作用。位置：基因的下游位置：基因的下游作用：使作用：使转录在所需的地方停止下来。在所需的地方停止下来。能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上作用：鉴别受体细胞中是否含有目的基因