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1、第第2 2节节 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 第第三三章章 基因工程基因工程本本节节聚焦聚焦基因工程的基因工程的基本操作程序基本操作程序主要包括哪几个主要包括哪几个步骤步骤？基因工程操作的每一步涉及的基因工程操作的每一步涉及的技术和方法技术和方法有有哪些哪些？一条小虫引发的科技一条小虫引发的科技大战大战(中国中国农科院棉花研究所开发抗虫棉农科院棉花研究所开发抗虫棉纪实纪实)19971997年年，我国政府首次批准商业化种，我国政府首次批准商业化种植植转基因抗虫棉转基因抗虫棉。到。到20152015年年，我国已育成，我国已育成转基因抗虫棉新品种转基因抗虫棉新品种100100多个多个
2、，减少农药用减少农药用量量4040万吨，增收节支社会经济效益万吨，增收节支社会经济效益450450亿元亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？P76 从社会中来培育转基因抗虫棉的简要过程培育转基因抗虫棉的简要过程 普通棉花普通棉花（无抗虫特性）（无抗虫特性）棉花细胞棉花细胞抗虫棉抗虫棉提取提取表达表达Bt基因基因导入导入与载体拼接与载体拼接重组重组DNA分子分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建（核心）3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定Bt基因基因苏云金杆菌苏
3、云金杆菌 P76 从社会中来一、一、目的基因的筛选与目的基因的筛选与获取获取 P76P76（一）目的基因：（一）目的基因：概念在基因工程的设计和操作中，在基因工程的设计和操作中，用于用于改变受体细胞性状改变受体细胞性状或或获得获得预期表达预期表达产物产物等的基因等的基因。实例与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。主要主要指的是指的是编码蛋白质的编码蛋白质的基因基因资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。目的基因-Bt抗虫蛋白基因思考思考:如何
4、如何筛选目的基因呢筛选目的基因呢？筛选方法筛选方法从相关的从相关的已知结构已知结构和功能清晰和功能清晰的基因中进行筛选的基因中进行筛选已 知 结 构科学家掌握了科学家掌握了BtBt基因的序列信息基因的序列信息。功 能 清 晰功 能 清 晰BtBt抗虫蛋白只在某类抗虫蛋白只在某类昆虫昆虫肠道的肠道的碱性碱性环境中才表现出毒性环境中才表现出毒性，对人对人和牲畜无影响和牲畜无影响。（二）筛选合适目的基因：（二）筛选合适目的基因：一、一、目的基因的筛选与目的基因的筛选与获取获取 P77P77利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因 先对目的基因进
5、行扩增先对目的基因进行扩增思考思考:获取一个获取一个BtBt基因之后，是否就该立即开始准备转基因操作？基因之后，是否就该立即开始准备转基因操作？抗虫基因快速获得大量抗虫基因苏云金杆菌苏云金杆菌提取提取合作合作探究：探究：请同学们自主阅读教材P76-77，小组合作思考讨论完成问题。1.1.总结出总结出PCRPCR的概念、提出者、原理、目的、优点。的概念、提出者、原理、目的、优点。2.2.结合体内结合体内DNADNA复制过程，思考复制过程，思考PCRPCR的进行需要哪些条件？所的进行需要哪些条件？所需设备是什么？需设备是什么？3.3.构建出构建出PCRPCR的大致过程。的大致过程。4.4.PCRP
6、CR扩增为什么扩增为什么需要需要引物？引物？5.5.如何对产物进行鉴定？如何对产物进行鉴定？6 6.PCRPCR技术与技术与DNADNA复制过程复制过程比较比较？一、一、目的基因的筛选与目的基因的筛选与获取获取 P77P771中文全称：2原理：3操作环境：4基本条件：聚合酶链式反应DNA半保留复制体外（PCR扩增仪/PCR仪）模板：模板：原料：原料：酶：酶：其他条件：其他条件：DNA母链4种脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合酶引物（三）利用（三）利用PCR获取和扩增目的基因：获取和扩增目的基因：一、一、目的基因的筛选与目的基因的筛选与获取获取 P77P77PCRPCR由由穆里斯穆里斯等人于等人于19
7、851985年年发明，为此，穆里斯于发明，为此，穆里斯于19931993年年获得获得诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖。5优点：可在短时间内大量扩增目的基因PCR扩增仪PCR技术所需的基本条件参与的组分在PCR中的作用 前提条件高温模板模板DNADNA4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶2 2种引物种引物一定的缓冲溶液(Mg2)打开DNA双链提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料催化合成DNA子链主要是DNA单链或RNA,使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸已知基因的核苷酸序列提供合适的酸碱度和离子，DNA聚合酶需要Mg2激活所需的基本条件（三）利
8、用（三）利用PCR获取和扩增目的基因：获取和扩增目的基因：相关信息相关信息什么是引物？引物的作用是什么什么是引物？引物的作用是什么？P77P77定义：定义：引物是一小段能与引物是一小段能与DNADNA母链的一小段碱基序列互补配对母链的一小段碱基序列互补配对的的短短单链单链核酸核酸。（长度通常为。（长度通常为20-3020-30个核苷酸）个核苷酸）作用作用：为为DNADNA聚合酶提供了游离的聚合酶提供了游离的33端端，使使DNADNA聚合酶聚合酶从引物的从引物的33端开始连接脱氧核苷酸。端开始连接脱氧核苷酸。解旋酶 由于由于DNA双链是反向平行双链是反向平行的，所以需要的，所以需要2种引物种引物
9、。作用：打开DNA双链（若是在体外可以用高温代替解旋酶打开DNA双链）耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（DNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）55 变性 复性 延伸温度上升到90以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。（三）利用（三）利用PCR获取和扩增目的基因：获取和扩增目的基因：6过程：P78-79（三）利用（三）利用PCR获取和扩增目的基因：获取和扩增目的基因：DNA聚合酶不能从头合成聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的只能
10、从引物的3端开始延伸端开始延伸DNA链。链。由于由于一个一个循环得到的循环得到的产物产物又可以作为又可以作为下一个下一个循环的循环的模板模板，因而因而每一次循环后每一次循环后目的基因的量可以目的基因的量可以增加一倍增加一倍。即成即成 形式扩增形式扩增（约为约为 ，其中，其中n n为为扩增循环的次数扩增循环的次数）。指数2n思考思考:PCRPCR扩增扩增需要需要引物的原因引物的原因？8产物进行鉴定：P797结果：P78琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳DNADNA分子具有可解离的基团，在一定的分子具有可解离的基团，在一定的pHpH下，这些基团可以带上下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，
11、正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它这些带电分子会向与它所所带电荷带电荷相反相反的电极移动的电极移动，这个过程就叫，这个过程就叫电电泳泳。P84P84PCR技术DNA复制相同点模板原料不同点解旋方式场所酶能量结果DNADNA的两条母链的两条母链四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞内（主要在细胞核内）耐高温的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子dNTP（原料）提供细胞内的ATP提供PCR技术与技术与DNA复制复制过程的比较过程的比较当堂训练3.(2021东莞)PCR是一项体外扩增是一项体外扩增DNA的技术的技术,需
12、在反应溶液中添加模板、原料、酶等物需在反应溶液中添加模板、原料、酶等物质质,通过加热通过加热(90 以上以上)使模板使模板DNA解旋解旋,冷却后在一定温度冷却后在一定温度(72 左右左右)下利用下利用DNA聚合酶聚合酶合成子代脱氧核苷酸链合成子代脱氧核苷酸链,如此循环往复如此循环往复,可使特定可使特定DNA片段以指数形式扩增。片段以指数形式扩增。与体内DNA复制相比,有关PCR技术叙述错误的是()A.以以DNA分子的一条链作为模板分子的一条链作为模板B.添加的添加的DNA聚合酶热稳定性较高聚合酶热稳定性较高C.反应溶液中无须额外添加解旋酶反应溶液中无须额外添加解旋酶D.新合成的新合成的DNA分
13、子会作为复制模板分子会作为复制模板A13.PCR一般要经过一般要经过30多次循环多次循环,从第二次循环开始从第二次循环开始,上一次循环的产物也作上一次循环的产物也作为模板参与反应为模板参与反应,由引物由引物延伸而成的延伸而成的DNA单链作模板时将单链作模板时将()A.仍与引物仍与引物结合进行结合进行DNA子链的延伸子链的延伸B.与引物与引物结合进行结合进行DNA子链的延伸子链的延伸C.同时与引物同时与引物和引物和引物结合进行子链的延伸结合进行子链的延伸D.无须与引物结合无须与引物结合,在酶的作用下从头合成子链在酶的作用下从头合成子链B【金版学案金版学案】P133P133【金版学案金版学案】P1
14、34P1343 35 53 35 53 35 53 35 5A.变性变性90以上，双链DNA解聚为单链B.复性复性50左右，两种引物与两条单链DNA结合C.延伸延伸72左右，4种脱氧核苷酸在Taq酶的作用下，合成新的DNA链3 35 53 35 53 35 53 35 53 35 53 35 53 35 53 35 5题后解法：题后解法：回归教材回归教材P78-79PCR反应过程示意图反应过程示意图第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；第二轮循环的产物第二轮循环的产物第
15、三轮的产物第三轮的产物P77-78题后解法：题后解法：回归教材回归教材P78-79PCR反应过程示意图反应过程示意图5 33 5 3 5 5 35 3引物13 5 引物23 5 5 33 5 引物25 3引物15 3引物13 5 引物23 5 引物25 3引物1目的基因思考?1 1、引物在引物在PCRPCR中能重复利用吗？中能重复利用吗？不能2 2、用用PCRPCR可以扩增可以扩增mRNAmRNA吗？吗？(P79(P79旁栏思考题）旁栏思考题）不能，由于不能，由于RNARNA不稳定，需要将不稳定，需要将RNARNA反转录为反转录为cDNAcDNA，然后再进行扩增。，然后再进行扩增。PCR应用应用新冠病毒核酸检测新冠病毒核酸检测