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1、PCR扩增仪扩增仪基因工程的基因工程的基本操作程序基本操作程序主要包括哪几个主要包括哪几个步骤？步骤？基因工程基因工程操作的每一步涉及的操作的每一步涉及的技术和方法技术和方法有哪些？有哪些？12 19971997年，我国政府首次批准商年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到业化种植转基因抗虫棉。到20152015年，年，我国已育成转基因抗虫棉新品种我国已育成转基因抗虫棉新品种100100多个，减少农药用量多个，减少农药用量4040万吨，增收万吨，增收节支社会经济效益节支社会经济效益450450亿元。亿元。【从社会中来从社会中来】在棉花植株上提取叶肉细胞，然后在苏云金在棉花植株上提取叶肉细
2、胞，然后在苏云金芽孢芽孢杆菌上杆菌上提取相提取相应的基因应的基因，在体外在体外改造和拼接改造和拼接，再将提取再将提取重组重组基因导入植物基因导入植物的叶肉的叶肉细胞的细胞的DNADNA（利用（利用基因重组基因重组技术）中，此时通过培养出愈伤组织使其技术）中，此时通过培养出愈伤组织使其进行再分化，最后通过组织培养技术得到含有抗虫基因的棉花植株。进行再分化，最后通过组织培养技术得到含有抗虫基因的棉花植株。苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌抗虫基因抗虫基因普通棉花（不抗虫）棉花细胞棉花细胞（含抗虫基因）棉花植株棉花植株提取导入与载体拼接植物组织培养（有抗虫特性）01基因工程的基本操作程序基因工程的一般操作
3、程序主要包括四个步骤：基因工程的一般操作程序主要包括四个步骤：1.目的基因的筛选与获取4.目的基因的检测与鉴定2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞基因工程的基本操作程序 02目的基因的筛选与获取1 1.目的基因目的基因(1)(1)概概念念：在在基基因因工工程程的的设设计计和和操操作作中中，用用于于改改变变_或或获获 得得预预期期_等等的的基基因因就就是是目目的的基基因因。根根据据不不同同的的需需要要，目目的的基基因是不同的，它主要是指因是不同的，它主要是指_的基因。的基因。受体细胞性状受体细胞性状表达产物表达产物编码蛋白质编码蛋白质 02目的基因的筛选与获取1 1.目的基因目的基因
4、(2 2)实例：实例：与生物与生物抗逆性抗逆性相关的基因（相关的基因（BtBt抗虫基因）抗虫基因）与与优良品质优良品质相关的基因（将大肠杆菌的赖氨酸合成关键酶相关的基因（将大肠杆菌的赖氨酸合成关键酶 基因导入小麦）基因导入小麦）与生物与生物药物药物和保健品相关的基因（和保健品相关的基因（胰岛素、干扰素基因胰岛素、干扰素基因胰岛素、干扰素基因胰岛素、干扰素基因）与与毒物降解毒物降解相关的基因相关的基因与与工业用酶工业用酶相关的基因等相关的基因等（3）基因的结构基因的结构启动子启动子终止子终止子能转录为能转录为mRNA，编码蛋，编码蛋白质的合成白质的合成终止转录终止转录起始转录起始转录编码区非编码
5、区非编码区外显子内含子：编码蛋白质的序列：编码蛋白质的序列：不编码蛋白质的序列：不编码蛋白质的序列真核生物的编码区真核生物的编码区是不连续的是不连续的内含子非编码区非编码区外显子外显子转录转录前体前体mRNA成熟成熟mRNA 加工加工 02目的基因的筛选与获取1 1.目的基因目的基因(4 4)筛选：筛选：筛选目的基因最有效的方法之一是从相关的已知筛选目的基因最有效的方法之一是从相关的已知结构和功能结构和功能清清晰的基因中进行筛选。晰的基因中进行筛选。随着随着测序技术测序技术的发展，以及的发展，以及序列数据库（序列数据库（GenBankGenBank）、序列比对序列比对工具（如工具（如BLAST
6、BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。苏云金杆菌的杀虫作用于苏云金杆菌的杀虫作用于BtBt基因有关基因有关掌握了掌握了BtBt基因的序列信息基因的序列信息对对BtBt基因的表达产物基因的表达产物-Bt-Bt抗虫蛋白有较抗虫蛋白有较为深入的了解为深入的了解苏云金杆菌制剂可防治棉花虫害苏云金杆菌制剂可防治棉花虫害BtBt基因是培育转基因抗虫基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因棉较为合适的目的基因思考：思考：1.1.BtBt抗虫蛋白的抗虫原
7、理是什么？抗虫蛋白的抗虫原理是什么？2.2.抗虫棉中的抗虫棉中的BtBt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？02目的基因的筛选与获取1 1.目的基因目的基因(5 5)获取：获取：【自主学习【自主学习合作探究】阅读合作探究】阅读P77P77相关内容，思考讨论：相关内容，思考讨论：1.1.获取目的基因的方法有哪些？获取目的基因的方法有哪些？2.PCR2.PCR的全称、操作环境、原理、目的、基本组分和条件以及各条件的全称、操作环境、原理、目的、基本组分和条件以及各条件的作用是什么？的作用是什么？一种是一种是反转录法反转录法：它是以目的基因的：它是以目的基因的mRNAmRNA为
8、模板为模板，借助，借助_酶酶合合成碱基互补的成碱基互补的单链单链DNADNA，然后在，然后在_酶酶的作用下合成双链的作用下合成双链DNADNA。另另一种方法是一种方法是化学合成法：化学合成法：即依照某一蛋白质的即依照某一蛋白质的_序列，推测出序列，推测出mRNAmRNA序列，然后按碱基互补配对原则，推测序列，然后按碱基互补配对原则，推测DNADNA的的_序列。序列。PCRPCR扩增目的基因扩增目的基因逆转录逆转录1 1.目的基因目的基因(5 5)获取：获取：A.A.人工合成目的基因人工合成目的基因DNADNA聚合聚合氨基酸氨基酸脱氧核苷酸脱氧核苷酸2.PCR2.PCR扩增目的基因扩增目的基因（
9、1 1）全称：）全称：（2 2）操作环境：）操作环境：（3 3）原理：）原理：（4 4）目的：）目的：（5 5）场所：）场所：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外（体外（PCRPCR扩增仪扩增仪/PCR/PCR仪）仪）DNADNA半保留复制半保留复制对目的基因的核苷酸序列进行大量复制对目的基因的核苷酸序列进行大量复制PCR扩增仪扩增仪在一定的在一定的_ _缓冲缓冲_ _溶液中进行，其中一般要添加溶液中进行，其中一般要添加MgMg2 2。2.PCR2.PCR扩增目的基因扩增目的基因（6 6）基本条件：）基本条件：参与的组分参与的组分在在PCRPCR中的作用中的作用DNADNA模板模板复制的模板复制的
10、模板2 2种引物种引物使使DNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的33端端开始连接脱氧核苷酸开始连接脱氧核苷酸4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶合成子代合成子代DNADNA的原料的原料催化合成催化合成DNADNA子链子链（7 7）PCRPCR扩增目的基因的扩增目的基因的过程过程变性：当温度超过变性：当温度超过_时，双链时，双链DNADNA_为单链。为单链。复性：当温度下降到复性：当温度下降到_左右时，左右时，_通过碱基互补配对通过碱基互补配对 与两条单链与两条单链DNADNA结合。结合。延伸：当温度上升到延伸：当温度上升到_左右时，溶液中的左右时，溶
11、液中的4 4种脱氧核苷酸在种脱氧核苷酸在_的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNADNA链。链。重复循环：重复循环：第一轮循环的第一轮循环的_作为第二轮反应的作为第二轮反应的_，经过，经过_三步产生第二轮循环的产物；三步产生第二轮循环的产物；鉴定：常采用鉴定：常采用_来鉴定来鉴定PCRPCR的产物。的产物。9090解聚解聚5050两种引物两种引物7272耐高耐高温的温的DNADNA聚合酶聚合酶琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳产物产物模板模板变性、复性、延伸变性、复性、延伸破坏氢键破坏氢键【核心归纳】比较【核心归纳】比较PCR扩增技术和体内扩增技术和体内DN
12、A复制的异同复制的异同项目体内DNA复制PCR扩增技术解旋方式解旋酶催化DNA在高温作用下变性解旋场所细胞内(主要在细胞核内)PCR扩增仪内酶解旋酶、DNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶温度条件细胞内温和条件需控制温度，在较高温度下进行结果DNA分子DNA片段或目的基因5 33 5 3 5 5 35 3引物13 5 引物23 5 5 33 5 引物25 3引物15 3引物13 5 引物23 5 引物25 3引物1目的基因目的基因PCR PCR 扩增的过程扩增的过程演示图演示图3 5 5 33 5 引物25 3引物15 3引物13 5 引物23 5 引物25 3引物13 5 5 3引物15 3引物1
13、3 5 引物25 3引物13 5 引物25 3引物13 5 引物23 5 引物25 3引物15 3引物13 5 引物25 33 5 引物25 3引物13 5 引物2PCRPCR扩增时，从第扩增时，从第_代代出现完整的目的基因出现完整的目的基因3 3n n代后，代后，DNADNA分子有分子有_个个n n代后，脱氧核苷酸链有代后，脱氧核苷酸链有_条条第第_代出现完整的目的基因代出现完整的目的基因n n代后，含引物的代后，含引物的DNADNA分子有分子有_个个n n代后，共消耗代后，共消耗_个引物个引物第第n n代复制，消耗了代复制，消耗了_个引物个引物n n代后，完整的目的基因有代后，完整的目的基因有_个个2 2n n2 2n+1n+13 32 2n n2 2n+1n+1-2-22 2n n2 2n-n-2n2nPCR PCR 扩增的扩增的相关计算相关计算旁栏思考题旁栏思考题用用PCRPCR技术可以扩增技术可以扩增mRNAmRNA吗？吗？