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1、第三章第三章 基因工程基因工程第第2 2节节 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导将目的基因导入受体细胞入受体细胞目的基因的目的基因的检测与鉴定检测与鉴定操作操作程序程序0101040403030202目的基因的目的基因的筛选与获取筛选与获取01目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法（常用）常用）花粉管通道法花粉管通道法 显微注射法显微注射法 CaCa2+2+处理法处理法目的基因目的基因导入导入花粉管通道法花粉管通道法（开花植物）开花植物）用微量注射器将含目用微
2、量注射器将含目的基因的的基因的DNADNA溶液直接溶液直接注入子房中注入子房中在植物受粉后的一定在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将时间内，剪去柱头，将DNADNA溶液滴加在花柱切溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊花粉管通道进入胚囊农杆菌转化法农杆菌转化法转化：转化：特点：特点：T-DNAT-DNA的特点：的特点：目的基因插入位置：目的基因插入位置：农杆菌转化法农杆菌转化法目的基因目的基因TiTi质粒质粒表表达达载载体体农农杆杆菌菌植植物物细细胞胞植物细胞植物细胞染色体染色体DNADNA新性状新性状植株植株构建构建转入转入导入导入插入插入表达表达两次拼
3、接：两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到第一次拼接是将目的基因拼接到TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上 第二次拼接（非人工操作）指被插入目的基因的第二次拼接（非人工操作）指被插入目的基因的T T-DNA-DNA 拼接到受体细胞拼接到受体细胞的染色体的染色体DNADNA上上两次导入：两次导入：将含有目的基因的将含有目的基因的TiTi质粒导入农杆菌质粒导入农杆菌 含目的基因的含目的基因的T-DNAT-DNA导入受体细胞（非人工操作）导入受体细胞（非人工操作）显微注射法显微注射法受体细胞受体细胞:原因：原因：受精卵受精卵 体积大，易操作体积大，易操作 易表现出全能性易表现出全能性构建基因
4、表达载体并提纯构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养早期胚胎培养胚胎移植胚胎移植获得具有新性状的动物获得具有新性状的动物目的基因导入微生物细胞目的基因导入微生物细胞（1 1）常用方法：常用方法：CaCa2+2+处理处理 目的：使细胞处于一种能吸收周围环境中目的：使细胞处于一种能吸收周围环境中DNADNA分子的生理状态分子的生理状态（2 2）受体细胞：受体细胞：原核细胞（常选择大肠杆菌）原核细胞（常选择大肠杆菌）优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养易于培
5、养为了改变受体细胞性状？为了获得预期表达产物？为了改变受体细胞性状？为了获得预期表达产物？利用转基因大肠杆菌生产药物的实验思路利用转基因大肠杆菌生产药物的实验思路02目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？类型类型检测内容检测内容方法方法分子水平上的检测分子水平上的检测目的基因是否导入目的基因是否导入目的基因是否转录目的基因是否转录目的基因是否表达目的基因是否表达个体水平上的鉴定个体水平上的鉴定个
6、体是否具有相应性状个体是否具有相应性状PCRPCR技术、技术、分子杂交技术分子杂交技术抗原抗原-抗体杂交技术抗体杂交技术抗虫鉴定、抗病鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定等转基因生物提取DNADNADNA作为模板作为模板PCR操作是否扩增出目的基因电泳操作PCRPCR技术检测目的基因技术检测目的基因转基因生物PCR操作是否扩增出目的基因逆转录cDNAcDNA提取RNAmRNAmRNA作为模板作为模板PCRPCR技术检测目的基因转录的技术检测目的基因转录的mRNAmRNADNADNA分子杂交流程图分子杂交流程图观察是否有杂交带观察是否有杂交带RNARNA分子杂交流程图分子杂交流程图观察是否有杂交带观察是否有
7、杂交带抗原抗原-抗体杂交技术抗体杂交技术观察是否有杂交带观察是否有杂交带苏云金芽孢杆菌提取Bt毒蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交抗虫鉴定、抗病鉴定抗虫鉴定、抗病鉴定接种棉铃虫观察性状表现，接种棉铃虫观察性状表现，或采摘抗虫棉的叶子饲喂或采摘抗虫棉的叶子饲喂棉铃虫，观察抗虫效果棉铃虫，观察抗虫效果转基因生物转基因生物鉴定方法鉴定方法成功标志成功标志抗虫植物抗虫植物抗病毒（菌）植物抗病毒（菌）植物抗盐碱植物抗盐碱植物抗除草剂植物抗除草剂植物获取目的基因产物获取目的基因产物的转基因生物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）饲喂害虫（抗虫接种实验）病毒（菌）接种实验病毒（菌）接种
8、实验一定浓度的盐水浇灌一定浓度的盐水浇灌喷洒除草剂喷洒除草剂提取细胞产物与天然产提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较品进行功能活性比较害虫死亡害虫死亡未染病未染病正常生长正常生长正常生长正常生长功能、活性正常功能、活性正常1 1、将将目目的的基基因因导导入入植植物物细细胞胞，采采用用最最多多的的方方法法是是农农杆杆菌菌转转化化法法。其其中中用用到到的的质质粒粒是是_；该该质质粒粒含含有有一一段段特特殊殊的的DNADNA片片段段，称称为为_。该该方方法法中中农农杆杆菌菌的的作用是作用是_。TiTi质粒质粒T TDNADNA感染烟草细胞，把目的感染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体基因插
9、入到烟草细胞的染色体DNADNA上上2 2、在在构构建建重重组组质质粒粒时时，和和只只用用一一种种酶酶切切割割目目的的基基因因的的两两端端及及质质粒粒相相比比，选选用用HinHindd和和SalSal两两 种种 酶酶 的的 好好 处处 是是_防止目的基因自连防止目的基因自连、质粒自连，以提高质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率带有目的基因的重组质粒的合成效率3 3、含含有有目目的的基基因因的的农农杆杆菌菌可可根根据据标标记记基基因因进进行行筛筛选选。若若农农杆杆菌菌在在含含有有氨氨苄苄青青霉霉素素和和四四环环素素的的培培养养基基上上都都可可以以生生长长繁繁殖殖，农农杆杆菌菌中中是是否否已已含含有有目目的的基基因因？_(_(填填“是是”或或“否否”)”)。为什么？。为什么？_否否含含有有目目的的基基因因的的质质粒粒中中抗抗四四环环素素基基因因被破坏被破坏课后作业：课后作业：1 1、记背相关知识点、记背相关知识点2 2、课时练大本、课时练大本3 3、课时练小本、课时练小本