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1、抗虫棉抗虫棉 1997 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到因抗虫棉。到20152015年，我国已育成转基因抗虫棉年，我国已育成转基因抗虫棉新品种有新品种有100100多个，减少农药用量多个，减少农药用量4040万吨，增收节万吨，增收节支社会经济效益支社会经济效益450450亿元。亿元。从社会中来从社会中来转基因抗虫棉（使棉铃虫死亡，左）转基因抗虫棉（使棉铃虫死亡，左）与非转基因抗虫棉（右）与非转基因抗虫棉（右） 培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的
2、构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 第一步：目的基因的筛选与获取第一步：目的基因的筛选与获取 1 1目的基因概念目的基因概念 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。根据不同的需要，目的基因是不同的，性状或获得预期表达产物等的基因。根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、它主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。工业用酶等相关的基因。Bt抗
3、虫蛋白毒性机理抗虫蛋白毒性机理Bt基因基因是培育是培育转基因转基因抗虫棉抗虫棉较为合较为合适的目适的目的基因的基因掌握了掌握了Bt基因的序列信息基因的序列信息对对Bt基因的表达产物基因的表达产物Bt抗抗虫蛋白有了较为深入的了解虫蛋白有了较为深入的了解苏云金杆苏云金杆菌的杀虫菌的杀虫作用与作用与Bt基因有关基因有关用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花害虫已有多年历史泛用于防治棉花害虫已有多年历史 第一步：目的基因的筛选与获取第一步：目的基因的筛选与获取 2 2筛选合适的目的基因筛选合适的目的基因 从相关的从相关的已知结构和功能清晰的基因已知结构和功能清晰的基
4、因中进行筛选是较为有效的方法之中进行筛选是较为有效的方法之一。随着测序技术的发展，以及序列数据库（如一。随着测序技术的发展，以及序列数据库（如GenBank）、序列比对工）、序列比对工具（如具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这也为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。也为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。 科学家为什么筛选科学家为什么筛选Bt基因作为转基因抗虫棉的目的基因基因作为转基因抗虫棉的目的基因？ 第一步：目的基因的筛选与获取第一步：目的基因的筛选与获取 3 3利用利用PCR获取和
5、扩增目的基因获取和扩增目的基因 PCR概念概念 即聚合酶链式反应，它是一项根据即聚合酶链式反应，它是一项根据DNA半保留复制半保留复制的原的原理，在体外提供参与理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。酸序列进行大量复制的技术。 PCR反应条件反应条件 反应环境：反应环境：缓冲溶液缓冲溶液，提供合适的酸碱度和某些离子（如，提供合适的酸碱度和某些离子（如Mg2+）。）。 DNA母链：含目的基因，提供母链：含目的基因，提供DNA复制的复制的模板模板。 引物：引物：2 2种，使种，使DNA聚合酶能够从引物的聚
6、合酶能够从引物的3 3端开始连接脱氧核苷酸，端开始连接脱氧核苷酸，是一小段能与是一小段能与DNA母链的一段碱基序列母链的一段碱基序列互补配对互补配对的的短单链核酸短单链核酸。 原料：四种脱氧核苷酸。原料：四种脱氧核苷酸。 酶：酶：耐高温耐高温的的DNA聚合酶，如聚合酶，如Taq酶。注：酶。注：PCR中解旋用高温代替。中解旋用高温代替。激活真核细胞和细菌的激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶聚合酶单链单链DNA或单链或单链RNA 第一步：目的基因的筛选与获取第一步：目的基因的筛选与获取 3 3利用利用PCR获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因 PCR获取和扩增目的基因的过程获取和扩增目的基因的过程
7、PCR每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步：每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步： 变性变性（9090以上以上）使）使DNA双链双链解旋解旋 冷却冷却 复性（复性（5050左右）引物与模板链结合左右）引物与模板链结合 加热加热 延伸（延伸（7272左右）左右）DNA新链由新链由5 5端向端向3 3端延伸端延伸 上述过程可以在上述过程可以在PCR扩增仪（扩增仪（PCR仪）中自动完成。仪）中自动完成。 目的基因的鉴定目的基因的鉴定 常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。的产物。 第一步：目的基因的筛选与获取第一步：目的基因的筛选与获取 /用用PCR可以扩增可以扩
8、增mRNA吗？吗？/ mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。由再进行扩增。由mRNAmRNA逆转录形成逆转录形成cDNA的过程是：第一步，逆转录酶以的过程是：第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一为模板合成一条与条与RNARNA互补的互补的DNA链，形成链，形成RNA-DNA杂交分子；第二步，核酸酶杂交分子；第二步，核酸酶H降解降解RNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链，使之变成单链链，使之变成单链DNA；第三步，以单链；第三步，以单链DNA为模板，在为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链
9、，形成双链，形成双链链DNA分子，如下图所示。分子，如下图所示。单链单链RNA杂交双链杂交双链单链单链DNA双双链链DNA逆转录酶逆转录酶核酸酶核酸酶H(RNaseH)DNA聚合酶聚合酶RNA链链DNA链链？ 第二步：基因表达载体的构建第二步：基因表达载体的构建 1 1构建基因表达载体的目的构建基因表达载体的目的 让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时使目的基因让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时使目的基因能够表达和发挥作用。能够表达和发挥作用。 2 2基因表达载体的组成基因表达载体的组成重组重组DNA分子分子目的基因目的基因标记基因标记基因终止子终止子复制原点复制原
10、点 是一段有特殊序列是一段有特殊序列结构的结构的DNA片段，位于片段，位于基因上游，紧挨转录的基因上游，紧挨转录的起始位点，是起始位点，是RNA聚合聚合酶识别和结合的部位。酶识别和结合的部位。启动子启动子 也是一段有特殊序列结构也是一段有特殊序列结构的的DNA片段，位于基因下游，片段，位于基因下游，使转录在所需要的地方停下来。使转录在所需要的地方停下来。 第二步：基因表达载体的构建第二步：基因表达载体的构建 3 3基因表达载体的构建基因表达载体的构建 首先用一定的限制酶首先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切割载体，使它出现一个切口；然后用切口；然后用同种限制酶同种限制酶或能或能产生相同末端
11、产生相同末端的限制的限制酶切割含有目的基因的酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用片段；再利用DNA连连接酶将目的基因片段拼接接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就到载体的切口处，这样就形成了一个重组形成了一个重组DNA分子。分子。 第三步：将目的基因导入受体细胞第三步：将目的基因导入受体细胞 构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。 1 1花粉管通道法花粉管通道法我国科学家独创我国科学家独创 方法一：用微量注射器将含目的基因的方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。溶液直接注入子房中。 方法二：
12、也可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将方法二：也可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNADNA溶液溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 第三步：将目的基因导入受体细胞第三步：将目的基因导入受体细胞 2 2农杆菌转化法农杆菌转化法 转化的概念转化的概念 指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。稳定和表达的过程。 适用的生物适用的生物 主要是双子叶植物和裸子植物。主要是双子叶植物和裸子植物。 原理原理 农农杆菌细胞内含有杆菌细胞内含有Ti质粒质
13、粒，当，当它侵染它侵染植物细胞后，能将植物细胞后，能将Ti质粒上的质粒上的T-DNA转转移到被侵染的细胞，移到被侵染的细胞，并且并且将其将其整合到该整合到该细胞的染色体细胞的染色体DNA上上。根据农杆菌的这。根据农杆菌的这种特点，种特点，如果将如果将目的基因插入目的基因插入Ti质粒的质粒的T-DNA中中，通过，通过农杆菌的转化作用，就可农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。以使目的基因进入植物细胞。 第四步：目的基因的检测与鉴定第四步：目的基因的检测与鉴定 目的基因进入受体细胞，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过目的基因进入受体细胞，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴
14、定才能知道。检测与鉴定才能知道。 1 1分子水平的检测分子水平的检测 利用利用PCR等技术等技术检测转基因生物的检测转基因生物的DNA中是否插入了目的基因。中是否插入了目的基因。 利用利用PCR等技术等技术检测转基因生物的检测转基因生物的DNA中的目的基因是否转录出了中的目的基因是否转录出了mRNA。 利用利用抗原抗体杂交技术抗原抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出了蛋白质。检测目的基因是否翻译出了蛋白质。 2 2个体生物学水平的鉴定个体生物学水平的鉴定 对转基因生物进行抗性接种实验，检测其是否具有抗性及抗性程度；对转基因生物进行抗性接种实验，检测其是否具有抗性及抗性程度；或比较基因工程产品与天
15、然产品的功能活性是否相同。或比较基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同。 阅读教材阅读教材P77、P82页相关内容，分析基因工程基本操作中获取目的基页相关内容，分析基因工程基本操作中获取目的基因的方法、将目的基因导入受体细胞的方法。因的方法、将目的基因导入受体细胞的方法。 1 1获取目的基因的方法获取目的基因的方法 利用利用DNA合成仪合成仪人工合成目的基因人工合成目的基因的方法适合长度较小的基因。的方法适合长度较小的基因。 利用利用PCR获取和获取和扩增目的基因扩增目的基因的方法，既可以扩增已得到的基因或的方法，既可以扩增已得到的基因或DNA片段，也可以用来扩增很长的片段，也可以用来扩增很
16、长的DNA分子中的目的基因。用该方法的前分子中的目的基因。用该方法的前提是提是“要有一段已知目的基因的核苷酸序列要有一段已知目的基因的核苷酸序列”，即，即要知道目的基因边界的要知道目的基因边界的碱基序列作为引物碱基序列作为引物。 通过通过构建基因文库来获取目的基因构建基因文库来获取目的基因，基因文库包括，基因文库包括（包（包含了一种生物的含了一种生物的）和）和（包含了一种生物的（包含了一种生物的，其基因是通过其基因是通过“反转录法反转录法”获得的）。获得的）。科学思维训练科学思维训练科学思维训练科学思维训练 阅读教材阅读教材P77、P82页相关内容，分析基因工程基本操作中获取目的基页相关内容，
17、分析基因工程基本操作中获取目的基因的方法、将目的基因导入受体细胞的方法。因的方法、将目的基因导入受体细胞的方法。 2 2将目的基因导入受体细胞的方法将目的基因导入受体细胞的方法 受体细胞为植物细胞受体细胞为植物细胞 花粉管通道法；农杆菌转化法。花粉管通道法；农杆菌转化法。 受体细胞为动物细胞受体细胞为动物细胞 将目的基因导入动物将目的基因导入动物受精卵受精卵最常用的一种方法是利用最常用的一种方法是利用显微注射显微注射将目的将目的基因注入动物的受精卵中。基因注入动物的受精卵中。 受体细胞为原核生物受体细胞为原核生物 如以如以大肠杆菌大肠杆菌为受体细胞，先用为受体细胞，先用Ca2+处理，使其处于一
18、种处理，使其处于一种能吸收周围能吸收周围环境中环境中DNA分子的生理状态分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。，然后再将重组的基因表达载体导入其中。八氢番茄红素合酶（其基因用八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示）和胡萝卜脱饱和酶（其基因用表示）和胡萝卜脱饱和酶（其基因用crt表示）参与表示）参与-胡萝卜素的合成。胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和和crt基因转入水稻，基因转入水稻，使水稻胚乳中富含使水稻胚乳中富含-胡萝卜素，由此生产出的大
19、米称为胡萝卜素，由此生产出的大米称为“黄金大米黄金大米”。请。请根据以上信息回答下列问题。根据以上信息回答下列问题。 科学家在培育科学家在培育“黄金大米黄金大米”时时，将，将crt 和和psy基因导入含基因导入含pmi基 因基 因 的 质 粒 中 ， 构 建 了的 质 粒 中 ， 构 建 了 质 粒质 粒pSYN12424。该项研究的目的基因。该项研究的目的基因是是_，标记基因是，标记基因是_,_,质粒质粒pSYN12424的作用的作用crt 和和psy基因基因pmi基因基因是是_。将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞八氢番茄红素合酶（其基因用八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示）和胡
20、萝卜脱饱和酶（其基因用表示）和胡萝卜脱饱和酶（其基因用crt表示）参与表示）参与-胡萝卜素的合成。胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和和crt基因转入水稻，基因转入水稻，使水稻胚乳中富含使水稻胚乳中富含-胡萝卜素，由此生产出的大米称为胡萝卜素，由此生产出的大米称为“黄金大米黄金大米”。请。请根据以上信息回答下列问题。根据以上信息回答下列问题。 在构建质粒载体时，目的在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？的识别序列？为什么？ 不能。如果目的基因序列中含不能。如果目的基因序列中含有限制酶的识别序列，则限制酶可有限制酶的识别序列，则限制酶可能会将目的基因破坏。能会将目的基因破坏。