《【课件】基因工程的基本操作程序（第1课时） 课件 2021—2022学年高二下学期生物人教版选择性必修3.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《【课件】基因工程的基本操作程序（第1课时） 课件 2021—2022学年高二下学期生物人教版选择性必修3.pptx（32页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、3.2 基因工程基因工程的基本操作程序（课时的基本操作程序（课时1）教学目标1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。3.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。基因工程新课导入 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？转基因抗虫棉与普通棉花转基因抗虫棉与普通棉花基因工程的基本操作2.基因表达载体的构建1.目的基因的筛选与获取3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的 检测与鉴定Bt基因Ti质粒重组D
2、NA分子将目的基因插入染色体DNA中基因工程的基本操作原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区启动子：启动子：RNARNA聚合酶的识别和结合聚合酶的识别和结合位点位点 开始转录开始转录编码区编码区终止子终止子：终止：终止转录转录非编码区组成：编码区上游与编码区下游功能：不能编码蛋白质，调控调控遗传信息的表达启动子：RNA聚合酶结合位点 转录起始的信号终止子：终止RNA的合成编码区：编码蛋白质的合成基因工程的基本操作 科学工作者分离得到了某科学工作者分离得到了某原核生物原核生物基因，并将其解离成两条单链。基因，并将其解离成两条单链。现让其中一条链与由该基因转录而来的信使现让其中一条链与
3、由该基因转录而来的信使RNARNA杂交配对，结果如图所示。杂交配对，结果如图所示。非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区编码区信使信使RNARNA基因的一条链基因的一条链原核细胞的基因结构基因工程的基本操作真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区内含子 外显子 启动子终止子编码区上游 编码区下游 编码区：间隔的、不连续的有外显子、内含子之分间隔的、不连续的外显子：内含子：数量关系：外显子=内含子+1 能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列基因工程的基本操作真核细胞基因编码区中的内含子不
4、编码蛋白质，但表达时是否转录？成熟信使成熟信使RNARNA对应基因的一条链对应基因的一条链编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区思考：从基因组文库中获得的胰岛素基因（含内含子），若以大肠杆菌作为受体细胞却未得到对应的胰岛素，其原因可能是 。胰岛素基因含内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出胰岛素基因工程的基本操作原核细胞真核细胞不同点编码区是_的编码区是间隔的、_的相同点都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的_区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较（2）编码相同数目
5、氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码（1）非编码序列：包括非编码区和内含子思考2：【目的基因】在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因、人干扰素基因等。如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。目的基因的筛选与获取目的基因获取目的基因的方法1.人工合成目的基因。2.通过构建基因文库来获取目的基因。3.常用 PCR 特异性地快速扩增目的基因。基因文
6、库基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。部分基因文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。基因组文库部分基因文库：主要是cDNA（互补DNA）文库目的基因的筛选与获取基因组文库cDNA文库目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取基因组文库和部分基因文库的比较基因组文库和部分基因文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以目的基因的筛选与获取利用PCR获取和扩增目的基因PCR扩增仪PCR是_的缩写，是一项根据_的原理，在_提供参与DNA复制的_与_，
7、对_进行_的技术；PCR技术：聚合酶链式反应DNA半保体外各种组分反应条件目的基因的核苷酸序列大量复制全称聚合酶链式反应DNA半保留复制体外（PCR扩增仪/PCR仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制可以在短时间内大量扩增目的基因留复制原理操作环境目的优点：目的基因的筛选与获取PCR的条件DNA（含目的基因）模板。分别与模板DNA相结合的两种引物。A、T、G、C四种脱氧核苷酸。耐高温的DNA聚合酶。稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）。能严格控制温度的温控设备。一小段（20-30个）能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。脱氧核苷三磷酸（dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP
8、）耐高温的Taq DNA聚合酶真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。检测方法完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定产物。目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。35DNA母链135DNA母链235引物135引物2引物？35DNA母链135DNA母链2引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物用于PCR的引物长度通常为2030个核苷酸。引物结合在模板链的3端目的基因的筛选与获取3 35 53 35 53 35 53 35 5A.变性 当温度上升到当温度
9、上升到9090以上以上时，时，双链双链DNADNA解聚为单链解聚为单链B.复性当温度下降到当温度下降到5 500左右左右时，时，两种引物通过两种引物通过碱基互补配对碱基互补配对与两条单链与两条单链DNADNA结合结合C.延伸当温度上升到当温度上升到7272左右左右时，时，溶溶液中的液中的4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸在在耐高温耐高温的的DNADNA聚合酶聚合酶的作用下，根据的作用下，根据碱碱基互补配对原则基互补配对原则合成新的合成新的DNADNA链链3 35 53 35 53 35 53 35 53 35 53 35 53 35 53 35 5PCR反应过程目的基因的筛选与获取第一轮循环的产物
10、作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物。第二轮循环的产物第三轮的产物完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。目的基因的筛选与获取PCR的结果由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。指数2n7.PCR产物的鉴定常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。【三点提醒】在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DN
11、A的合成提供能量。引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段；PCR引物一般为DNA片段。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2。脱氧核苷三磷酸dATP与ATP在结构上有什么区别？dATP为什么能用作DNA复制的底物？如图所示，ATP结构中的五碳糖为核糖，而dATP结构中的五碳糖为脱氧核糖。ATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤核糖核苷酸，所以ATP是转录的底物；同理，dATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，所以dATP可以用作DNA复制的底物。目的基因的筛
12、选与获取比较项目PCR细胞核内DNA复制场所试管中细胞内方式半保留全连续局部区域复制半保留半不连续全链复制起始位点引物3端复制起始位点酶仅一种DNA聚合酶（Taq酶）多种酶反应条件温度变幅大温和解旋高温解旋解旋酶解旋引物DNA片段，保留在复制的子链中RNA片段，不保留在复制的子链中产物引物界定的片段核基因组循环次数人为设置与细胞分裂同步联系模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）酶:均需DNA聚合酶引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成PCR技术与细胞内DNA复制的比较目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取用PC
13、R可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。逆转录酶逆转录酶以以RNARNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNARNA互补的互补的DNADNA链链，形成，形成RNA-DNARNA-DNA杂交分子杂交分子；核酸酶核酸酶H H降解降解RNA-DNARNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNARNA链链，使之变成，使之变成单链单链DNADNA；以单链以单链DNADNA为模板，在为模板，在DNADNA聚合酶聚合酶的作用下合成另一条互补的的作用下合成另一条互补的DNADNA链，形成链，形成双链双链DNADNA分子分子，即，即cDNAcDNA获取了足够量的Bt基因后
14、，下一步就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使Bt基因能够表达和发挥作用。构建基因表达载体（核心工作）基因表达载体由哪些部分组成基因表达载体的构建目的基因：启动子：终止子：标记基因：控制特定性状或表达特定产物。位于基因的首端,是RNA聚合酶结合位点，基因转录的开始。位于基因的末端，终止转录。检测目的基因是否导入受体细胞，筛选含有目的基因的受体细胞。复制原点：DNA聚合酶结合位点。基因表达载体的构建基因表达载体的组成基因表达载体的构建启动子终止子起始密码子终止密码子【区分两组概念】位于基因上位于mRNA上翻译的起始点翻译的终点转录的起始点转录的终点本身不转录决定氨基酸不决定
15、氨基酸用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口，露出黏性末端。用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。将切下的目的基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。基因表达载体的构建过程基因表达载体的构建请结合下图，回答问题：（1）构建基因表达载体时，能否用Sma限制酶切割质粒？为什么？不能因为Sma切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。基因表达载体的构建（2）只使用EcoR分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？如果能有何弊端？能质粒、目的基因发生自身环化；
16、质粒与目的基因会发生反向连接。基因表达载体的构建（3）与只使用EcoR相比较，使用BamH和Hind两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；还可以防止目的基因与载体的反向连接。载体与表达载体区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。工具酶：限制酶、DNA连接酶，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。基因表达载体的构建基因表达载体构建u基因表达载体的组成启动子目的基因终止子标记基因复制原
17、点u基因表达载体构建的过程一般用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段，再用DNA连接酶把两者连接。目的基因的筛选与获取u利用PCR技术获取和扩增cDNA文库u从基因文库中获取基因组文库课堂小结巩固练习1下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是 ()A二者子链的延伸方向相同，均为5端3端 B二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋 C体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量 D二者遵循的碱基互补配对原则相同B2图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，Amp R表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是 ()A在构建重组质粒时，可用Pst和Hind切割质粒和外源DNAB在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因C若只用Pst处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接D导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长D