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1、 第2节 基因工程的基本操作程序抗虫棉的培育过程抗虫棉的培育过程2.基因表达载体的构建1.目的基因的筛选与获取3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的 检测与鉴定Bt基因Ti质粒重组DNA分子将目的基因插入染色体DNA中 从社会中来基因工程的基本操作程序：基因工程的基本操作程序：v获：目的基因的筛选与获取v构：基因表达载体的构建v导：将目的基因导入受体细胞v检：目的基因的检测和鉴定（核心）一、基因工程的基本操作程序一、基因工程的基本操作程序受体生物受体生物 植物植物 动物动物 微生物微生物导入方法导入方法三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1.1.将目的基因导将目的基因导入入植
2、物细胞最常用的方法是农杆菌转化法。植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法。（用于双子叶植物）（用于双子叶植物）三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1.1.将目的基因导将目的基因导入入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法。植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法。（用于双子叶植物）（用于双子叶植物）（1 1）农杆菌的特点：）农杆菌的特点：农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植感染双子叶植物和裸子植物物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。，而对大多数单子叶植物没有感染能力。当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量
3、酚类化合物，吸引农当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的并整合到受体细胞的DNA上。上。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞目的基因插入到目的基因插入到农杆菌杆菌Ti质粒上，粒上，形成重形成重组DNA重重组DNA转入杆菌入杆菌农杆菌侵入植杆菌侵入植物将目的基因物将目的基因带入植物入植物细胞胞含外源目的基因含外源目的基因的重的重组DNA整合整合到植物到植物细胞的基胞的基因因组中中目的基因目的基因遗传特性特性稳定定
4、维持持和表达和表达（2 2）农杆菌转化步骤：）农杆菌转化步骤：四、将目的基因导入受体细胞四、将目的基因导入受体细胞2.2.花粉管通道法花粉管通道法 在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加加DNADNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。3.3.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞(1)方法：显微注射法方法：显微注射法提纯提纯含目的基因表达载体含目的基因表达载体受精卵受精卵显微注射显微注射移植移植到输卵管或子宫到输卵管或子宫受精卵发育
5、受精卵发育新性状动物新性状动物（2）操作操作:显微注射技术显微注射技术4.将目的基因导入微生物细胞（1 1）微生物作受体细胞原因：）微生物作受体细胞原因：（2 2）常用法）常用法：CaCa2+2+处理处理常用菌常用菌：大肠杆菌大肠杆菌（增加细胞壁的透性，与细胞膜无关）（增加细胞壁的透性，与细胞膜无关）（3）过程：）过程：CaCa2+2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态细感受态细胞吸收胞吸收DNADNA繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。Ca2+感受态细胞吸收受体生物受体生物 植物植物 动物
6、动物 微生物微生物受体细胞受体细胞导入方法导入方法受精卵受精卵体细胞体细胞受精卵受精卵细胞细胞/个体个体农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注显微注射技术射技术用用CaCa2+2+处理处理感受态细胞感受态细胞三、将目的基因导入受体细胞（小结）三、将目的基因导入受体细胞（小结）检测检测鉴定鉴定检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNA检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA 上是否插上是否插 入了目的基因入了目的基因四、目的基
7、因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定 检查是否成功检查是否成功1 1、检测转基因生物、检测转基因生物染色体染色体DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因 首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNADNA；（1 1）方法方法:DNADNA分子杂交分子杂交（2 2）过程）过程:将含目的基因的将含目的基因的DNADNA片段用放射性同位素等作标记片段用放射性同位素等作标记,以此做以此做探针探针；使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出若显示出杂交带杂交带,表明表明目的目的 基因已插入染色体基因已插入染色体DNADNA中。中。（一）检测（一）检
8、测1515N N N N1515N N N N变性变性变性变性变性变性变性变性2 2 2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNAmRNAmRNA方法方法:分子杂交分子杂交过程过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNAmRNA杂交杂交,若出现杂交带若出现杂交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNAmRNA。3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗原抗原抗原-抗体杂交抗体杂交抗体杂交抗体杂交蛋
9、白质蛋白质脱分化脱分化提取提取苏云金杆菌苏云金杆菌Bt毒素蛋白毒素蛋白抗体抗体 出现出现杂交带杂交带鉴定鉴定 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等例：例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。基因并得到表达。五、目的基因的检测与鉴定（小结）五、目的基因的检测与鉴定（小结）3.2 基因工程的基本操作程序（四个步骤）四个步骤）目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取基
10、因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定有了目的基因，我们才能赋予一种有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。并可进行遗传、表达和发挥作用。载体进入受体细胞稳定表达，才能载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。细胞中稳定遗传和正确表达。前提前提核心核心关键关键保证保证