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1、农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology2006,14(6):911916*基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.30471176）资助。作者简介：姜玉新（1971），男，博士研究生。E-mail：.*通讯作者。Author for correspondence。教授，博士生导师，主要从事植物病理与分子生物学。E-mail：.收稿日期：2006-03-16接受日期：2006-04-08 研究论文 水稻 OsBTB 蛋白在非亲和/亲和互作中表达方式的初步研究*姜玉新，李德葆*(浙江大学生物技术研究所，杭州 310029)摘要：为了解水稻 Os
2、BTB 蛋白在非亲和/亲和互作中的表达情况，构建含全长基因的原核表达载体，经诱导表达及纯化获得 OsBTB 蛋白。以 OsBTB 蛋白为抗原制备兔多克隆抗体，经间接 ELISA 法测定抗体效价为 1颐2 000。Western blot 分析确认该抗体与 OsBTB 蛋白可以特异结合。应用该抗体检测受不同稻瘟病菌(生理小种侵染的相应水稻(品系中 OsBTB 蛋白的表达，结果表明 OsBTB 蛋白的表达方式呈多样性，该蛋白在非亲和反应中的表达时间明显早于其在亲和反应中的表达。免疫胶体金技术确认 OsBTB 蛋白存在于细胞核内。关键词：OsBTB 蛋白；多克隆抗体；非亲和/亲和互作；细胞学定位中图
3、分类号：S188，S435.111；文献标识码：A；文章编号：1006-1304（2006）06-0911-06A Preliminary Investigation on the Expression of Rice OsBTB Protein in theIncompatible/Compatible Interactions between Rice andJIANG Yu-xin,LI De-bao*To understand the expression of rice OsBTB protein in the incompatible/compatible interactions
4、 between rice and,recombinant prokaryotic expression vector containing full-length sequence of open reading frame fromgenewas constructed.Polyclonal anti-OsBTB rabbit antibody has been successfully prepared by using purified OsBTB protein as immuno-gen.The titer of antiserum against OsBTB was about
5、1:2000 using ELISA.Western blotting analysis showed that the antiserum couldbe binded to the expression OsBTB protein specifically.The OsBTB expression pattern in different rice(lines inducedby correspondingisolates displayed diversities when detected by using anti-OsBTB antiserum.OsBTB proteinwas e
6、xpressed earlier noticeably in incompatible interaction than that of compatible.Immuno-gold labeling test was performed,and itwas found that the protein localized in the nuclei ofinfected rice cellsOsBTB protein;polyclonal antibody;incompatible/compatible interaction;cellular localizationBTB/POZ(BR-
7、C,ttk and bab(Zollman,1994)or Pox virus and Zinc finger(Aravind andKoonin,1999)蛋白结构域位于 C2H2类锌指转录因子的 N 末端区域，含该结构域的家族蛋白多定位于细胞核(Cao.,1997;Sakai,2000;Woodger,2004)。植物中已被鉴定的含该结构域的功能蛋白具重要生物学功能，如参与调节病程相关(pathogenesis-related,PR)基因表达(Cao,1997;Despr佴s,.,2000)、向光性反应(Sakai2000;Motchoulski and Liscum,1999)和激素应答
8、(Woodger,2004)等。在前期工作中，本实验室从稻瘟病菌诱导的水稻近等基因系 H7R/H7S 中克隆完成一个编码含 BTB 结构域蛋白的全长基因(庄晓峰等，2005)。根据基因对基因假说，水稻品种和稻瘟病菌特异生理小种之间的非亲和性互作和亲和性互作主要由二者的遗传特性决定的(Flor,1971;Valent andChumley,1991)。非亲和互作中，水稻可快速识别侵染的病原菌并激活抗性信号通路(包括参与调节抗性反应的转录因子)和抗性基因及 PR 基因表达从PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 农 业 生 物 技 术 学 报2006 年而产生抗性反应(Dix
9、on and Lamb,1990;Maleck2000;Schenk,2000;Chen2002)；相比较而言，亲和互作则是水稻对病原菌侵染触发的反应较迟进而感病。一个典型的非亲和反应中，参与调节抗病反应的转录因子和抗性基因及 PR 基因的mRNA 水平在接种后的短时间内持续增强表达(Taoet al.,2003)，如基因(Wang,1999)、葡聚糖酶()基因和基因(Kim.,2004)、几丁质酶()基因(Mauch.,1988)以及(non-expressor of pathonenesis-related genes 1)基因(Cao,1997;Sakai,2000)；而这些基因在亲和互
10、作中却不表达或低水平表达。这种表达特征也反映在蛋白水平，研究发现一些 PR 蛋白如 PR-2 和 PR-10在水稻与稻瘟病菌的非亲和互作中的表达增量时间要早于亲和互作(Kim.,2004)。应用 RNA 斑点杂交检测基因在不同水稻品系与相应稻瘟病菌生理小种的非亲和/亲和互作(incompati-ble/compatible interaction)中的表达情况，结果也表明在 mRNA 水平该基因在非亲和互作中的反应时间明显早于亲和互作(庄晓峰等，2005)。但该基因在非亲和/亲和互作中蛋白表达水平情况尚不清楚。为探索基因的生物学功能，本实验构建了含全长基因的原核表达载体，经诱导表达、纯化获 O
11、sBTB 蛋白。以 OsBTB 蛋白为抗原制备完成兔抗多克隆抗体并进行了鉴定。利用该抗体应用Western blot 方法检测不同水稻品系与相应的稻瘟病菌生理小种互作过程中该蛋白的表达情况。同时利用胶体金免疫技术对该蛋白进行亚细胞定位。1 材料和方法1.1工具酶及化学试剂pGEM-T Easy 克隆试剂盒、玉和玉限制性内切酶、1 kb DNA 分子量标准、中等分子量蛋白分子量标准、-DNA 聚合酶,T4DNA 连接酶均购自 Promega 公司(美国)；Ni+NTA 亲和层析柱购自Invitrogen 公司(美国)；硝酸纤维素膜购自 Amer-sham Pharmacia 公司(美国)；二抗
12、HRP-羊抗兔 IgG、AP-羊抗兔 IgG 购自 Sigma 公司(美国)。其余试剂均为分析纯。1.2 载体、宿主菌和水稻材料含 全 长基 因 的 质 粒(http:/www.estarray.org，编 号 为 J001E09，GenBank 登 录 号BI810202)、原核 表 达载 体 pET28a、大 肠 杆 菌()DH5琢 和 BL21(DE3)菌株由本实验室保存。4 种水稻()材料和 4 个不同生理小种的稻瘟病菌()菌株由浙江省农业科学院提供，水稻品系嘉兴 02-03 和中早 27 抗稻瘟病菌生理小种 01-14、02-4-2 和 02-9-1；浙 205 和台早 265 抗稻
13、瘟病菌生理小种 01-14。接种实验按常规方法进行：于水稻秧苗 4 叶期喷雾接种稻瘟病菌孢子，浓度为 3105个/mL，添加 0.02%吐温-20，分别于接种后 0、4、8、12 和 24 h 剪取水稻叶片为后续实验材料。用 0.02%吐温-20 水溶液喷雾的水稻材料为平行对照。表 1 统计了接种 1 周后不同品系水稻的发病状况，与水稻的抗性特征相符合。表 1 不同水稻品系发病等级的统计结果Table 1.The disease grades of different rice lines inoculated bycorrespondingisolates1.3原核表达载体 pET28a-的
14、构建根据已测基因序列设计特异引物：BTB-F：5-CTAGCTAGCATGGCCGGGAGCGAGGCGGCG-3；玉BTB-R：5-GGCCTCGAGTCAGACAGTGGGTTGCTTTAT-3。玉以含基因的质粒(J001E09)为模板进行PCR 扩增，将扩增所获 PCR 产物克隆至 pGEM-TEasy 载体并测序鉴定。重组质粒经玉和玉双酶切后回收全长基因，定向插入于pET28a 表达载体后经酶切鉴定获得阳性克隆。DNA 测序以确证重组原核表达载体 pET28a-中所携带基因的读码框序列。1.4OsBTB 蛋白的原核表达、纯化及抗体制备1.4.1OsBTB 蛋白的原核表达与纯化将重组载体
15、 pET28a-和 pET28a 空载体分别转入大肠杆菌 BL21(DE3)菌株，挑取单克隆接种到含卡那霉素(50 滋g/mL)的 LB 液体培养基于 37 进行一级培养 12 h，按 1颐100 的比例将培养物再次进行二级培养，250 r/min 振荡培养至0.5 时加入 IPTG至终浓度为 1 mmol/L 并诱导培养 4 h，离心收集菌体。加入 1SDS-PAGE 上样缓冲液，沸水中煮 510 min，12 000 r/min 离心后取上清 10 滋L 进行SDS-PAGE 电泳分析，其余上清用 Ni+NTA 亲和层析柱纯化目的蛋白，纯化方法按产品说明书进行。1.4.2OsBTB 蛋白抗
16、体的制备实验动物选择健生理小种嘉兴 02-03中早 2727 浙 205台早 265IsolatesJiaxing 02-03Zhongzao 27 Zhe 205Taizao 26501-1402-4-202-9-103-1-10006000605670546912PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 第 6 期姜玉新等：水稻 OsBTB 蛋白在非亲和/亲和互作中表达方式的初步研究康的成年雄性新西兰白兔，首次抗原剂量为 200 滋g/只，抗原在加等体积福氏完全佐剂(不完全佐剂中含终浓度为 10 mg/mL 的卡介苗)充分乳化后，采用背部皮内多点注射免疫。3 周后以相同
17、方法进行第 2次免疫(抗原剂量减半，用不完全佐剂(液体石蜡颐羊毛脂17颐3)，之后隔 34 周加强免疫 1 次，共加强2 次。于最后 1 次免疫后 8 d，颈动脉插管放血，分离血清，置70保存。1.5 兔抗 OsBTB 抗体的鉴定1.5.1 效价测定 采用间接 ELISA 法，首先将浓度为 1 mg/mL 的 OsBTB 抗原用包被液(15 mmol/LNa2CO3,35 mmol/L NaHCO3,pH 9.6)稀释 1 000 倍后100 滋L/孔包被 96 孔酶联板，4 过夜；PBST(35mmol/L Na2HPO4,1.5 mmol/L KH2PO4,136 mmol/LNaCl,3
18、 mmol/L KCl，0.05%吐温-20，pH 7.2)洗涤 3次，加入 5%脱脂奶粉封闭液 150200 滋L/孔，37封闭 12 h；加入 100 滋L/孔倍比稀释的多克隆抗体，37温育 12 h；PBST 洗涤 3 次，加入 100滋L/孔辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔 IgG(1颐1 000)，37 温育 12 h；PBST 洗涤 35 次，加入 100 滋L/孔新配制的底物溶液，37 显色 30min。加入 50 滋L/孔 2 mol/L H2SO4，终止反应。随后在酶联仪上测定90值，求出阴性对照值的平均值，若样品值2N，则视为阳性反应，否则为阴性反应。阳性反应孔的最高
19、稀释度为抗体的效价。1.5.2Western blot 鉴定取 50 滋L 大肠杆 菌BL21(DE3)诱导表达所裂解的 OsBTB 蛋白粗提物，与等体积的 2SDS 加样缓冲液混合，100 沸水浴 510 min，冰浴冷却并进行 SDS-PAGE 电泳(分离胶浓度为 12.5%)。将蛋白转移至硝酸纤维膜，电转移印迹方法按 Bio-Rad 公司提供的说明书进行。转移结束后，以 5%脱脂牛奶 37 封闭转移膜 1 h，加入 2 500 倍稀释液的制备抗体，室温孵育 1 h 后洗膜，再用 AP 酶标二抗(1颐10 000)室温孵育 1 h，洗膜后用 NBT/IBCP 底物进行显色反应。当阳性条带出
20、现，立即用蒸馏水漂洗以中止反应，拍照并记录结果。设 2 次独立的重复试验以验证结果的可靠性。1.6Western blot 检测 OsBTB 蛋白在水稻中的表达1.6.1 水稻叶片总蛋白的提取取约 0.1 g 水稻叶片，加入液氮研磨成粉末后加蛋白提取缓冲液 200滋L(10 mmol/L Tris-HCl，0.02%NaN3，0.001PMSF，pH 8.0)于冰浴中研成匀浆；室温下 5 000r/min 离心 10 min，取上清液，参照 Bradford(1976)的方法进行蛋白定量并调整各样品的浓度使之达到一致。1.6.2Western blot 分析上述水稻叶片总蛋白提取物加等体积的
21、2上样缓冲液(100 mmol/LTris-HCl(pH 6.8)，200 mmol/L DTT，4%SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油)后煮沸处理 10 min。经 10 000r/min 离 心 10 min 后 取 上 清 液 20滋L 进 行SDS-PAGE 电泳，其后步骤同 1.5.2。以制备的 Os-BTB 多克隆抗体作为一抗(1颐2 500)，AP-羊抗兔 IgG为二抗(1颐10 000)，参照 分子克隆 的方法(Sam-brook.,2002)进行 Western blot 分析。1.7OsBTB 蛋白的胶体金免疫标记定位取稻瘟病菌生理小种 ZB15 诱导 12 h 的水稻H7
22、R 叶片。切成 l mm3 mm 的小片。用 2.5%戊二醛-2%多聚甲醛混合液 4 固定 2 h。用系列乙醇脱水法进行脱水处理，采用 lowicryls K4M 树脂(Poly-sciences Inc 产品)低温包埋，超薄切片机(型号为 Re-ichart Jung ULTRACUT E)切片。制片完成的切片先与 1颐50 至 1颐200 倍稀释的 OsBTB 蛋白多克隆抗体28 温育 30 min，最后用 1颐100 倍稀释的胶体金标记的羊抗兔抗体标记 45 min。经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色后在 JEM-1200EX 型透射电镜下观察、拍照。2 结果和分析2.1重组质粒的构建和鉴定利
23、用 PCR 方法扩增得到全长开放读码框的基因，将其克隆到 pGEM-T easy 载体上，获重组克隆 pGEM-T-。用玉和玉将基 因 从 pGEM-T-上 切 下 并 与pET28a 载体连接，获重组质粒 pET28a-。图 1是玉和玉双酶切 pET28a-重组质粒的琼脂糖凝胶电泳结果，双酶切后目的片段长度为 1.7 kb 左右，与目的基因长度一致。进一步的DNA 序列测定结果表明，基因己按正确的读码框克隆至 pET28a 载体，其序列未产生突变。2.2基因的原核表达和多克隆抗体的制备将 pET28a-质粒导入大肠杆菌 BL21(DE3)，IPTG 诱导培养 4 h 后经 SDS-PAGE
24、电泳确认：pET28a-样品与空载体对照相比，在分子量约为 60 kD 处增加了一条蛋白电泳区带(图 2)，其大小与预期的蛋白分子量相当，表明在培养的大肠杆菌中基因己被诱导表达。采用 Ni+NTA亲和层析柱对表达的 OsBTB 融合蛋白进行纯化，SDS-PAGE 电泳结果表明纯化的目的蛋白为单一区带且大小约 60 kD，表明所获目的蛋白大小与预期相符，纯度能满足抗体制备的需要。Western blot 分913PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 农 业 生 物 技 术 学 报2006 年析结果表明，制备的抗体 2 500 倍稀释液能特异识别原核表达的 OsBTB 蛋白
25、，与其它蛋白基本没有反应(图 2)，说明抗体的特异性能满足后续 Westernblot 检测。图 1.重组质粒 pET28a-的酶切鉴定Fig.1.Restriction enzyme digestion results of recombinantplasmid pET28a-A.M,1kb marker;1,PCR product.B.M,1kb marker;1,PCR product;24,pET28a linked withdigested with and.2.3 水稻与稻瘟病菌互作中 OsBTB 蛋白的表达方式以制备的 OsBTB 抗体 2 500 倍稀释液作为一抗，AP-羊抗兔
26、 IgG 为二抗，以表 1 的水稻提取获得的总蛋白进行 Western blot 分析。2 次独立的实验确证 Western blot 结果具有良好的重复性。同时Western blot 结果也表明，不同水稻品系与相应的稻瘟病菌生理小种的互作过程中，OsBTB 蛋白的表达方式呈多样性(图3)，主要特点：在非亲和互作中，OsBTB 蛋白大部分在 08 h 时间段处于较高水平，即在未接种或接种后短时间内该蛋白水平处于高位(图 3)。如在水稻品系嘉兴02-03 与稻瘟病菌生理小种 01-14 及02-4-2，中 早 27 与 01-14、02-4-2 及02-9-1，以及台早 265 与 01-14
27、 的非亲和互作中，相对于亲和互作 OsBTB 蛋白均呈现提前表达。在亲和互作中，OsBTB 蛋白主要在 1224 h 时间段处于较高水平，即在接种较长时间后该蛋白才达到较高水平或者极低表达(图 3)。如在水稻品系浙205 和台早 265 分别与稻瘟病菌生理小种 02-4-2、02-9-1 和 03-1-1 的亲和互作中，与非亲和互作相比 OsBTB 蛋白则表现出表达滞后。无论是在非亲和还是亲和互作，OsBTB 蛋白都存在少数不符合上述特点的表达特征。如在嘉兴02-03 与生理小种 03-1-1 的亲和互作中，OsBTB 蛋白的表达方式符合其非亲和反应的特征(如特点所述)；而在浙 205 与生理
28、小种 01-14 的非亲和互作中，OsBTB 蛋白却呈现出表达时间延迟。2.4OsBTB 蛋白的胶体金免疫标记定位由于前期工作已清晰 OsBTB 蛋白在接种稻瘟病菌 ZB15 后 12 h 的水稻 H7R 中受诱导高表达，这一时间段的水稻样品容易获得免疫反应阳性结果，图3.稻瘟病菌与水稻非亲和/亲和互作中 OsBTB 蛋白的表达谱Fig 3.Expression profile of OsBTB protein during incompatible/compatibleinteraction betweenand rice图 2.SDS-PAGE 和 Western 印迹分析基因在大肠杆菌
29、BL21(DE3)中的表达Fig.2.SDS-PAGE and Western blotting analysis of OsBTBprotein expression inBL21(DE3)M,protein molecular weight marker;1 and 2,expressed proteins frompET28a-without or with induction by1 mmol/L IPTG,respectively;3,purified OsBTB protein as control;4,OsBTBpolyclonal antibody detected OsBTB
30、 protein expression in BL21(DE3).914PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 第 6 期姜玉新等：水稻 OsBTB 蛋白在非亲和/亲和互作中表达方式的初步研究故选择接种稻瘟病菌 12 h 的水稻 H7R 叶片进行胶体金免疫标记定位，并以未接种的 H7R 水稻叶片为对照。图 4 为 OsBTB 蛋白的胶体金免疫标记定位的电镜照片，图 4 中可以观察到胶体金颗粒分布在接种稻瘟病菌的水稻细胞核内，而未接种的叶片细胞中几乎观察不到胶体金颗粒，表明 OsBTB 蛋白存在于水稻细胞核内。图 4.受稻瘟病菌侵染的水稻细胞核中 OsBTB 蛋白的胶体金免
31、疫标记定位Fig.4.Immuno-gold labeling for OsBTB protein withpolyclonal antibody against OsBTB fusion protein in infectedrice cells nucleus byA.Cell nucleus of healthy rice plant;B.Cell nucleus of infected riceplant;The arrow indicates the gold particle.3讨论无毒病原菌侵染宿主后，引起宿主产生一系列的 植 物 防 卫 反 应(Hammond-Kosack a
32、nd Jones,1996)，包括 R 基因的诱导、参与抗性反应的转录因子的激活以及 PR 蛋白的表达等(Wan,2002;Tao.,2003)。如水稻的 R 基因在非亲和稻瘟病菌生理小种 ARCP90-18C 接种水稻品系 To-hoku IL9 后的 12 和 24 h 持续增强表达，而在亲和互作中极低表达(Valent and Chumley,1991)。病原真菌侵染的玉米(Baldwin,1999)和假单胞菌()攻击的拟南芥(Chen.,2002;Tao,2003)中有大量防卫相关基因以及参与抗性反应的转录因子发生差异表达。在 mRNA水平上，OsBTB 基因也具有类似的表达特征，其在
33、水稻抗瘟品种汕优 10、秀水 63 和 Tetep 的表达量均高于感病品种 CO39，且在稻瘟病菌诱导早期表达(庄晓峰等，2005)。这种表达方式也体现在蛋白水平，Western blot 结果表明该蛋白在不同水稻品系与相应稻瘟病菌生理小种互作之间其表达方式呈现多样性。整体而言，在非亲和互作中 OsBTB 蛋白的表达增量时间明显早于其在亲和互作中的表达，该蛋白的这种表达方式与其 mRNA 水平检测的方式(庄晓峰等，2005)相一致。Kim(2004)运用蛋白质芯片检测稻瘟病菌诱导的水稻 PR-2 和 PR-10 等蛋白的表达水平，其结果也证实，这些基因在翻译水平具有与转录水平同样的表达趋势，即
34、在非亲和互作的表达水平高于亲和互作，且表达时间也早于亲和互作。这些结果也从一个侧面反映出不同病原菌诱导的宿主防卫信号通路之间存在一些共性。但无论在非亲和反应还是亲和反应中，OsBTB 蛋白的表达方式也会因与不同的生理小种互作而反应不一。在不同稻瘟病菌生理小种诱导相应的水稻中，参与不同病程反应的基因其表达方式在不同非亲和/亲和互作中既存在着共性也有差异(Jantasuriyarat.,2005)，产生这种不同表达方式的原因可能与所选水稻品系的抗病程度及相应的稻瘟病菌生理小种的致病性有关，但对 OsBTB 蛋白表达方式多样性的机理有待于进一步的研究。尽管植物中已发现几百个编码 BTB 结构域的蛋白
35、，但只有少数几个基因被功能鉴定，如参与调节拟南芥向光性反应的基因(Sakai e,2000;Motchoulski and Liscum,1999)，与叶柄和花发育方式有关的基因(Hepworth.,2005)和参与调节 PR 基因表达的基因(Cao,1997;Despr s,2000)，大麦中参与调节激素应答基因表达的基因(Woodger,2004)等，它们都属转录因子且定位于细胞核。本实验利用胶体金免疫技术对 OsBTB 蛋白进行亚细胞定位的结果表明，该蛋白也位于细胞核内，表明基因可能是一个参与调节抗性反应的转录因子。致谢 本文在浙江大学生物技术研究所董海涛副教授的指导下撰写完成，同时中国
36、水稻研究所国家水稻改良中心郑康乐研究员也对本文的撰写和修改给予有价值的意见和建议，作者在此一并致谢。参 考 文 献Aravind L and Koonin E V.Fold prediction and evolutionaryanalysis of the POZ domain:Structural and evolutionary rela-tionship with the potassium channel tetramerization domain(J).1999,285:13531361Baldwin D,Crane V and Rice D.A comparison of ge
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