长链非编码RNA91H对食管鳞癌组织中IGF2表达的调控作用研究_高天翼.docx

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1、 分类号： R44 密级： 单位代码： 10312 学 号： 20101631 硕士学位论文 题 目： 长链非编码 RNA91H 对食管鳞癌组织 中 IGF2 表达的调控作用研究 研 究 生 ： _ 高天翼 指导教师： _ 王书奎 学科 专业： _ 临床检验诊断学 学院名称： _ 南京医 科大学 附属南京医院 完成时间： _ 二 一四年三月 南京医科大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作 所取得的成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和 集体，均已在文中

2、以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人 承担。 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权南京医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于（请在以下相应方框内打 /) ： 1、 保密 ，在 _年解密后适用本授权书。 2、 不保密口。 中文摘要 . 1 英文摘要 . 3 前言 . . . 5 JEX . 8 第一部分长链非编码 RNA91H 对食管鳞癌组织中

3、IGF2 表达的调控作用在细胞 水平的研究 1 材料 . 8 2 施 . 14 3 结果 . 27 4 脱 . 32 第二部分长链非编码 RNA91H 对食管鳞癌组织中 IGF2 表达的调控作用在组织 水平的研究 5 撕 . 34 6 施 . 38 7 结果 . 46 8 讨论 . 49 H 雜 . . 52 . 53 雜 . 55 關 . 62 攻读学位期间发表论文情况 . 63 致谢 . 64 南京医科大学硕士学位论文 长链非编码 RNA91H 对食管鳞癌组织中 IGF2 表达的调控作用 研究 中文摘要 目的探索长链非编码 RNA (IncRNA) 91H 对食管鳞癌 （ ESCC)组织中

4、胰岛素样 生长因子 2 (IGF2)异常表达的调控机制，评价其在 ESCC 发生、发展中的作用。 方法 1、 收集 232 例 ESCC 患者肿瘤组织和癌旁组织标本，购买培养食管鳞癌细胞系 TE-1 和 ca-109,人正常胃上皮细胞株 GES-U 2、 构建及鉴定 91H干扰载体，利用 Lip2000脂质体瞬时转染 ESCC细胞株， G418 筛选稳定转染细胞株。 3、 采用二甲基亚砜 （ DMSO)试剂将去甲基化试剂 5-aza-CdR 浓度调节至 2. 5， 5，10mol/L 后，分别作用于 ESCC 细胞株，亚硫酸氢盐修饰后测序法 （ BSP)筛 选去甲基化细胞株。 4、 采用实时荧

5、光定量 RCR， ABI 7500 定量分析肿瘤细胞株与正常细胞株之间 91H RNA 表达差异。 5、 采用实时荧光定量 RCRz, ABI 7500定量分析转染前后 ESCC细胞株内 91H以 及IGF2mRNA 表达差异；同时采用免疫荧光 （ IF)分析比较转染前后 ESCC 细胞 株内IGF2 蛋白的表达差异。 6、 分离提取临床收集的肿瘤组织内 DNA， 亚硫酸氢测序法 （ BSP)分析比较 ESCC 患者体内 H19 差异甲基化区 (DMD)甲基化程度与临床病理指征的相关性。 7、 分离提取临床收集的肿瘤组织以及癌旁组织内 RNA， 逆转录后，采用实时荧 光定量 RCR, ABI

6、7500 定量分析 ESCC 患者体内 91H 与 IGF2 mRNA 表达量与临床 病理指征的相关性。 结果 1、 荧光定量 PCR 检测 ESCC 肿瘤细胞株与正常人粘膜上皮细胞株发现， 91HRNA 在肿瘤细胞株 TE-1 表达量为 0. 750.14,在 Eca-109 的表达量为 0. 460.12, 均显著高于人 GES-1 细胞株 0. 290.11 (p 0.05)。 2、 91H RNA 干扰后，荧光定量 PCR 检测 TE-1 IGF2 mRNA 表达水平为 4. 91 1. 68, 1 南京医科大学硕士学位论文 明显高于阴性对照组 1. 380. 61 (p 0. 05)

7、, Eca-109 细胞株干扰后 IGF2 mRNA 表达水平为 3.621.44，同样明显高于阴性对照组 1.751.00(? 0.05);随后 的IF 检测发现， TE-1IGF2 蛋白表达量为 7.60 土 0.66X104,显著高于阴性对照 组 2.010.43X104， Eca-109 IGF2 蛋白表达量为 8.641.74X104， 同样显著 高于阴性对照组 3. 71 0.68X104。 3、 去甲基化试剂作用于各细胞株后，荧光定量 PCR 检测发现，细胞甲基化程度 越低， 91H 表达水平越高 （ p0.05); 5. 91H expression was significa

8、ntly lower in patients with higher depth of invasion, neoplastic grading and TNM which usually leads to the overexpression of IGF2 in tumor progression after being tested by real-time PCR. Conclusion 1. The IncRNA 91H was associated with HI9 DMD methylation status; 2. The IncRNA 91H inhibited IGF2 e

9、xpression of ESCC patients; 3. 91H expression potentially represent a novel clinically relevant event to identify individuals at increased risk for the occurrence of ESCC. Key words: IncRNA 91H; IGF2; H19; DMD; ESCC 4 南京医科大学硕士学位论文 刖 g 食管癌作为常见肿瘤之一，由于其发现晚，进展快，常常预后极差，每年造 成极高的死亡率。食管鳞癌 (ESCC)是食管肿瘤中最常见的类型

10、，其在中国尤其高 发1-2。但 ESCC 的确切病因未明，其可 能机制是遗传和环境因素长期交互作用 而诱发细胞的恶性转化和不可逆的基因改变，这些改变最终导致涉及细胞关键性 生理功能包括增殖、凋亡、分化等信号转导的失控。因此深入研究与 ESCC 发病 机制相关的基因，及时发现早期诊断 ESCC 的理想生物标志物，通过对它们的检 _测或许能在食管恶性肿瘤预防以及减少死亡率上发挥重要作用 3。 研究表明，印记基因在胚胎期以及人正常发育中的基因修饰中发挥重要作用 4。其表现为根据不同的亲本来源，通过表观修饰，使一个特定基因沉默。迄 今为止，超过 80 种哺乳动物印记基因，根据其不同功能被归为不同簇 5

11、。胰岛 素样生长因子 2 (IGF2 )是发现最早的父源表达的印迹基因之一 6，其表达受 增强子 （ Enhancer)、 DNA 差异甲基化区 （ Differentially Methylated Domain， DMD)、启动子 （ Promoter)及锌指蛋白 CTCF (CCCTC binding factor)复合体 的调控 7-9， 在人体正常组织细胞中只有来源于父源的等位基因表达，而来源 于母源的等位基因不表达，即父源甲基化的 DMD 区不能与 CTCF 复合体结合，增 强子能激活 IGF2 的启动子，父源 IGF2 表达 10，但母源非甲基化的 DMD 区能与 CTCF复合体

12、结合，从而阻断远端增强子对 IGF2 启动子的激活，母源 IGF2 不表 达（见图 1)。 图 1 正常组织细胞中父源和母源 IGF2 表达的调控机制图 注：父源甲基化的 DMD 区不能与 CTCF 复合体结合，增强子能激活 IGF2 的启动子，父源 IGF2 表达；但母源非甲基化的 DMD 区能与 CTCF 复合体结合，从而阻断远端增强子对 IGF2 启动子 的激活，母源 IGF2不表达。 5 南京医科大学硕士学位论文 大量文献及我们的前期研究结果均发现包括 ESCC 在内的肿瘤组织中普遍存 在 IGF2 表达异常增高现象，在肿瘤细胞的增殖、迁徙及转移过程中发挥重要作 用11，但肿瘤组织中

13、IGF2 高表达的机制仍不明确。研究表明，相同簇内的印 记基因通过顺式作用元件上 一 段共同的碱基区间发挥作用。而该区间内与印记基 因相关的甲基化区域在基因的表达中发挥着尤为重要的作用，其又被称为印记调 控区域 (DMDs)。 H19/IGF2 所在区域就是已被熟知的一个印记基因簇。其 H19 上 游2 kb 处的 DMD 区通过阻断 IGF2 3 端增强子信号，在 H19 和 IGF2 等位基因 的表达调控中发挥重要作用 12-14。在早些的研究中，该增强子竞争学说己被 多项研究证实并应用于 H19 和 IGF2 表达调控的解释 15-16。 而最新的研究表明在某些印记基因周围存在着一些相关

14、的非编码长链 RNA， 它们 在肿瘤的发生发展以及转移的调控中提示存在一种新的调控机制 17-19。 IncRNA是一类转录本长度超过 200nt 的 RNA 分子，它们并不编码蛋白，而是以 RNA 的形式参与 X 染色体沉默、基因组印迹、染色质修饰、转录激活、转录千扰 以及核内运输等多种重要的调控过程，在表观遗传、转录水平以及转录后水平等 多层面调控基因的表达。最新研究表明 IncRNA 的异常表达与包括肿瘤在内的多 种疾病的发生发展密切相关 20-21, IncRNA 在肿瘤发生发展中的作用及机制正 在成为肿瘤分子生物学研究领域的新热点。 目前与 ESCC相关的 IncRNA的研究才刚刚起

15、步，但也发现一些 IncRNA与 ESCC 的发生发展密切相关。其中 Ge XS 的研究表明 HOTAIR 能够抑制 WIF-1 表达，促 进如 t 信号通路，提示其在 ESSS 发生发展过程中发挥着重要作用 22。 随后 Wang CM研究发现 PlncRNA-1 表达量随着 ESCC 的肿瘤进程逐渐升高 23，且其高表达 与肿瘤淋巴转移密切相关。以上研究均提示，异常表达的 IncRNA 在 ESCC 的发生 发展中可能起重要作用。 91H是由 IGF2/H19基因位点转录出的一条 H19反义 RNA分子，长约 119. 392kb，其部分序列可与母源性 IGF2 基因的 IGF2/H19

16、调控区域结合 24， 但其确切的功能依然未知。研究表明其与乳腺癌 IGF2 异常表达密切相关，这种 6 南京医科大学硕士学位论文 促进 IGF2表达的现象证明了在 H19/IGF2区域或许存在着一种新的调控机制 25。但是目前对于该机制的研究仍然较少，其与肿瘤的临床发展的关系仍不明 确。因此，我们希望通过本次研究深入探讨 91H 长链 RNA 与 H19DMD 区的调控关 系，以及其在 IGF2 异常表达中的作用，探索其与 ESCC 的发生发展间的关系。以 期望能为 ESCC 的诊疗，预后提供一个新的思路。 7 南京医科大学硕士学位论文 第一部分长链非编码 RNA91H 对食管鱗癌组织中 IG

17、F2 表达 的调控作用及机制在细胞水平的研究 1 材料 1.1 细胞来源 人食管癌细胞株 TE-1 人食管癌细胞株 Eca-109 人正常胃上皮细胞株 GES-1 中国科学院上海生科院细胞所 中国科学院上海生科院细胞所 本实验室保存 1. 2 SiRNA-pSilencer 质粒载体的构建与合成 干扰 RNA (SiRNA)采用先前文献使用的混合干扰片段 18-19，具体序列如 表 1 所 示 。 分 别 对 应 91H 的 5 -GGCGUCAUUCUGAUGGGACTT-3 和 5 -UUCAGGAGCUUMGAUGCUTT-3 片段。以 pSilencer3.1 H1 为质粒载体，对于每

18、 个选定的 SiRNA 序列，设计合成两条 shRNA 的 DNA 模板单链，经体外退火形成 SiRNA双链片段，以 T4 DNA 连接酶插入到经 BamH I 和 Hind III 双酶切线性化 的pSilencerf. 1 H1 中，将连接获得的质粒转化入感受态大肠杆菌 .经初步的 电泳鉴定成功后（图 2)，送基因测序进一步证实（图 3)，鉴定成功后进行质粒 中量制备 . 表 1 91H 千扰序列 8 南京医科大学硕士学位论文 Lan 1 : Si91H1 Digested by Ndel/HmdfH Lane M: DNA Marker Digested by Ndel/Hlndlll

19、Lane 1 : Si91 H2 Digested by Ndel/Hindlll 图 2 9lH 干扰 RNA 电泳图 图 3 91H 干扰 RNA shRNA 测序图 9 南京医科大学硕士学位论文 1. 3 主要试剂及耗材 琼脂糖 Amresco, USA 二甲基亚砜 Amresco, USA 酵母提取物 0X0ID, UK 胰蛋白胨 0X0ID, UK 琼脂粉 BIO-RAD, USA 质粒（小量 ） 提取试剂盒 Omega, USA 核酸纯化试剂盒 Omega, USA 氯化铯 Sigma, USA 氯化镁 Sigma, USA 氯化钠 Sigma, USA 蔗糖 Sigma, USA

20、 PS-80 Sigma, USA 去甲基化试剂 5-aza-CdR Sigma, USA 亚硫酸氢钠 Sigma, USA 透析袋 Pierce, USA 培养瓶 （ 25cm2、 75cm2) Corning, USA 培养板 （ 6 孔、 96 孔） Corning, USA 冻存管 Corning, USA 高糖型 DMEM 培养基 Gibco, USA RPMI-1640 培养基 Gibco, USA 胎牛血清 杭州四季青公司 胰蛋白酶 国药集团 EDTA (乙二胺四乙酸） 国药集团 DEPC 国药集团 甘氨酸 国药集团 组氨酸 (Histidine) 国药集团 10 南京医科大学硕

21、士学位论文 脂质体 Lipofectamine 2000 Invitrogen, USA TRIzol Invitrogen, USA QuantiTect Sybr green PCR kit 试剂盒 Takara, Japan 逆转录试剂盒 Qiagen, USA DNA Marker 北京天根公司 6XLoading buffer 北京天根公司 氯仿 南京化学试剂有限公司 异丙醇 南京化学试剂有限公司 无水乙醇 南京化学试剂有限公司 哺乳动物细胞蛋白抽提试剂 武汉博士德公司 显影定影试盒 武汉博士德公司 氨苄青霉素 南京凯基公司 30%聚丙烯酰胺凝胶 南京凯基公司 Tris(三羟甲基氨基

22、甲烷 ） Amresco， USA SDS (十二烷基磺酸钠） Amresco, USA Tween-20 Amresco, USA APS (过硫酸铵） BIO-RAD， USA TEMED BIO-RAD, USA 鼠抗 5 型腺病毒 E1A 单克隆抗体 Applied Biosystems， USA 鼠抗人 0 _actin 单克隆抗体 Santa Cruz, USA 辣根过氧化物酶 (HRP)标记的羊抗鼠 IgG Santa Cruz, USA PVDF 膜 Millipore， USA 医用 X 射线胶片 Kodak, USA 甲醛 南京化学试剂有限公司 二甲苯 南京化学试剂有限公司

23、 固体石蜡 南京化学试剂有限公司 蒸馏水 科内纯净水制作系统自制 甲苯 南京化学试剂有限公司 盐酸乙醇 南京化学试剂有限公司 南京医科大学硕士学位论文 伊红 中性树胶 丙酮 甲醇 饱和酚 异戊醇 Triton X-100 磷酸氢二钠 （ Na2HP04) 磷酸二氢钠 （ NaH2P04) 盐酸 过氧化氢 苏木精染液 对苯二酚 乙酸铵 南京化学试剂有限公司 南京化学试剂有限公司 南京化学试剂有限公司 南京化学试剂有限公司 南京化学试剂有限公司 南京化学试剂有限公司 Amresco, USA 南京化学试剂有限公司 南京化学试剂有限公司 南京化学试剂有限公司 南京化学试剂有限公司 南京化学试剂有限公

24、司 南京化学试剂有限公司 南京化学试剂有限公司 Promega Wizard Cleanup DNA 纯化回收系统 Promega, USA 963. 次性细菌过滤器 南京凯基公司 BSP 检测试剂盒 上海英拜生物科技有限公司 1. 5 主要溶液配制 L5.1 PBS 配制：称取药品 NaCl 8.0 g， KC1 0.2 g， KH2P04 0.2 g， Na2HP04. 2H20 1.56 g， 倒入盛有双蒸水的烧杯中，混匀振荡器搅动至充分溶解， 然后将溶液倒入量筒中准确定容至 1000 ml， 用浓盐酸调节 PH=7. 4, 115 (：高压灭菌 30 分钟，备用。 1.5.2 0.01

25、M 枸橼酸盐缓冲液 （ PH6.0):称取枸橼酸三钠 3 g,梓檬酸 0.4 g， 溶于800 ml 去离子水中，混匀振荡器搅动至充分溶解，再用去离子水将 溶液体积定容到 1000 ml， 调节 PH=7. 4,常温保存备用。 1.5. 3 50XTAE 电泳缓冲液的配制：称取 Tris 242 g， 加冰醋酸 57.1 ml， 0.5 mol/L EDTA 溶液 (pH 8.0)100 ml 混合，超纯水稀释，将溶液倒入量筒中 准确定容至 1000 ml， 室温保存备用。工作液为 1XTAE， 临用前将 50X 南京医科大学硕士学位论文 TAE 采用超纯水稀释 50 倍即可。 1.5.4 0

26、.25%胰蛋白酶配制 ： 称取粉末状胰蛋白酶 0.25 g， 然后加高压灭菌好 的PBS 100 ml， 用混匀振荡器搅动至充分溶解后 0.22 um 微孔滤膜过滤 除菌，分装在 25 ml 血清瓶中，置 -20 C 冰箱中保存 备用。 1.5.5 1.5 M Tris-HCl(pH 8.8):称取 Tris 碱 45.43 g， 加超纯水 200 ml 混 匀振荡器搅动至充分溶解后，用浓盐酸调节 pH 至 8. 8,最后加超纯水， 量筒定容至 250 ml, 4C 保存备用。 1. 5. 6 0. 5 M Tris-HCl (pH 6. 8):称取 Tris 碱 15.14 g， 加超纯水

27、200 ml 混 匀振荡器搅动至充分溶解后，用浓盐酸调节 pH 至 6. 8,最后加超纯水， 量筒定容至 250ral， 4C 保存备用。 1.5.7 10%SDS:称取 SDS 10 g， 加入超纯水充分溶解，量筒定容至 100 ml， 必要时加热使其充分溶解，室温下保存。气温下降易出现白色沉淀，需温 水浴，溶化后使用。 1. 5. 8 1X 电泳液：称取 Tris 碱 3_ 02 g， 甘氨酸 14. 4 g， SDS 1 g 溶于去离子 水混匀振荡器搅动至充分溶解后，定容至 1000 ml， 常温保存。 1.5.9 G418 的配制：取 lgG418(实际有效浓度为 0.7)，加超纯水

28、14ml 溶解， 一次性细菌过滤器过滤消毒，分装到 1.5mlEP 管， 4C 保存备用。 1.5.10 液体石蜡的配制：取固体石蜡放入电热恒温箱内 30 分钟即可。 1.5.11 10%甲醛（中性福尔马林）的配制：取分析纯甲醛 50ml 倒入 500ml 量筒 内，加蒸馏水至 500ml 刻度出，混匀，倒入染色缸，盖好盖子。 1.5.12 0.5-1%盐酸 -乙醇的配制（ 70%的乙醇配制 ）： 取 0.5-lml 的盐酸，加入 70%的乙醇 99. 5-99ml,混勻，倒入磨口瓶子，盖好瓶盖即可。 1.5.13 红细胞裂解缓冲液： 0. 32M 蔗糖， 10mM Tris-HCl， 5mM

29、 MgC12， l%Triton-X-100 混勻后。用浓 HC1 调 pH 到 8. 0。加 Triton-X-100 之前 溶液过滤消毒。 1.5.14 蛋白酶 K:应用液浓度为 25mg/inl。 1.5.15 溴化乙徒 8:储存液（ 1 1/1111):1. 118 加入 10 1111 三蒸水，磁力 搅拌器搅拌 3 小时，密封，避光， 4C 保存。 1.5.16 2%琼脂糖凝胶（含 5 叼 8 工作液 /10 1111):28琼脂糖，加入 1了六 电 13 南京医科大学硕士学位论文 泳缓冲液 l ml， 微波炉中加热至琼脂糖粉充分溶解，加入 5PLEB工作 液，50C 左右即可灌胶。

30、 1.5.17 3%琼脂糖凝胶（含 5W EB 工作液 /100ml): 3g 琼脂糖，加入 1XTAE 电 泳缓冲液 100ml， 微波炉中加热至琼脂糖粉充分溶解，加入 5 uLEB 工作 液， 50C左右即可灌胶。 1.5.18 引物的溶解：将分别装有 1.0 OD 的上下游引物的离心管离心 l-2min; 在离心管中加入 PH 值 7. 0 的无菌水稀释至 10 u M/u L 溶液，再次离心 2-3min;稀释好的引物分装保存至 -20C 冰箱。 1.5. 19 LB 培养基：取胰蛋白胨 10 g， 酵母提取物 5 g， NaCl 10 g， 加去离子 水至 800 ml， 待溶质完全

31、溶解后，用 5 mol/L 的 NaOH 溶液调节 pH 至 7.0 左右，加去离子水定容至 1000 ml， 用干净的生理盐水瓶分装，高压蒸汽 灭菌。 4 C 储存备用。 1。 5 20 普通琼脂培养平板：取 100 ml LB 培养基加 2 g 琼脂粉，高压灭菌 15 min， 取出后振摇使琼脂粉完全溶解，冷却至 50-60 C 后，无菌操作台上将其 倒入消毒培养平皿中，溶液盖满平皿底部即可。室温下冷至琼脂凝固后， 置37 C 孵箱孵育 12 h， 无菌落生长即可保存于 4 C 备用。 1.5.21 氨卞青霉素琼脂培养平板：取 100 ml LB 培养基加 2 g 琼脂粉，高压灭 菌15

32、min， 取出后振摇使琼脂粉完全溶解，冷却至 50-60 C 后，无菌条 件下加入 60mg/ml 的氨卞青霉素 100 ul 至终浓度为 100 Ug/ml， 无菌 操作台将其倒入消毒培养平皿中，溶液盖满平皿底部即可。室温下冷至琼 脂凝固后，置 37 C 孵箱孵育 12 h， 无菌落 生长即可保存于 4 C 备用。 1. 5. 22 细胞冻存液：取 150ul DMSO, 300ul 胎牛血清， 1050ul 培养基按 1:2:7 配置成 1.5ml 细胞冻存液，现配现用。 1. 5. 23 5-aza-CdR 去甲基化试剂：取 DMSOlOml 按试剂说明将 5-aza-CdR 粉剂溶 解

33、成 10mM 单位的水溶液， -80C 保存备用。 1.5. 24 75%乙醇：量筒称量无水乙醇 75ml 倒入高压灭菌瓶中备用，随后用量筒 称取 DEPC 25ml， 与无水乙醇按照 1:3 稀释后配置成 75%乙醇，保存于 4 C 备用。 1. 5. 25 3. 6M 亚硫酸氢钠： 1. 88g 亚硫酸氢钠使用 DDW 水稀释，并以 3M NaOH滴 南京医科大学硕士学位论文 定溶液至 PH 5.0,最终体积为 5ml， 保存于 4 C 备用。这么大浓度的亚 硫酸氢钠很难溶，但加入 NaOH 后会慢慢溶解，需要有耐心 。 PH 定要准 确为 5.0。 1.6 主要仪器 PCR 扩增仪 荧光

34、定量PCR 仪 电泳仪 酶标仪 移液器 紫外分光光度计 低温高速冷冻离心机 制冰机 电子天平 pH计 TD20/20 荧光照度计 纯水系统 倒置显微镜 电子显微镜 微型离心机 C02细胞培养箱 超低温冰箱 凝胶成像系统 高压蒸汽灭菌锅 小型水浴锅 超声波清洗器 恒温金属浴 脱色摇床 ABI, USA ABI, USA Bio-Rad, USA Bio-Rad, USA Eppendorf, Germany Eppendorf, Germany Eppendorf, Germany Grant XB70, USA METTLER TOLEDO, USA METTLER TOLEDO, USA 美

35、国 Turner Biosystems 公司 Millipore, USA Olympus, Japan Olympus, Japan Eppendorf 公司 Thermo, USA Thermo, USA UVP, USA 韩国大韩 常州国华 杭州莱博 杭州博日科技有限公司 江苏海门其林贝尔公司 15 南京医科大学硕士学位论文 普通台式离心机 上海卢湘仪公司 上海力新 HFsafe-1500 上海大迈仪器有限公司 UVP 生物安全柜 混勻搅拌器 凝胶成像系统 2 实验方法 2.1 重组质粒的扩增： 2.1.1 重组质粒转化 ToplO 感受态细胞 1) 取 lOOyl 摇匀后的感受态细胞悬

36、液（如果是冷冻保存液，则需化冻后马 上进行下面的操作），加入质粒 DNA 溶液 2ul (含量不超过 50ng， 体积不超 过 l y 1); 2) 轻轻摇匀后，冰上放置 30 min 后，于 42C 水浴中保温 90 s (期间要不 断摇晃管子），然后迅速在冰上冷却 5 min; 3) 向 EP管内加入 100 ul LB液体培养基，则总体积为 0.2 ml。 混匀，于 37T：水浴中温浴 45 min,使受体菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗 生素抗性基因； 4) 将 100 ul 转化后的感受态细胞均匀涂布到含相应氨苄霉素的 LB 平板 上。将平板置于室温直至液体被吸收； 5) 倒置

37、平板， 37C 培养 16 h。 2.1.2 重组质粒的提取 1) 在无菌条件下，从转化成功的培养板上挑取单个菌落接种于 5 ml 含有适 当抗生素的 LB 液体培养基， 37C、 约 300 rpm 振荡培养 16 h (过夜 ）； 2) 菌种的保存：取菌液 lml， 加入 0.5ml 浓度为 15-20%的灭菌甘油，混匀， 分装于无菌的 EP 管中，冻存于 -70C。将剩余菌液分装到 2 个 EP 管中，每 管1.5 ml 菌液。 10000 g 室温下离心 1 min,轻轻吸掉上清，尽可能吸尽； 3) 在 EP 管中各加入 250ul SolutionI (己加入 RNaseA)， 吹打

38、至细胞完 全悬浮； 4) 加入 250 ul Solution II，轻轻颠倒混匀数次（其间旋转 EP 管），得到澄 16 南京医科大学硕士学位论文 清的裂解液。然后温育 2 min 免剧烈混合造成染色体 DNA 断裂 Solution II 不用时应盖紧盖子 ）； 5) 加入 350ul Solution III，立即上下颠倒数次直至白色絮状沉淀生产（混 匀要完全、即时，避免局部沉淀 )； 6) 室温下 13000g 离心 lOmin， 出现紧密的白色沉淀，立即进行下一步； 7) 将吸附柱装到 2 ml 收集管中，小心吸取上清，加至柱子中，确保不要扰 动沉淀，以免把细胞碎片带入柱子中。室温下

39、 10000 g 离心 1 mim 使裂解 液完全过柱； 8) 移开柱子，弃去收集管中的液体，并将柱子重新插入收集管中，加入 500 u 1 Buffer HB， 静置 2 min， 10000 g 室温离心 1 mim 使溶液完全过柱； 9) 弃去收集管中的液体，重新将柱子装好，加入 70 yl DNA Wash Buffer (已加过无水乙醇），静置 2 roin， 10000 g 室温离心 1 min 使溶液完全过柱， 弃掉收集管中的液体 ； （ DNA Wash Buffer 用前应平衡至室温） 10) 重复上一步操作； 11) 以 13000 g 离心空柱子 2 min， 使硅胶变干

40、； 12) 将硅胶柱插入一个 1.5 ml 的无菌 EP 管中，加入 30-50 ul (取决于希望 得到的产物浓度 ） Elution Buffer (10 mM Tris-HCl， pH 8. 5)或无菌去离 子水，室温下放置 1-2 rain， 13000 g 离心 lmin， 以洗脱 DNA; 13) 取质粒溶液 1 ul，稀释 100 倍，紫外分光光度计下测质粒的浓度和纯 度。将质粒溶液冻存于 _20C 或者更低温度备用。 2.1.3 重组质粒的 DNA 测序 将经酶切鉴定阳性的纯化质粒取 100ng， 交由南京凯基生物公司测序，进一 步验证载体构建的正确性。测序引物为通用引物，运用

41、 Primer Walking 法， 测通质粒序列。 2.2 细胞培养 人食管鱗癌细胞株 Eca-109,人胃粘膜上皮细胞 GES-1 用高糖型 DMEM 培养 基培养，人食管鳞癌细胞 TE-1 用 RPMI 1640 培养基培养；均加 10%经灭活 的胎牛血清在 37C、 饱和湿度的 5% (： 02培养箱中培养。 3-4 天换液传代一 次，取对数生长期细胞为实验对象。 17 南京医科大学硕士学位论文 2. 2.1 细胞换液和传代 1) 每天观察细胞的生长情况以及融合程度，根据培养基颜色变化， 3 4 天换 一次培养液； 2) 若细胞呈现 8090%的融合度，则弃去旧培养液，加 PBS 清洗

42、一次， 0.2% 胰酶消化，显微镜下观察； 3) 弃消化液，加 3ml 完全培养基沿培养瓶各个方向轻轻吹打细胞，按 1:2 或1:3 传代并适当补充完全培养基，置 37C、 5% C02培养箱培养。 2. 2. 2 细胞计数 0. 25%胰蛋白酶消化细胞，加入完全培养基，吹打成细胞悬液。吸 5ul 细 胞悬液沿盖片边缘缓缓滴入到细胞计数板盖玻片的一端，使细胞悬液缓缓浸 润盖片，同时避免盖玻片下产生气泡，也不让悬液流入旁边槽中。待盖玻片 下充满细胞悬液后，将细胞计数板放于显微镜的低倍镜下观察，移动计数板， 当看到镜中出现计数方格后，计数计数板的四角大方格内的细胞数。按照下 面公式计算细胞密度：细

43、胞悬液的细胞数 /ml=(四个大方格细胞数 / 4) X 104。 2. 2. 3 细胞冻存 1) 若细胞生长至 85-90%的融合度时，以 2%胰酶消化，弃消化液； 2) 加培养基 2-3ml， 清洗细胞一遍，再加 3ml 完全培养基反复吹打，形成单 细胞悬液； 3) 将细胞悬液转移至离心管， 1000g 离心 5min， 取出； 4) 75%乙醇清洗离心管颈，吸取上清，加入 1.5ml 己配制好的细胞冻存液， 反复吹勻，将细胞及冻存液移至 2ml 的冻存管， 4C30min， -2(TC30min，-80 C 过夜，后移至液氮保存。 2. 2. 4 细胞复苏 1) 从液氮罐中取出细胞冻存管

44、，迅速放入 3740C 水浴箱 (1 2min)， 轻轻摇 动加速融化； 2) 进入无菌室操作， 75%乙醇清洗培养瓶，打开细胞冻存管，移入细胞培养 皿内，补充 5ml 完全培养基， 37C、 5%C02培养箱培养过夜；次日观察细胞 是否贴壁，更换培养基，随后按常规进行培养。 南京医科大学硕士学位论文 2. 3 荧光定量 PCR检测 ESCC细胞株与正常粘膜细胞株之间 91H RNA表达差异 2. 3.1 各细胞株总 RNA 的提取 1) 25ml 培养瓶培养细胞，待细胞融合度达到 70 80%时，弃培养液， PBS冲 洗，加入 1.5ml0. 25%胰酶消化细胞，加入完全培养基，吹打成细胞悬液。 2) 加样器收集细胞悬液打入 5ml 高压灭