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1、 第 31 卷第 3 期 大 连 海 洋 大 学 学 报 Vol 31 No 3 2 0 1 6 年 6 月 JOU NAL OF DALIAN OCEAN UNIVE SITY June 2 0 1 6 DOI: 10 16535 / j cnki dlhyxb 2016 03 014 文章编号 : 2095 1388( 2016) 03 0307 04 静电场对钝顶螺旋藻的生物效应 付丽丽 ， 金晶 ， 吉美萍 ， 那日 ， 郭九峰 ( 内蒙古大学 内蒙古自治区离子束生物工程重点实验室 ， 内蒙古 呼和浩特 010021) 摘 要 : 为选育优良的螺旋 藻 Spirulina platen
2、sis 藻 株 ， 探究 静 电场的生物学效 应 ， 采用静电场对钝顶螺 旋 藻 进 行处 理 ， 分别 在 0、 3、 6、 9、 12、 15、 18、 21、 24、 27 kV 电压下处理藻 株 5 min， 处理后的藻株依次记 为 IS、 ES 1、 、 ES 9， 将藻株按照一定条件进行培养 后 ， 对其生长速 度 、 藻体上浮 性 、 叶绿 素 a、 丙 二 醛 ( MDA) 、 水溶性蛋白 质 、 藻蓝蛋白质含量和超氧化物歧化 酶 ( SOD) 比活性进行 测 定 。 结果表 明 : 与对 照 藻 株 IS 株相 比 ， 处理组藻 体 MDA 含量均有所 降 低 ; 除 ES
3、5 藻株 外 ， 其他处理藻株的生长速度均明显加 快 ; ES 8 藻株上浮性最 好 ， 其叶绿 素 a、 水溶性 蛋 白 质 、 藻蓝蛋白质含量 和 SOD 比活性 较 IS 均有明显 增 加 ， 增幅分别 为 37. 69%、 19. 13%、 19. 26%和 7. 06%; 对 ES 8 株 与 IS 株叶绿 素 a 的紫外吸收光谱进行比 较 ， 发 现 ES 8 株最大吸收峰值 与 IS 株相比有明显变 化 。 研究表 明 ， 静电场对钝顶螺旋藻具有生物效 应 。 关键 词 : 钝顶螺旋 藻 ; 静电 场 ; 生物效 应 中图分类号 : Q177 文献标志码 : A 螺旋藻 Spir
4、ulina platensis 是一种具有重要开发 应用价值的自养原核生物 ， 它具有光合效率高 、 生 长繁殖快 、 环境适应性强等特点 ， 是少数能大规模 培养的微藻之 一 1 。 螺旋藻含有高蛋白质 、 高 维 生素和丰富的生物活性物质 ， 现已开发成为保健食 品和药品 。 在螺旋藻工业化生产中 ， 产量和质量明 显受地区和环境因子的制约 ， 各地均致力于筛选适 合本地区生长繁殖 、 高产优质的品系 ， 以提 高产 量 、 降低成本 2 。 因此 ， 高产优质螺 旋藻藻种的 筛选成为实际生产中一个重大课题 3 。 利用物理 诱变及相关技术可有效地解决螺旋藻对低温适应能 力较差 、 藻种退
5、化等问题 。 目前 ， 关于激光 、 电磁 波 、 磁场 、 微纳米颗粒和微重力等物理因子对螺旋 藻生物效应的研究较多 ， 但利用电场处理螺旋藻的 相关研究较少 。 本研究中采用静电场对钝顶螺旋藻 进行处理 ， 探索其生物学效应 ， 从中选育出优良藻 株 ， 为进一步优化培育钝顶螺旋藻提供理论基础 。 1 材料与方法 1. 1 材料 试验用藻种为鄂尔多斯高原盐湖钝顶螺旋藻 ， 由鄂尔多斯市 新宇力藻业集团有限公司提供 。 1. 2 方法 1. 2. 1 培养基和生长条件 试验用培养基为标准 培养液 ( Zarrouk 培养液 ) 和固体培养基 ( 在液体 培养基的基础上加入 0. 8% 的琼脂
6、 ) 。 生长条件 : 日光灯 3500 lx 光照 ， 温度为 26 28 ， 光暗周期 为 12 h 12 h。 1. 2. 2 静电场的处理 将藻体用超声破碎成单细 胞 。 破碎条件 : 250 W， 处理时长 3 s， 间歇时长 4 s， 处理 30 次 。 取破碎后的藻液 10 mL 于底部 半径 为 8. 8 cm 的培养皿中进行静电场处理 ( 图 1) 。 处 理条件 为 : 将 藻 液 分 别 在 0、 3、 6、 9、 12、 15、 18、21、 24、 27 kV 电压下处理 5 min， 经静电场 处理后的藻液样品分别记为 IS、 ES 1、 ES 2、 、 ES 9，
7、 然后将各样品接入固体培养基中 ， 放 入光照培养箱内培养 。 培养条件 : 昼 12 h、 28 ; 夜 12 h、 26 。 两周后均已长出较长藻丝 ， 此时 移入标准培养液中培养 。 通过静置分层分离法进行 扩大培养 4 ， 并进行各项指标的 测定 。 1. 2. 3 生长速度和最终生物量的测定 定时取样 ， 用紫外可见分光光度计于 560 nm 处测定吸光度值 ， 重复测定 3 次 ， 取其平均值 ， 绘制生长曲线 。 收稿日期 : 2015 08 09 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( 50267014) 作者简 介 : 付丽 丽 ( 1989 ) ， 女 ， 硕士研究 生
8、 。 E mail: 359654412 qq. com 通信作 者 : 那 日 ( 1955 ) ， 男 ， 教 授 。 E mail: nari6363 sina. com 308 大 连 海 洋 大 学 学 报 第 31 卷 图 1 电场处理装置 Fig. 1 A device of electric field processing 从各组分别取 100 mL 藻液过滤 ， 用纯水 清洗 数次 ， 于冷冻干燥机中干燥 ， 称量最终生物量 。 1. 2. 4 藻体上浮性测定 将生长状态良好的螺旋 藻培养液充分摇匀 ， 静置 10 min 和 24 h 后 ， 分别 取 各 培 养 瓶 中
9、 下 层 液 测 定 吸 光 度 ( A560 nm 、 5 VC 含量进行测定时 ， 采用 2， 6 二氯酚靛酚滴定 法测定每毫升破碎液中 VC 的含量 8 。 1. 2. 8 SOD 活性的测定 采用邻苯三酚自氧化法 测定 SOD 活性 9 。 酶活力单位定义为 : 25 1 mL 反应 液 中 ， 每 分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达 50%时的酶量为一个酶活力单位 ( U) 。 2 结果与分析 2. 1 静电场对钝顶螺旋藻生长速度的影响 由图 2 可知 ， 除 ES 5 藻株外 ， 经过静电场处 理的藻株均较对照藻株 IS 的生长速度明显加快 ， 其中 ES 1 株的生长速度最快 ， 其次
10、为 ES 6、 ES A560 nm ) ， 重复测定 3 次 ， 取其平均值 式为 。 计算公 8 株 ， 说明静电场对藻体生长速度具有一定影响 。 上浮 率 = ( A560 nm A560 nm ) / A560 nm 100%。 其中 : A、 A分别为起始和终末时的吸光度 值 。 1. 2. 5 叶绿 素 a 含量的测定及其 紫外吸收光谱扫 描 取 0. 02 g 藻干粉 ， 加入 6 mL 提取液 ( 95% 乙 醇 95% 丙酮 ) ， 置入棕色瓶于冰箱 ( 4 ) 中静 置过夜后 ， 离心过滤 ， 用紫外可见分光光度计在波 长 360 720 nm 处 扫 描 ， 再 计 算
11、叶 绿 素 a 含 量 ( mg / mL) 6 : CChl a = 12. 7A663 nm 2. 69A645 nm 。 1. 2. 6 蛋白质和丙二醛 ( MDA) 含量的测定 采 用考马斯亮蓝 G 250 法 ， 以牛血清白蛋白质为标 准蛋白质 。 取 0. 03 g 藻干粉 ， 加入 5 mL 磷酸缓冲 液， 于冰箱 ( 4 ) 中静置过夜后 ， 超声破碎 ， 离 心取上清液 ， 测定其蛋白质含量 。 于第 20 天时从各个处理样品中提取新鲜藻体 ， 制备提取液 。 取 3 mL 提取液加入 2 mL 0. 6%TBA， 沸水中煮 20 min， 迅速冷却 、 离心 ， 取上清液用
12、紫 外可见分光光度计在波长 450、 532、 600 nm 处测 量其吸光度 A， 计算 MDA ( mol / L) 含量 7 : MDA = 6. 45 ( A532 nm A600 nm ) 0. 56A450 nm 。 1. 2. 7 藻蓝蛋白质和维生素 C 含量的测定 取螺 旋藻粉 0. 03 g， 加入 6 mL 磷酸缓冲液 ， 超声破碎 后离心 ， 去沉淀得上部溶液 ， 向其中加入硫酸铵达 到 25%饱和度 ， 去沉淀得上清液 ， 上清液中加入 硫酸铵达到 55% 饱和度 ， 离心得沉淀 ， 向沉淀中 加入少量磷酸缓冲液溶解得藻蓝蛋白质 ( C PC) 粗酶液 。 用紫外可见分
13、光光度计在波长 620、 650 nm 处测量其吸光度 ， 计算 C PC 浓度 ( mg / mL) : CC PC = ( A620 nm 0. 474A650 nm ) /5. 34。 由于藻体中所含 VC 具有还原性 ， 对邻苯三酚 的自氧化速率有抑制作用 ， 因此 ， 对藻体破碎液中 图 2 藻体的生长速度曲线 Fig. 2 Growth curve of the alga 2. 2 静电场对钝顶螺旋藻生物量的影响 由图 3 可知 ， 经过静电场处理的藻株生长 20 d 时的生物量 ， 除 ES 5 株外其余藻株均比 IS 高 ， 其 中 ES 1 株的生物量最高 ， 其次为 ES
14、8、 ES 6。 图 3 藻体的生物量 Fig. 3 Biomass of the alga 2. 3 静电场对藻体上浮性的影响 藻丝浮性对藻丝调节其在水体中的位置非常重 要， 且在其养殖采收过程中也扮演着重要角色 10 。 从表 1 可知 ， 与对照藻株 IS 相比 ， 经过静电场处 理的藻株 ( ES 3 除外 ) 上浮性均较好 ， 说明静电 场处理可以大大改善藻体上浮性 。 其中 ES 8 株的 上浮性最好 ， 其上浮率达到 76. 59%， 在采收过程 第 3 期 付丽丽 ， 等 : 静电场对钝顶螺旋藻的生物效应 309 中 ES 8 株更具有优势 。 2. 4 藻体的叶绿素 a、 M
15、DA 含量 螺旋藻细胞中的色素积累是衡量螺旋藻藻株品 质优劣的重要指标 。 从表 1 可见 : 与对照藻株 IS 相比 ， 经过静电场处理的藻株 ， 除 ES 4 株外 ， 其 他藻株的叶绿素 a 含量均明显增加 ， 其中 ES 8 株 的叶绿素 a 含量最高 ， 其增幅为 37. 69%， 其次为 ES 1 株 ， 增幅为 33. 89%。 这反映出 ES 8 藻株是 具有较优品质的藻株 。 2. 5 藻体的水溶性蛋白质和藻蓝蛋白质含量 从表 2 可见 : 与对照藻株 IS 相比 ， 除 ES 4 株 外其他藻株的水溶性蛋白质含量均有增加 ， 其中 ES 8 株增幅最大 ， 达到 19. 1
16、3%; 而 C PC 含量除 ES 8、 ES 9、 ES 1 株高于 IS 株外 ， 其他藻株均 低于 IS 株 ， 其中 ES 8 株增幅最大 ， 达 19. 26%。 表 2 藻体的水溶性蛋白质和藻蓝蛋白质含量 Tab. 2 Water soluble protein and phycocyanin contents of the alga 从图 4 可见 ， 将较好的处理组 ES 8 与对照藻 株 IS 叶绿素 a 的紫外吸收光谱相比较 ， 最大吸收 峰的位置一致 ， 但 ES 8 株的最大吸收峰值明显高 于 IS 株 ， 说明静电场起到了一定作用 。 植物器官衰老或在逆境下受伤害 ，
17、 往往发生膜 脂过氧化作用 ， MDA 是膜脂过氧化的最终分解产 物 ， 从膜上产生的位置释放出后与蛋白质 、 核酸起 反应修饰其特征 ， 使纤维素分子间的桥键 松弛 ， 抑 制蛋白质的合成 11 。 由此可见 ， 低浓度 MDA 时蛋 白质的合成并不会受到抑制 。 从表 1 可见 ， 经静电 场处理的各组藻体 MDA 含量均低于对照藻株 IS， 藻株 alga strain 蛋白质 / ( mg g 1 ) protein 蛋白质 增幅 /% protein increment 藻蓝蛋 白质 / ( mg g 1 ) C PC 藻蓝蛋白质 增幅 /% CPC increment 其中 ES
18、2 株 MDA 含量最小 ， 其次为 ES 8 株 。 表 1 藻体的上浮性 、 叶绿素 a 和丙二醛含量 Tab. 1 Floating rate and levels of Chl a and MDA in the alga 2. 6 藻体的 VC 含量和 SOD 比活性 从表 3 可见 : 除 ES 3 株的 VC 含量超出 300 g / g 外 ， 其他藻株均小于 300 g / g， 这表明 ， VC 藻株 alga 上浮率 /% floating 叶绿素 a / ( mg g 1 ) 叶绿素 a 增幅 /% 丙二醛 / ( mol L 1 ) 含量对 SOD 活性检测影响不大 ;
19、 经过静电场处理 后的藻株除 ES 8、 ES 1 株的 SOD 比活性高于 IS strain rate Chl a Chl a increment MDA 株外 ， 其他藻株的 SOD 比活性均低于 IS 株 。 表 3 藻体的 VC 含量和 SOD 比活性 Tab. 3 Content of VC and SOD specific activity of the al- gae 藻株 VC / 超氧化物歧化酶 SOD alga ( g g 1 ) 含量 / 活性 / 比活性 / strain vitamin C ( mg mL 1 ) content ( U mL 1 ) activit
20、y ( U mg 1 ) specific activity IS( 对照 ) 235. 25 3. 507 2635 751 ES 1 195. 22 3. 512 2700 769 ES 2 38. 18 3. 349 2285 682 ES 3 398. 45 4. 841 2685 555 ES 4 99. 77 5. 049 2550 505 ES 5 102. 85 4. 054 2585 638 ES 6 23. 53 4. 787 2560 542 ES 7 94. 37 4. 690 2690 574 ES 8 47. 42 3. 255 2617 804 ES 9 124.
21、 40 3. 513 2615 744 图 4 叶绿素 a 的紫外吸收光谱 Fig. 4 Ultraviolet absorption spectra of Chl a 3 讨论 本研究中采用不同电压下的静电场对螺旋藻进 IS( 对照 ) 275. 20 120. 33 ES 1 312. 64 13. 60 125. 83 4. 57 ES 2 285. 60 3. 78 103. 67 13. 85 ES 3 276. 00 0. 29 108. 67 9. 69 ES 4 271. 52 1. 34 103. 00 14. 40 ES 5 292. 96 6. 45 120. 00 0.
22、 27 ES 6 281. 28 2. 21 106. 83 11. 22 ES 7 292. 48 6. 28 113. 17 5. 95 ES 8 327. 84 19. 13 143. 50 19. 26 ES 9 319. 84 16. 22 140. 83 17. 04 IS( 对 照 ) 54. 34 10. 24 0. 347 ES 1 71. 51 13. 17 33. 89 0. 338 ES 2 61. 40 11. 43 11. 62 0. 284 ES 3 47. 64 11. 81 15. 33 0. 289 ES 4 71. 04 9. 71 5. 17 0. 32
23、9 ES 5 71. 11 11. 50 12. 30 0. 289 ES 6 63. 23 12. 44 21. 48 0. 340 ES 7 73. 99 11. 72 14. 45 0. 324 ES 8 76. 59 14. 10 37. 69 0. 287 ES 9 65. 93 12. 90 25. 98 0. 342 310 大 连 海 洋 大 学 学 报 第 31 卷 行处理 ， 再通过静置分层分离法将处理后的藻液进 行扩大 培 养 。 结 果 表 明 ， 经静电场处理的藻株 ( ES 5 株除外 ) 的生长速度均比对照藻株 IS 快 ， 而 MDA 含量均低于对照藻株 。 从
24、中筛选出的优质 藻株 ES 8 与 IS 株比较 ， 其叶绿素 a 含量的增幅高 达 37. 69%， 水溶性蛋白质含量增加 19. 13%， C PC 含 量 增 加 19. 26%， SOD 比 活 性 增 加 7. 06%。 藻株 ES 8 的叶绿素 a 含量 、 蛋白质含量 、 藻蓝蛋 白质含量的增幅均明显高于有关报道 2， 12 ， 达到了 理想的效果 。 本试验中 ， 经过静电场处理的藻株大 多生长速度明显加快 ， 并且测得的叶绿素 a 含量也 相应有较大增幅 。 提高植物叶片内叶绿素的含量 ， 可促进植物的光合作用 ， 光合作用为植物生长发育 提供物质和能量 ， 从而又影响到其他
25、生理指标的变 化 13 。 静电场处理对螺旋藻的作用效果与对高等 植物相似 ， 因此 ， 可认为叶绿素 a 含量增加就是促 进藻体生长的因素之一 。 同 时 ， 通过叶绿素 a 的紫 外吸收光谱可知 ， 经静电场处理后的藻株 ES 8 最 大吸收峰值明显高于对照藻株 IS， 但峰值位置却 没有发生变化 ， 也就是说静电场促进了藻体叶绿素 a 的合成 ， 但未改变其分子结构 。 叶绿素 a 含量变 化的原因 ， 可能是静电场处理引起了螺旋藻体内代 谢过程的变化所产生的 。 SOD 活力越高 ， 分解氧 化产物的能力越强 ， 从而可保护机体免受恶劣环境 的伤害 ， 对环境具有较强的适应性 14 。
26、 MDA 是生 24 kV 处理 5 min 可选育出优质的藻株 ES 8。 参考文献 : 1 Santillan C Mass production of Spirulina J Experientia ( Basel) ， 1982， 38( 1) : 40 43 2 赵炎生 ， 尹鸿萍 ， 陈向东 ， 等 倍 频 Nd: YAG 脉 冲激光诱变钝顶 螺旋藻的初步研 究 J 光电子 激光 ， 1999， 10( 6) : 563 564 3 赵萌萌 ， 王卫卫 He Ne 激 光对 钝顶螺旋藻的诱变效 应 J 光 子学报 ， 2005， 34( 3) : 400 403 4 汪志平 ， 贾
27、小明 ， 傅俊杰 ， 等 不同形态钝顶螺旋藻藻丝体分离 和纯化的方 法 J 浙江农业学报 ， 1998， 10( 5) : 275 277 5 陈新美 ， 梅兴国 钝顶螺 旋藻藻种的紫外诱变初步筛 选 J 生 物技术 ， 2006， 16( 2) : 51 54 6 杨敏文 快速测定植物叶片叶绿素含量方法的探 讨 J 光谱 实 验室 ， 2002， 19( 4) : 478 481 7 黄锐 杂交稻及其亲本抗瘟性与几种酶活性及丙二醛含量的关 系 D 雅安 : 四川农业大学 ， 2007 8 李培峰 ， 方允中 用顺磁共 振 及 自旋标记研究活性氧对铜锌超 氧化物歧 化 酶结构的影 响 J 生物
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30、24 128 14 沙 飞 ， 常亚青 ， 丁君 两种 降温模式的低温胁迫对刺参抗氧化 酶活性及丙二醛含量的影 响 J 大连海洋大学学报 ， 2015， 30 ( 1) : 25 29 Biological effects of electric field on green alga Spirulina platensis FU Li li， JIN Jing， JI Mei ping， NA i， GUO Jiu feng ( Key Laboratory of Ion Beam Bioengineering in Inner Mongol Autonomous egion， Inner
31、Mongolia University， Hohhot 010021， China) Abstract: The growth， floating， specific activity of superoxide dismutase ( SOD) and levels of malondialdehyde， water soluble protein and Chl a were determined in green alga Spirulina platensis named IS， ES 1， ， ES 8 and ES 9 exposed to electric field for 5
32、 mins at 0， 3， 6， 9， 12， 15， 18， 21， 24 and 27 kV to evaluate the biological effects of electric field on green the alga The results showed that there was less malondialdehyde content in the trea- ted strains than in the original strain IS However， the treated strains had better growth than the orig
33、inal strain IS except for ES 5， with the best floating in ES 8， and the contents of chlorophyll， water soluble protein and phyco- cyanin increased by 37 69%， 19 13% and 19 26%， respectively and the SOD specific activity increased by 7 06% The ultraviolet absorption spectrum of Chl a was shown to be significant variation in peak in ES 8 compared with the original strain， showing the biological effects of electrostatic field on green alga Spirulina platensis Key words: Spirulina platensis; electric field; biological effect