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1、基因治疗基因治疗的原理的原理 一、基因治一、基因治疗疗的策略的策略 内容提要内容提要二、基因二、基因转转移技移技术术 三、基因干三、基因干预预一、基因治疗一、基因治疗的策略的策略（一）基因置（一）基因置换换（gene replacement）定定定定义义义义：指将特定的目的基因指将特定的目的基因指将特定的目的基因指将特定的目的基因导导导导入特定入特定入特定入特定细细细细胞，通胞，通胞，通胞，通过过过过定位重定位重定位重定位重组组组组，以，以，以，以导导导导入的正常基因置入的正常基因置入的正常基因置入的正常基因置换换换换基因基因基因基因组组组组内原有的内原有的内原有的内原有的缺陷基因。缺陷基因。
2、缺陷基因。缺陷基因。目的：将缺陷基因的异样序列进行桥正。（二）（二）基因添加基因添加 基因添加或称基因增基因添加或称基因增补补（gene augmentation）:通通过导过导入外源基因使靶入外源基因使靶细细胞表达其本身不表达的胞表达其本身不表达的基因。基因。类类型型:在有缺陷基因的在有缺陷基因的细细胞中胞中导导入相入相应应的正常基因，而的正常基因，而细细胞内的缺陷基因并未除去，通胞内的缺陷基因并未除去，通过导过导入正常基入正常基因的表达因的表达产产物，物，补偿补偿缺陷基因的功能。缺陷基因的功能。向靶向靶细细胞中胞中导导入靶入靶细细胞原来不表达的基因，利用胞原来不表达的基因，利用其表达其表达
3、产产物达到治物达到治疗疗疾病的目的。疾病的目的。（三）基因干（三）基因干预预基因干基因干预预（gene interference）:接受特定的方式抑制某个基因的接受特定的方式抑制某个基因的表达，或者通表达，或者通过过破坏某个基因的破坏某个基因的结结构而使之不能表达，以达到治构而使之不能表达，以达到治疗疗疾疾病的目的。病的目的。（四）自（四）自杀杀基因治基因治疗疗自自杀杀基基因因治治疗疗:恶恶性性肿肿瘤瘤基基因因治治疗疗的的主主要方法之一。要方法之一。原原理理:将将“自自杀杀”基基因因导导入入宿宿主主细细胞胞中中，这这种种基基因因编编码码的的酶酶能能使使无无毒毒性性的的药药物物前前体体转转化化为
4、为细细胞胞毒毒性性代代谢谢物物，诱诱导导靶靶细细胞胞产产生生“自自杀杀”效效应应，从从而而达达到到清清除除肿肿瘤瘤细细胞的目的。胞的目的。（五）基因免疫治（五）基因免疫治疗疗 通通过过将抗癌免疫增加将抗癌免疫增加细细胞因子或胞因子或MHC基因基因导导入入肿肿瘤瘤组织组织，以增加，以增加肿肿瘤微瘤微环环境中的抗癌境中的抗癌免疫反免疫反应应。二、基因转移二、基因转移技术技术 基因基因转转移移(gene transfer)技技术术 1.病毒介病毒介导导的基因的基因转转移系移系统统。2.非病毒介非病毒介导导的基因的基因转转移系移系统统。1.病毒介病毒介导导的基因的基因转转移系移系统统 病毒病毒载载体介
5、体介导导的基因的基因转转移效率移效率较较高，高，因此它也是运用最多的基因治因此它也是运用最多的基因治疗载疗载体。体。据据统计统计，有，有72%的的临临床床试验试验支配和支配和71%的病例运用了病毒的病例运用了病毒载载体，其中用得最多体，其中用得最多的是逆的是逆转录转录病毒病毒载载体。体。(1)逆逆转录转录病毒病毒载载体体 逆逆转录转录病毒病毒载载体的特点体的特点 逆逆转录转录病毒包膜上由病毒包膜上由env编码编码的糖蛋白，能的糖蛋白，能够够被被很多哺乳很多哺乳动动物物细细胞膜上的特异性受体胞膜上的特异性受体识别识别，从而，从而使逆使逆转录转录病毒携病毒携带带的的遗传遗传物物质质高效地高效地进进
6、入靶入靶细细胞。胞。逆逆转录转录病毒病毒结结构基因构基因gag、env和和pol的缺失不影的缺失不影响其他部分的活性。响其他部分的活性。前病毒可以高效整合至靶前病毒可以高效整合至靶细细胞基因胞基因组组中，有利于中，有利于外源基因在靶外源基因在靶细细胞中的永久表达。胞中的永久表达。包装好的假病毒包装好的假病毒颗颗粒（携粒（携带带目的基因的重目的基因的重组组逆逆转转录录病毒病毒载载体）以芽生的方式分泌至体）以芽生的方式分泌至协协助助细细胞培育胞培育的上清液中，易于分的上清液中，易于分别别制制备备。逆逆转录转录病毒病毒载载体的主要缺点体的主要缺点 随机整合，有插入突随机整合，有插入突变变、激活癌基因
7、的、激活癌基因的潜在危急；潜在危急；逆逆转录转录病毒病毒载载体的容量体的容量较较小，只能容小，只能容纳纳7 kb以下的外源基因。以下的外源基因。（2）腺病毒）腺病毒(adenovirus，AV)载载体体 腺腺病病毒毒是是一一种种大大分分子子(36 kb)双双链链无无包包膜膜DNA病病毒毒。它它通通过过受受体体介介导导的的内内吞吞作作用用进进入入细细胞胞内内，然然后后腺腺病病毒毒基基因因组组转转移移至至细细胞胞核核内内，保保持持在在染染色色体体外外，不整合不整合进进入宿主入宿主细细胞基因胞基因组组中。中。腺腺病病毒毒是是人人类类呼呼吸吸道道感感染染的的病病原原体体，但但目目前前尚尚未未发发觉觉与
8、与肿肿瘤瘤发发生生有有关关联联。宿宿主主细细胞胞范范围围广广，可可感感染染分裂和非分裂分裂和非分裂终终末分化末分化细细胞，如神胞，如神经经元等。元等。腺病毒腺病毒载载体体的的优优点点1.1.基因基因基因基因导导导导入效率高，入效率高，入效率高，入效率高，对对对对人人人人类类类类平安；平安；平安；平安；2.2.宿主范宿主范宿主范宿主范围围围围广；广；广；广；3.3.基因基因基因基因转导转导转导转导与与与与细细细细胞分裂无关；胞分裂无关；胞分裂无关；胞分裂无关；4.4.重重重重组组组组腺病毒可通腺病毒可通腺病毒可通腺病毒可通过过过过口服口服口服口服经肠经肠经肠经肠道吸取、或道吸取、或道吸取、或道吸
9、取、或喷雾喷雾喷雾喷雾吸入吸入吸入吸入或气管内滴注；或气管内滴注；或气管内滴注；或气管内滴注；5.5.腺病毒腺病毒腺病毒腺病毒载载载载体容量体容量体容量体容量较较较较大，可插入大，可插入大，可插入大，可插入7.5 kb7.5 kb外源基因；外源基因；外源基因；外源基因；腺病毒腺病毒载载体体的的缺点缺点2.2.宿主的免疫反宿主的免疫反宿主的免疫反宿主的免疫反应导应导应导应导致腺病毒致腺病毒致腺病毒致腺病毒载载载载体表达短体表达短体表达短体表达短暂暂暂暂。3.3.有两个有两个有两个有两个环节环节环节环节可能可能可能可能产产产产生复制型腺病毒。生复制型腺病毒。生复制型腺病毒。生复制型腺病毒。4.4.
10、靶向性差。靶向性差。靶向性差。靶向性差。1.1.不能整合到靶不能整合到靶不能整合到靶不能整合到靶细细细细胞的基因胞的基因胞的基因胞的基因组组组组DNADNA中。分裂增殖中。分裂增殖中。分裂增殖中。分裂增殖快的快的快的快的细细细细胞，胞，胞，胞，导导导导入的重入的重入的重入的重组组组组病毒病毒病毒病毒载载载载体，随分裂而体，随分裂而体，随分裂而体，随分裂而丢丢丢丢失的机会增多，表达失的机会增多，表达失的机会增多，表达失的机会增多，表达时间时间时间时间相相相相对较对较对较对较短。短。短。短。2.2.非病毒载体介导的基因转移系统非病毒载体介导的基因转移系统 （1 1）脂质体介导的基因转移技术）脂质体
11、介导的基因转移技术 脂质体介导的基因转移技术运用便利、脂质体介导的基因转移技术运用便利、成本低廉。成本低廉。基本原理基本原理:利用阳离子脂质体单体与利用阳离子脂质体单体与DNADNA混合后，可以自动形成包埋外源混合后，可以自动形成包埋外源DNADNA的的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源细胞内吞作用将外源DNADNA（即目的基因）转（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。移至细胞内，并进行表达。（2）受体介）受体介导转导转移技移技术术 将将DNA与与细细胞胞或或组组织织亲亲和和性性的的配配体体偶偶联联，可可使使DNA具具有有靶靶向向性性。
12、这这种种偶偶联联通通常常通通过过多多聚聚阳阳离离子子（如如多多聚聚赖赖氨氨酸酸）来来实实现现。多多聚聚阳阳离离子子与与配配体体共共价价连连接接后后，又又通通过过电电荷荷相相互互作作用用与与带带负负电电荷荷的的DNA结结合合，将将DNA包包围围，只只留留下下配配体体暴暴露露于于表表面面。这这样样形形成成的的复复合合物物可可被被带带有有特特异异性性受受体体的的靶靶细细胞胞吞吞饮饮，从而将外源，从而将外源DNA导导入靶入靶细细胞。胞。（3）基因干脆注射技）基因干脆注射技术术 不不须须要要进进行行基基因因工工程程的的繁繁琐琐操操作作，干干脆脆将将袒袒露露基基因因DNA注注入入动动物物肌肌肉肉或或某某些
13、些器器官官组织组织内。内。三、基因干预三、基因干预基因干预的种类：n n1.反反义义RNA(antisense RNA)n n2.干干扰扰RNA(RNA interference)（一）反（一）反义义RNA 1.反反义义RNA与基因表达与基因表达调调控控 利用反利用反义义RNA对对体外培育的体外培育的细细胞胞进进行基因表行基因表达达调调控，通常接受的方法有两种：控，通常接受的方法有两种：（1）体外合成反）体外合成反义义RNA，干脆作用于培育，干脆作用于培育细细胞，胞，细细胞吸取胞吸取RNA后，后，发挥发挥作用。作用。（2）构建能）构建能转录转录反反义义RNA的重的重组质组质粒，将粒，将质质粒粒
14、转转入入细细胞，胞，转录转录出反出反义义RNA而而发挥发挥作用。作用。2.受体介受体介导导反反义义RNA技技转转移移术术 基基基基本本本本原原原原理理理理：将将将将脱脱脱脱唾唾唾唾液液液液酸酸酸酸血血血血清清清清类类类类粘粘粘粘蛋蛋蛋蛋白白白白（ASGPASGP）与与与与多多多多聚聚聚聚赖赖赖赖氨氨氨氨酸酸酸酸（PLPL）共共共共价价价价连连连连接接接接，得得得得到到到到ASGP-PLASGP-PL复复复复合合合合物物物物，成成成成为为为为运运运运载载载载核核核核酸酸酸酸的的的的工工工工具具具具。ASGP-PLASGP-PL反反反反义义义义RNARNA复复复复合合合合物物物物可可可可以以以以专
15、专专专一一一一性性性性地地地地被被被被肝肝肝肝细细细细胞胞胞胞表表表表面面面面的的的的ASGPASGP受受受受体体体体所所所所识识识识别别别别，并并并并吞吞吞吞噬噬噬噬到到到到肝肝肝肝细细细细胞胞胞胞中中中中，反反反反义义义义RNARNA进进进进入入入入肝肝肝肝细细细细胞后，可被胞后，可被胞后，可被胞后，可被渐渐释渐渐释渐渐释渐渐释放出来放出来放出来放出来发挥发挥发挥发挥作用。作用。作用。作用。借借助助受受体体介介导导DNA转转移移方方法法把把DNA换换成成反反义义RNA，就可以就可以实现实现受体介受体介导导的反的反义义RNA的的转转移。移。（二）干（二）干扰扰RNA 1.RNA干干扰现扰现象
16、象 RNA干扰（干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双链）是一种由双链RNA诱发的基因诱发的基因缄默现象。在此过程中，与双链缄默现象。在此过程中，与双链RNA有有同源序列的信使同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，）被降解，从而抑制该基因的表达。从而抑制该基因的表达。2.RNA干干扰扰的机制的机制 RNARNA干干干干扰过扰过扰过扰过程主要有程主要有程主要有程主要有2 2个步个步个步个步骤骤骤骤：（1 1）小干）小干）小干）小干扰扰扰扰性性性性RNARNA（siRNAsiRNA）（2 2）siRNAsiRNA与与与与细细细细胞内的某些胞内的某些胞内的某些胞内的某些酶酶酶
17、酶和蛋白和蛋白和蛋白和蛋白质质质质形成复合形成复合形成复合形成复合体，称体，称体，称体，称为为为为RNARNA诱导诱导诱导诱导的的的的缄缄缄缄默复合体（默复合体（默复合体（默复合体（RNA-RNA-induced silencing complex,RISC)induced silencing complex,RISC)。该该该该复合体可复合体可复合体可复合体可识别识别识别识别与与与与siRNAsiRNA有同源序列的有同源序列的有同源序列的有同源序列的mRNAmRNA，并在特异，并在特异，并在特异，并在特异的位点将的位点将的位点将的位点将该该该该mRNAmRNA切断。切断。切断。切断。长长长长
18、双双双双链链链链RNARNA被被被被细细细细胞内的双胞内的双胞内的双胞内的双链链链链RNARNA特异性核酸特异性核酸特异性核酸特异性核酸酶酶酶酶DicerDicer切成切成切成切成21-2321-23个碱基个碱基个碱基个碱基对对对对的短双的短双的短双的短双链链链链RNARNA，称，称，称，称为为为为小干小干小干小干扰扰扰扰性性性性RNARNA（small interfering RNAsmall interfering RNA，siRNAsiRNA）。）。）。）。3.RNA干干扰扰的的应应用前景用前景 RNA干干扰扰探探讨讨目目前前已已经经在在功功能能基基因因组组学学探探讨讨、微微生生物物学学探探讨讨、基基因因治治疗疗和和信信号号转转导导等等广广泛泛领领域域取取得得了了令令人人瞩瞩目目的的进进展展，使使其其在在医医学学、生生物学物学领领域的域的应应用有着广袤的前景。用有着广袤的前景。感谢观看