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1、基因治疗肿瘤的策略基因治疗肿瘤的策略生工生工0902班班aa肿瘤肿瘤肿瘤（肿瘤（tumor）是一种当调整正常细）是一种当调整正常细胞生长的限制系统失灵的时候所发胞生长的限制系统失灵的时候所发生的疾病。生的疾病。引起肿瘤的缘由很多：引起肿瘤的缘由很多：物理因素物理因素物理因素物理因素化学因素化学因素化学因素化学因素病毒感染病毒感染病毒感染病毒感染任何缘由引起的细胞癌变都是干脆或任何缘由引起的细胞癌变都是干脆或间接引起宿主细胞基因功能的变更所间接引起宿主细胞基因功能的变更所致，因此，肿瘤是一种基因病。致，因此，肿瘤是一种基因病。与肿瘤有关的两类基因：与肿瘤有关的两类基因：癌基因（癌基因（Ontog
2、eny,oncOntogeny,onc）抑癌基因（抑癌基因（Tumor suppressor geneTumor suppressor gene）癌基因（癌基因（癌基因（癌基因（oncogene,onconcogene,onc）是指细胞内限制细胞正）是指细胞内限制细胞正）是指细胞内限制细胞正）是指细胞内限制细胞正常生长的基因常生长的基因常生长的基因常生长的基因(原癌基因原癌基因原癌基因原癌基因)，在异样表达时，这，在异样表达时，这，在异样表达时，这，在异样表达时，这些基因不受体内各种调整因素的影响，可持续些基因不受体内各种调整因素的影响，可持续些基因不受体内各种调整因素的影响，可持续些基因不受
3、体内各种调整因素的影响，可持续表达，或高活性表达，其产物可使细胞持续增表达，或高活性表达，其产物可使细胞持续增表达，或高活性表达，其产物可使细胞持续增表达，或高活性表达，其产物可使细胞持续增殖。殖。殖。殖。原癌基因原癌基因原癌基因原癌基因:（Proto-oncProto-onc）是一种正常的细胞基因，）是一种正常的细胞基因，）是一种正常的细胞基因，）是一种正常的细胞基因，在正常细胞中编码关键性调控蛋白，在细胞增在正常细胞中编码关键性调控蛋白，在细胞增在正常细胞中编码关键性调控蛋白，在细胞增在正常细胞中编码关键性调控蛋白，在细胞增殖和分化中起重要调控作用，当其突变或调控殖和分化中起重要调控作用，
4、当其突变或调控殖和分化中起重要调控作用，当其突变或调控殖和分化中起重要调控作用，当其突变或调控失灵时可引起细胞癌变失灵时可引起细胞癌变失灵时可引起细胞癌变失灵时可引起细胞癌变 肿瘤基因治疗已成为肿瘤生物治疗最引人瞩目的探讨领域，是继手术、放疗、化疗、免疫治疗之后的第五种模式,是肿瘤治疗的有益补充。基因治疗就是用正常或野生型基因校正或置换致病基因的一种治疗方法。基因治疗的程序基因治疗的程序选择治疗基因选择治疗基因选择运运输治治疗基因的基因的载体体将治将治疗基因基因导入体内或靶入体内或靶细胞胞治治疗基因在体内表达基因在体内表达基因治疗的基本程序：基因治疗的基本程序：1.目的基因准备；目的基因准备；
5、2.受体细胞（靶细胞）培育；受体细胞（靶细胞）培育；3.载体的选择与克隆；载体的选择与克隆；4.将目的基因导入靶细胞；将目的基因导入靶细胞；5.转导细胞的选择和鉴定；转导细胞的选择和鉴定；6.基因治疗的平安性鉴别及疗效评基因治疗的平安性鉴别及疗效评价。价。基因治疗的主要措施有：基因治疗的主要措施有：1.基因置换（基因置换（genereplacement）将致病基因完全的）将致病基因完全的换以换以正常基因，使致病基因永久的得到更正常基因，使致病基因永久的得到更正；正；2.基因修正（基因修正（genecorrection）将基因的突变碱基）将基因的突变碱基序列序列订正，而正常部分赐予保留；订正，而
6、正常部分赐予保留；3.基因修饰（基因修饰（geneaugmentation）将目的基因导入）将目的基因导入病变病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产细胞或其它细胞，目的基因的表达产物修饰改物修饰改变缺陷细胞的功能，或使原有的功能得变缺陷细胞的功能，或使原有的功能得到增加；到增加；4.基因失活（基因失活（geneinactivation）应用反义核苷酸或）应用反义核苷酸或核酶特异核酶特异的封闭某些致病基因的表达；的封闭某些致病基因的表达；区分几个概念：区分几个概念：将目的基因导入细胞或细菌，针对目的基因叫将目的基因导入细胞或细菌，针对目的基因叫做转移（做转移（transfer）针对宿主细胞叫做转导
7、（针对宿主细胞叫做转导（transduction）而这一过程叫做转染（而这一过程叫做转染（transfection）目的基因导入细胞导致宿主细胞的基因组分级目的基因导入细胞导致宿主细胞的基因组分级至性状的变更叫做转化（至性状的变更叫做转化（transformation）第一节第一节增加宿主抗肿瘤免疫增加宿主抗肿瘤免疫肿瘤疫苗的作用肿瘤疫苗的作用抗抗肿肿瘤瘤免免疫疫有有关关的的转转基基因因治治疗疗是是肿肿瘤瘤基基因因治治疗疗的的最最初初方方案案。为为增增加加机机体体免免疫疫系系统统对对肿肿瘤瘤的的识识别别，免疫基因治疗主要包括免疫基因治疗主要包括一、通过一、通过APC增加对肿瘤抗原的识别与呈递。
8、增加对肿瘤抗原的识别与呈递。二、增加肿瘤细胞表达细胞因子。二、增加肿瘤细胞表达细胞因子。三、增加肿瘤细胞表达的共刺激分子。三、增加肿瘤细胞表达的共刺激分子。其次节 复原和增加抑癌基因的功能引入抑癌基因 抑癌基因是抗肿瘤基因治疗中一类极为重要的目的基因，将这类基因导入肿瘤细胞或非肿瘤细胞，其表达产物通过困难的基因调整或活化代谢机制，能抑制肿瘤的恶性生长，甚至可导致癌细胞逆转。虽然肿瘤的发生发展是一个多基因参与、多步骤形成的过程，但在这些过程中某种癌基因的激活或抑癌基因的失活可能起到了关键性的作用。第第三三节节阻阻断断癌癌基基因因功功能能-反反义义核核酸酸RNA干干扰扰技技术术细细胞胞中中原原癌癌
9、基基因因的的表表达达受受到到严严格格限限制制。ras、myc、src这这一一类类癌癌基基因因由由于于突突变变而而使使其其功功能能处处于于异异样样活活跃跃状状态态，不不断断地地激激活活细细胞胞内内正正性性调调控控细细胞胞生生长长和和增增殖殖的的信信号号传传递递通通路路，促促使使细细胞胞异异样样生生长长。因因此此基基因因治治疗疗思思路路也也可可以以将将癌癌基基因因反反义义序序列列导导入入癌癌细细胞胞来来拮拮抗抗癌癌基基因因；或或引引入入非非等等位位rev等等方方法法，阻挡癌基因功能。阻挡癌基因功能。反义核酸技术的基本原理是依据核酸碱基互补配对的规律设计出能与靶基因特定区域结合的DNA或RNA，以影
10、响其靶基因的表达，抑制其功能。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA分子介导的序列特异性转录后基因缄默过程，为双链RNA分子在mRNA水平上关闭相关基因表达的过程,是一项新兴的基因阻断技术。RNAi是一种转录后基因缄默(post transcriptional gene silencing,PTGS)现象。与与传传统统的的基基因因探探讨讨方方法法基基因因敲敲除除、定定点点突突变变、反反义义核核酸酸及及核核酶酶技技术术等等相相比比，RNAi具具有有以以下下五大特点：五大特点：基因序列特异性；基因序列特异性；dsRNA的稳定性；的稳定性；缄默信号传递性；缄默信号传递
11、性；Knock-down高效性；高效性；RNAi效用浓度依靠性。效用浓度依靠性。第四第四节节核核酶酶用于基因治用于基因治疗疗1983年年美美国国Cech和和Altmann发发觉觉并并鉴鉴定定了了一一类类具具有有酶酶催催化化作作用用的的核核苷苷酸酸片片断断，称称为为核核酶酶(Ribozyme)。这这一一发发觉觉使使酶酶的的概概念从蛋白念从蛋白领领域域扩扩展到核酸展到核酸领领域。域。核核酶酶具具有有核核苷苷酸酸内内切切酶酶的的活活性性，它它能能在在无无蛋白蛋白质质的条件下切割靶的条件下切割靶RNA分子。分子。核酶用于基因治疗的条件是 找出肿瘤发生发展中关键性的蛋白质；这种蛋白的氨基酸序列（和编码基
12、因序 列）必需是已知的，以便设计核酶的切 割位点；所设计的核酶必需能够切割靶RNA；肿瘤细胞必需能摄取这种核酶，并能在细胞内切割靶RNA。反义治疗并不像刚起先人们所想像的那么简洁，目前还有很多关键性问题有待去解决，如生物学稳定性，药物的释放系统，以及由序列特异性和非特异性所引起的作用包括毒副作用等。应用反义技术进行肿瘤基因治疗最常用的靶基因有Ha-ras、c-myc、c-fos、c-jum、c-erbB2等癌基因以及编码端粒酶基因，或端粒酶的RNA部分。第五第五节节抗抗肿肿瘤血管生成的基因治瘤血管生成的基因治疗疗肿肿瘤的生瘤的生长长、转转移与新生血管的形移与新生血管的形成成亲亲密相关密相关,由
13、于由于肿肿瘤的血管生成受到瘤的血管生成受到血管生血管生长长因子、血管生因子、血管生长长抑制因子以抑制因子以及其它的因子的共同及其它的因子的共同调调控控,因此通因此通过过阻阻断促血管生断促血管生长长因子作用或者因子作用或者强强化血管化血管生生长长抑制因子的表达均可达到治抑制因子的表达均可达到治疗疗的的目的。目的。一、阻断血管生一、阻断血管生长长因子的作用因子的作用主主要要是是接接受受反反义义DNA、中中和和性性抗抗体体、受受体酪氨酸激体酪氨酸激酶酶的抑制的抑制剂剂以及核以及核酶酶等。等。用用腺腺病病毒毒载载体体介介导导的的VEGF的的拮拮抗抗物物输输入入鼠卵巢癌抑制鼠卵巢癌抑制VEGF的活性；的
14、活性；利利用用含含有有VEGFcDNA的的腺腺病病毒毒载载体体转转染染乳乳腺腺癌癌细细胞胞,用用以以拮拮抗抗VEGF的的促促血血管管生生成成作用；作用；用用抗抗VEGF的的核核酶酶抑抑制制VEGF的的表表达达,使使卵卵巢癌生巢癌生长长及血管生成削减的及血管生成削减的报报告。告。针针对对其其它它的的血血管管生生成成因因子子的的治治疗疗,如如bFGF,缺缺氧氧诱诱导导因因子子(HIF),EGF,PDGF,PDECGF,IGF,Ets-1,HGF等等的的因因子子的的治治疗疗。二、上二、上调调血管生血管生长长抑制因子抑制因子 用重组血管抑素用重组血管抑素cDNA输入消化道肿瘤输入消化道肿瘤可取得较好的
15、治疗效果可取得较好的治疗效果,用编码内皮抑素的重组腺病毒载体可抑制用编码内皮抑素的重组腺病毒载体可抑制内皮细胞迁移和内皮细胞迁移和VEGF介导的血管生成介导的血管生成,病毒载体介导的重组编码病毒载体介导的重组编码PF4的反义基因显的反义基因显示出抗鳞癌血管生长的作用。示出抗鳞癌血管生长的作用。三三、抑抑制制细细胞胞外外基基质质和和基基膜膜降降解解以以及及抑抑制制内内皮皮细细胞特异性粘附分子的作用胞特异性粘附分子的作用用用腺腺病病毒毒载载体体介介导导的的T1MP-1基基因因转转染染肿肿瘤瘤细细胞胞,瘤瘤细细胞胞产产生生的的T1MP-1 抑抑制制了了MMP-2,MMP-9的的活活性性,使使内内皮皮
16、细细胞胞的的迁迁移移受受到到抑抑制制。Gondi等等接接受受双双顺顺反反子子逆逆转转录录病病毒毒载载体体介介导导的的反反义义uPAR和和uPA治治疗疗胶胶质质瘤瘤,明明显显抑抑制制了了肿肿瘤瘤的血管生成。的血管生成。第五节第五节 、加大肿瘤细胞与正常细胞的自然差别、加大肿瘤细胞与正常细胞的自然差别 自自杀基因治疗杀基因治疗自自杀杀基基因因（suicide suicide genegene）治治疗疗思思路路就就是是人人为为地地变变更更肿肿瘤瘤细细胞胞的的状状态态，将将一一些些“自自杀杀基基因因”(TK”(TK基基因因、CDCD基基因因和和较较新新的的细细胞胞色色素素p450-2B1p450-2B
17、1基基因因)转转导导入入肿肿瘤瘤细细胞胞中中，这这些些基基因因所所表表达达的的产产物物能能将将原原先先对对细细胞胞无无毒毒或或相相对对低低毒毒的的物物质质转转变变为细胞毒性物质，而引起到杀伤细胞的作用。为细胞毒性物质，而引起到杀伤细胞的作用。自杀基因治疗对免疫功能的激发作用自杀基因治疗对免疫功能的激发作用诱导炎症细胞浸润（诱导炎症细胞浸润（T T细胞、单核细胞、细胞、单核细胞、中性粒细胞）；中性粒细胞）；诱导细胞因子的分泌（诱导细胞因子的分泌（IL-1IL-1、TNF-TNF-、IL-1IL-1、IL-6IL-6、mRNAmRNA在治疗后第在治疗后第2 2天起先表天起先表达达,而而IFN-IF
18、N-、GM-CSFGM-CSF在治疗后第在治疗后第2 2天起先表天起先表达，到治疗后第达，到治疗后第4 4天仍有表达，其中以天仍有表达，其中以TNF-TNF-表达上升最明显）。表达上升最明显）。第六节第六节 提高化疗效应提高化疗效应耐药基因治疗耐药基因治疗 肿肿瘤瘤化化疗疗中中最最难难处处理理的的问问题题之之一一 就就是是出出现现瘤瘤细细胞胞对对很很多多常常用用化化疗疗药药物物产产生生抗抗药药性性和和交交叉叉抗抗药药性性，有有些些肿肿瘤瘤起起先先敏敏感感，但但经经过过一一段段时时间间后后出出现现耐耐药药性性,这这种种耐耐药药性性常常表表现现为为肿肿瘤瘤细细胞胞对对多多种种结结构构不不同同、作作
19、用用靶靶位位不不同同、作作用用方方式式不不同同的的抗抗肿肿瘤瘤药药物物具具有有反反 抗抗 性性,称称 为为 多多 药药 耐耐 药药(multidruge(multidruge resistance,MDR)resistance,MDR)。在肿瘤治疗中多数抗癌药物是促进细胞凋亡的，而癌细胞的耐药是化疗中最麻烦的问题。在报道中将BCl-2转入癌细胞则癌细胞变为耐药，目前从凋亡角度来探讨肿瘤的耐药性，可能找到新的解决方法。第七第七节节肿肿瘤基因治瘤基因治疗疗探探讨讨面面临临的主要的主要问题问题基因治基因治疗疗是是21世世纪纪治治疗恶疗恶性性肿肿瘤的重要手段。瘤的重要手段。一、基因一、基因导导入的入的
20、载载体系体系统统目目前前所所接接受受的的载载体体主主要要分分为为转转染染性性和和转转导导性性载载体。体。转转染染性性载载体体是是利利用用化化学学或或物物理理方方法法增增加加细细胞胞膜膜的的通通透透性性而而将将DNA转转染染入入细细胞胞内内,包包括括脂脂质质体体和和基因基因枪枪等。等。转转导导性性载载体体则则是是利利用用病病毒毒对对细细胞胞的的自自然然亲亲和和力力把把遗传遗传物物质质引入宿主引入宿主细细胞。胞。转转染染的的方方法法相相对对简简易易,抗抗原原性性弱弱但但效效率率较较低低,而而且且基基因因表表达达的的长长久久性性不不够够。因因此此它它在在肿肿瘤瘤基基因因治治疗疗中中的的运运用用受受到
21、到限限制制。转转导导法法则则效效率率高高,作作用用长长久久,但但抗抗原原性性较较强强,目目前前大大多多数数基基因因治治疗疗程程序序仍仍以以病病毒毒介介导导。逆逆转转录录病病毒毒是是目目前前最最为为成成熟熟、运运用用最最广广的的进进行基因行基因转转移的移的载载体系体系统统。二、基因治二、基因治疗疗的靶向性策略的靶向性策略带带有有目目的的基基因因的的载载体体如如何何到到达达“靶靶细细胞胞”是是肿肿瘤瘤基基因因治治疗疗的的关关键键。只只有有提提高高基基因因转转导导的的靶靶向向性性,才才能能实实现现治治疗疗的的针对针对性和平安性。性和平安性。目前解决基因的靶向目前解决基因的靶向转转移及表达有移及表达有
22、3种策略种策略用用基基因因工工程程手手段段改改造造基基因因载载体体,如如改改造造逆逆转转录录病病毒毒包包装装细细胞胞中中的的原原病病毒毒env序序列列,使使所所包包装装的的重重组组病病毒毒特特异异地地识识别别位位于于靶靶细细胞胞表表面面的的抗抗原原或或受受体体确确定定簇簇;在在体体内内基基因因传传递递系系统统中中共共价价连连接接抗抗瘤瘤抗抗体体和和肿肿瘤瘤细细胞胞特特异异受受体体的的配配基基,使使基基因因在在类类似似“生生物物导导弹弹”作用下被送到作用下被送到肿肿瘤瘤细细胞表面胞表面;应应用用肿肿瘤瘤细细胞胞特特异异蛋蛋白白“管管家家基基因因”的的基基因因表表面面调调控控元元件件,在在转转录录
23、水水平平调调控控目目的的基基因因在在靶靶细细胞胞中中特特异异表表达达。国国外外已已起起先先针针对对VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2设设计计反反义义基基因因或或调调控控VEGF的的基基因因作作为为目的基因目的基因,这这种思路很有种思路很有发发展前途。展前途。三、外源基因在体内表达的可控性三、外源基因在体内表达的可控性外外源源基基因因导导入入后后,在在体体内内的的表表达达若若能能人人为为调调控控,将将对对恶恶性性肿肿瘤瘤及及诸诸多多疾疾病病的的基基因因治治疗疗有有所所突突破破。目目前前已已经经发发觉觉了了一一个个可可诱诱导导的的调调控控系系统统TAXI/UAS系系统统。该该系系统统应应用用
24、一一个个酵酵母母GAL4的的顺顺式式元元件件作作为为外外源源基基因因的的上上游游,另另组组建建一一个个激激素素受受体体(孕孕酮酮)及及一一段段GAL4的的反反调调控控基基因因子子的的嵌嵌体体,将将两两个个载载体体共共转转染染靶靶细细胞胞后后,只只有有当当诱诱导导物物(孕孕酮酮)或或其其拮拮抗抗物物(米米非非司司酮酮)存存在在时时,目目的的基基因因才才能能表表达。达。四、其他四、其他缘缘由由某某些些体体内内原原代代细细胞胞转转基基因因及及基基因因表表达达水平往往不及体外建株水平往往不及体外建株细细胞；胞；靶基因在体内表达持靶基因在体内表达持续时间较续时间较短；短；在在处处理理多多系系统统基基因因
25、紊紊乱乱过过程程中中基基因因治治疗疗的作用的作用远远未清晰；未清晰；基基因因治治疗疗刚刚起起先先用用于于人人体体试试验验，其其长长期期疗疗效效和和不不良良作作用用尚尚不不清清晰晰，有有待待于于大大量量的的试验试验探探讨讨问题问题与展望与展望肿肿瘤基因治瘤基因治疗疗的探的探讨进讨进展很快，展很快，临临床上在部床上在部分分肿肿瘤中运用基因治瘤中运用基因治疗疗已已经显经显示出示出较较好的抗癌、好的抗癌、抑癌作用与抑癌作用与较较稍微的副作用，但稍微的副作用，但还须还须要要进进一步增一步增加加该疗该疗法的特异性与基因法的特异性与基因转导转导靶癌靶癌细细胞的有效性胞的有效性探探讨讨。目前运用最多的是病毒目
26、前运用最多的是病毒载载体，如：逆体，如：逆转录转录病病毒、腺病毒、腺相关病毒和疱疹病毒。非病毒的毒、腺病毒、腺相关病毒和疱疹病毒。非病毒的基因治基因治疗疗方法包括：脂方法包括：脂质质体、无体、无载载体的体的DNA（裸（裸DNA）注射、蛋白）注射、蛋白DNA复合物（基因复合物（基因枪枪）、磷酸）、磷酸钙试剂钙试剂、电电启启动动子、子、细细胞内微量注射胞内微量注射DNA等。等。尽尽管管在在体体内内载载体体的的转转导导与与表表达达率率尚尚不不够够志志向向，临临床床上上还还没没有有较较全全面面的的成成功功阅阅历历，但但面面对对困困难难的的基基因因治治疗疗，目前探，目前探讨讨重点策略在于重点策略在于增加增加对肿对肿瘤的免疫反瘤的免疫反应应。修修复复细细胞胞周周期期中中由由肿肿瘤瘤抑抑制制基基因因丢丢失失或或癌癌基基因因激激活活而造成的而造成的细细胞胞DNA损伤损伤。自自杀杀基基因因的的策策略略还还有有基基因因标标记记探探讨讨与与在在基基因因治治疗疗中中对对正常正常组织组织的的爱护爱护措施等。措施等。只只有有解解决决了了这这一一系系列列问问题题后后，基基因因治治疗疗才才能能真真正正用于用于临临床，造福于床，造福于肿肿瘤患者。瘤患者。