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1、Gene diagnosis and gene therapyGene diagnosis and gene therapy基因诊断基因诊断(genediagnosis)：以以DNA和和RNA为诊断材料，为诊断材料，应用分子应用分子生物学技术方法，干脆检查基因的结构、或生物学技术方法，干脆检查基因的结构、或表达是否异样，对人体状态和疾病作出诊断表达是否异样，对人体状态和疾病作出诊断的方法。的方法。一、诊断下列两种类型疾病：一、诊断下列两种类型疾病：1、内源基因的变异、内源基因的变异 基因结构的异样基因结构的异样基因致病基因致病 基因表达的异样基因表达的异样2、外来生物的入侵、外来生物的入侵 基
2、因诊断的特点：基因诊断的特点：1.特异性高，针对性强：特异性高，针对性强：运用基因探针通过分子运用基因探针通过分子杂交进行高特异性分析以基因作为检测对象，杂交进行高特异性分析以基因作为检测对象，属于病因诊断或发病缘由分析。属于病因诊断或发病缘由分析。2.灵敏度高灵敏度高:用放射性同位素、酶或化学发光试用放射性同位素、酶或化学发光试剂标记探针，有很高的检测灵敏度，剂标记探针，有很高的检测灵敏度，PCR扩增扩增也有很高的灵敏度。也有很高的灵敏度。3.早期诊断：无临床表现早期诊断：无临床表现4.取样便利：不受组织时相限制取样便利：不受组织时相限制5.平安高效：不必培育高危病菌病毒，还可分亚平安高效：
3、不必培育高危病菌病毒，还可分亚型型6.适应范围广：可检测内源性基因和外来基因。适应范围广：可检测内源性基因和外来基因。二、基因诊断的遗传标记n1.人类基因组中存在三类主要的遗传变异n（1）第一代多态性标记是RFLP（限制性片段长度多态性)n(2)其次代短串联重复多态性（short tandem repeat polymorphism STRP）n(3)第三代多态性标记是单核苷酸的多态性SNP第一代多态性标记是RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性）其次代多态性标记是短的串联重复序列 包括小卫星DNA和微卫星DNA，其多态
4、性主要来自重复序列拷贝数的变更小卫星DNA由15-65bp的基本单位串联重复而成，长度一般不超过20kb。重复次数（小卫星DNA区的长度）在人群中是高度变异的；依据孟德尔的规律遗传微卫星DNA/简短串联重复（STR、STRP或SSLP）重复单元2-8bp，通常重复10-60次CTAGCTTATATATATATATATATATATATAAGCTTGC第三代多态性标记是单核苷酸的多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）SNP：是由于单个核苷酸变更而导致的核酸序列多态。人类999的基因密码是相同的，而差异不到01，不同人群仅有140万个核苷酸差异。这些差异是由“
5、单一核苷酸多样性”（SNP）产生的，它构成了不同个体的遗传基础,从而说明人类不同“种属”之间并没有本质上的区分。SNP与RFLP和STR标记的主要不同之处在于，它不再以DNA片段的长度变更作为检测手段，而干脆以序列变异作为标记。三、人类疾病与基因亲密相关n1、基因结构变更导致蛋白质的结构或数量发生变更导致疾病n2、基因表达异样n3、病原生物基因入侵导致疾病n4、可遗传的基因组变异导致人类疾病易感性差异四、基因诊断中常用的分子生物学技术四、基因诊断中常用的分子生物学技术n核酸分子杂交（核酸分子杂交（Nucleic acid hybridizationNucleic acid hybridizat
6、ion）n聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)(PCR)n单链构象多态性（单链构象多态性（SSCPSSCP）n限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLPRFLP）nDNADNA序列测定（序列测定（DNA sequencingDNA sequencing）n生物芯片（生物芯片（biochipsbiochips）nWesternWestern免疫印迹（免疫印迹（Western blottingWestern blotting）n免疫组织化学诊断免疫组织化学诊断 基因诊断中常用的分子生物学方法比较基因诊断中常用的分子生物学方法比较 方法方法 优优点与点与问题问题 解决方案解决方案核酸分子
7、核酸分子杂杂交交结结果可靠但操作繁果可靠但操作繁琐琐选择选择合适的探合适的探针针 PCRPCR灵敏度、特异性高灵敏度、特异性高设计设计合适的引物合适的引物 SSCPSSCP操作操作简简便、便、检检出率不高出率不高选择选择合适的片段合适的片段 RFLPRFLP结结果可靠但限制果可靠但限制较较多多选择选择合适的限制合适的限制酶酶 DNADNA测测序序可自可自动动化，但不适宜广泛使用化，但不适宜广泛使用 与与PCRPCR配合使用配合使用生物芯片生物芯片效率高，成本高，不适宜广泛效率高，成本高，不适宜广泛使用使用选择选择合适的芯片合适的芯片 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断 GeneDiagnosis
8、ofHereditaryDiseases（一）镰状细胞贫血病（一）镰状细胞贫血病一、血红蛋白病一、血红蛋白病1.镰状红细胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者基因诊断-ASO杂交法杂交法2.2.HBS的限制性内切酶谱分析的限制性内切酶谱分析3.3.HBS的的PCR-RFLP分析分析 n正常的（正常的（N N）的）的ASOASO探针探针：5-ACTCCTGAGGAGAAGTCTGC-3n突变的（突变的（M M）的）的ASOASO探针探针：5-ACTCCTGTGGAGGAAGTCTGC-31.1.镰状红细胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者基因诊断ASOASO杂交法杂交法MNMNMNMN53正常基因
9、正常基因1.15kb(CCT GAG G)53突变基因突变基因1.35kb(CCT GTG G)镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析MstMst酶切位点酶切位点（CCTNAGG）2.HBS2.HBS的限制性内切酶谱分析的限制性内切酶谱分析目目录录0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带者突变携带者患者患者镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析目目录录PCR-SSCP技术检测技术检测DNA突变突变 传染病的基因诊断传染病的基因诊断 GeneDiagnosisofInfectiousDiseases 一、病毒性疾病一、
10、病毒性疾病n甲型肝炎病毒（甲型肝炎病毒（HAVHAV）HAVHAV系系RNARNA病病毒毒，利利用用RT-PCRRT-PCR技技术术可可从从粪粪便便中中检检测出甲型肝炎病毒的基因组测出甲型肝炎病毒的基因组RNARNA。n乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBVHBV）设设计计保保守守区区序序列列引引物物，扩扩增增各各型型HBV HBV DNADNA片片段段；设设计计位位于于可可变变区区的的引引物物扩扩增增某某一一亚亚型型HBV HBV DNADNA，以便分型。以便分型。n丙型肝炎病毒（丙型肝炎病毒（HCVHCV）HCVHCV为为正正链链RNARNA病病毒毒，先先反反转转录录成成cDNAcDNA，再再
11、进进行行巢式巢式PCRPCR检测检测HCVHCV。肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断GeneDiagnosisofMalignantTumors一、原癌基因与抑癌基因的检测一、原癌基因与抑癌基因的检测1 1原癌基因的检测原癌基因的检测ras基基因因家家族族由由H-ras、K-ras和和N-ras组组成成。最最常常见见的的突突变变是第是第12、13、59或第或第61位密码子的点突变。位密码子的点突变。胰胰腺腺癌癌、结结肠肠癌癌、肺肺癌癌以以K-ras突突变变为为主主，如如第第12位位密密码码子子突突变变，由由编编码码甘甘氨氨酸酸的的GGT突突变变为为TGT、GTT或或GAT，少少数突变为数突变为GCT
12、。急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以N-ras突变突变为主；泌尿系统肿瘤则以为主；泌尿系统肿瘤则以H-ras突变为主。突变为主。PCR及及PCR-SSCP分分析析：扩扩增增ras基基因因第第12位位密密码码子子点点突突变变部部位位，再再用用SSCP技技术术进进行行分分析析，或或者者干干脆测序确定患者脆测序确定患者ras原癌基因的点突变。原癌基因的点突变。核核苷苷酸酸杂杂交交技技术术（如如ASO）：检检测测ras基基因因第第12位位密码子点突变。密码子点突变。2.2.ras ras原癌基因突变常用的检测方法原癌基因突变常用的检测方法3 3抑癌基因
13、抑癌基因p53p53的检测的检测np53p53基基因因以以密密码码子子第第175175位位、第第248248位位、第第249249位位、第第273273位位及及 第第282282位位点点突突变变率率最最高高。在在结结直直肠肠癌癌、乳腺癌、小细胞肺癌，都可见异样的乳腺癌、小细胞肺癌，都可见异样的p53p53基因蛋白。基因蛋白。np53p53的基因诊断方法有的基因诊断方法有n （1 1）PCR-SSCPPCR-SSCP分析技术分析技术n （2 2）DNADNA序列分析序列分析n （3 3）PCR-RFLPPCR-RFLP分析分析基因治疗基因治疗GeneTherapyn基因治疗：基因治疗：指将目的基
14、因通过基因转移技术指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。物对疾病起治疗作用。（一）基因置换（一）基因置换（genereplacement）定定义义：指指将将特特定定的的目目的的基基因因导导入入特特定定细细胞胞，通通过过定定位位重重组组，导导入入的的正正常常基基因因，以以置置换换基基因因组组内内原原有有的缺陷基因。的缺陷基因。目的：将缺陷基因的异样序列进行桥正。目的：将缺陷基因的异样序列进行桥正。对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，
15、对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何变更。不涉及基因组的任何变更。一、基因治疗的策略一、基因治疗的策略n转转导导基基因因的的载载体体与与基基因因组组DNADNA具具有有相相同同的的序序列列。带带有有目目的的基基因因的的载载体体就就能能找找到到同同源源重重组的位点，进行部分基因序列的交换。组的位点，进行部分基因序列的交换。n基基因因同同源源重重组组技技术术又又称称为为基基因因打打靶靶（genetargeting)基因同源重组技术基因同源重组技术（二）（二）基因添加基因添加（geneaugmentation）定定义义:通通过过导导入入外外源源基基因因使使靶靶细细胞胞表表达达其
16、其本本身身 不表达的基因。不表达的基因。类型类型:在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；向靶细胞中导入靶细胞原来不表达的基因，利用其向靶细胞中导入靶细胞原来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。表达产物达到治疗疾病的目的。（三）基因干预（三）基因干预（gene interferencegene interference）定义：定义：接受特定的方式抑制某个基因的表接受特定的方式抑制某个基因的表达
17、，或者通过破坏某个基因的结构而使达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。之不能表达，以达到治疗疾病的目的。反义反义RNARNA，核酶，核酶，RNAiRNAi等等n定定义义：将将“自自杀杀”基基因因导导入入宿宿主主细细胞胞中中，这这种种基基因因编编码码的的酶酶能能使使无无毒毒性性的的药药物物前前体体转转化化为为细细胞胞毒毒性性代代谢谢物物，诱诱导导靶靶细细胞胞产产生生“自自杀杀”效效应应，从从而而达到清除肿瘤细胞的目的。达到清除肿瘤细胞的目的。n应用：应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。是恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。（四）自杀基因治疗（四）自杀基因治疗(Sui
18、cideGeneTherapy)自杀基因的作用机制自杀基因的作用机制 （五）基因免疫治疗（五）基因免疫治疗通过将抗癌免疫增加的细胞因子或通过将抗癌免疫增加的细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增加肿瘤微环境中的基因导入肿瘤组织，以增加肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。抗癌免疫反应。二、基因转移技术二、基因转移技术 基因治疗的两种途径基因治疗的两种途径体内法基因治疗体内法基因治疗体外法基因治疗体外法基因治疗基因转移基因转移(genetransfer)技术技术1.病毒介导的基因转移病毒介导的基因转移 2.2.非病毒介导的基因转移非病毒介导的基因转移 1.1.病毒介导的基因转移系统病毒介导的基因转移系统
19、病毒载体病毒载体 介介导导的的基基因因转转移移效效率率较较高高，也也是是运运用用最最多多的的基基因因治治疗疗载载体体。据据统统计计，有有72%72%的的临临床床试试验验支支配配和和71%71%的的病病例例运运用用了了病病毒毒载载体体，其其中中用得最多的是反转录病毒载体。用得最多的是反转录病毒载体。反转录病毒的结构及生活周期反转录病毒的结构及生活周期（1 1）反转录病毒）反转录病毒 RNARNA病毒病毒 HIV HIV 病毒的复制病毒的复制 p两端各有一长末端重复序列两端各有一长末端重复序列LTRLTR。反转录病毒前病毒的结构特点反转录病毒前病毒的结构特点 pLTRLTR由由U3U3、R R和和
20、U5U5三部分组成三部分组成。p病毒有三个结构基因病毒有三个结构基因p55端端LTRLTR下下游游有有一一段段病病毒毒包包装装所所必必需需的的序序列列（）及及剪剪接接供体位点供体位点(SD)SD)和剪接受体位点和剪接受体位点(SA)SA)。p含含有有负负链链DNADNA转转录录的的引引物物结结合合位位点点(PBS)PBS)和和正正链链DNADNA转转录录的的引物结合位点引物结合位点。l在在U3U3内有增加子和启动子；内有增加子和启动子；l U3 U3和和U5U5两端分别有病毒整合序列两端分别有病毒整合序列(IS)(IS)；l 在在R R内还有内还有poly(A)poly(A)加尾信号。加尾信号
21、。l lgaggag基因，编码核心蛋白和属特异性抗原；基因，编码核心蛋白和属特异性抗原；lpolpol基因，编码反转录酶；基因，编码反转录酶；lenvenv基基因因，编编码码病病毒毒外外壳壳或或包包膜膜糖糖蛋蛋白白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。反转录病毒载体的制备和转染反转录病毒载体的制备和转染反转录病毒介导的基因转移系统反转录病毒介导的基因转移系统1)1)反转录病毒载体：反转录病毒载体：它它可可以以克克隆隆并并表表达达外外源源治治疗疗基基因因，但但不不能能自我包装成有增殖实力的病毒颗粒。自我包装成有增殖实力的病毒颗粒。2 2）协助细胞株）协助细胞株(如如PA317)P
22、A317)：能能合合成成包包装装蛋蛋白白，用用于于反反转转录录病病毒毒载载体体包装。包装。反转录病毒载体的特点反转录病毒载体的特点1）反反转转录录病病毒毒包包膜膜上上糖糖蛋蛋白白，能能够够被被很很多多哺哺乳乳动动物物细细胞胞膜膜上上的的特特异异性性受受体体识识别别，从从而而使使反反转转录录病病毒毒携携带带的遗传物质高效地进入靶细胞。的遗传物质高效地进入靶细胞。2)前前病病毒毒通通过过LTRLTR高高效效整整合合至至靶靶细细胞胞基基因因组组中中，有利于外源基因在靶细胞中的有利于外源基因在靶细胞中的永久表达永久表达。3)病病毒毒颗颗粒粒以以出出芽芽的的方方式式分分泌泌至至协协助助细细胞胞培培育的上
23、清液中，易于分别制备。育的上清液中，易于分别制备。反转录病毒载体的主要缺点反转录病毒载体的主要缺点1）随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜）随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危急；在危急；2）反转录病毒载体的容量较小，只能容纳）反转录病毒载体的容量较小，只能容纳7kb以下的外源基因。以下的外源基因。（2）腺病毒）腺病毒(adenovirus)载体载体腺腺病病毒毒是是双双链链DNA病病毒毒。它它通通过过受受体体介介导导的的内内吞吞作作用用进进入入细细胞胞内内，然然后后腺腺病病毒毒基基因因组组转转移移至至细细胞胞核核内内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。保持在染色体外，不整合进入宿
24、主细胞基因组中。腺腺病病毒毒是是人人类类呼呼吸吸道道感感染染的的病病原原体体，但但目目前前尚尚未未发发觉觉与与肿肿瘤瘤发发生生有有关关联联。宿宿主主细细胞胞范范围围广广，可可感感染染分分裂裂和和非分裂终末分化细胞，如神经元等。非分裂终末分化细胞，如神经元等。腺病毒的优点腺病毒的优点l基因导入效率高，对人类平安；基因导入效率高，对人类平安；l宿主范围广；宿主范围广；l基因转导与细胞分裂无关；基因转导与细胞分裂无关；l重组腺病毒可通过口服经肠道吸取、或喷雾吸入重组腺病毒可通过口服经肠道吸取、或喷雾吸入或气管内滴注；或气管内滴注；l腺病毒载体容量较大，可插入腺病毒载体容量较大，可插入7.5 7.5
25、kbkb外源基因。外源基因。腺病毒载体缺点腺病毒载体缺点l宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。l靶向性差。靶向性差。l不不能能整整合合到到靶靶细细胞胞的的基基因因组组DNADNA中中。分分裂裂增增殖殖快快的的细细胞胞，导导入入的的重重组组病病毒毒载载体体，随随分分裂裂而而丢失的机会增多，丢失的机会增多，表达时间相对较短表达时间相对较短。（3 3）腺病毒相关病毒载体）腺病毒相关病毒载体 单单链链线线状状DNADNA缺缺陷陷型型病病毒毒。其其基基因因组组DNADNA小小于于5kb5kb，无无包包膜膜，外外形形为为袒袒露露的的2020面面体体颗颗粒粒。AAVA
26、AV不不能能独独立立复复制制，只只有有在在协协助助病病毒毒（如如腺腺病病毒毒、单单纯纯疱疱疹疹病病毒毒等等）存存在在时时，才才能能进进行行复复制制和和溶溶细细胞胞性性感感染染，否则只能建立溶源性潜藏感染。否则只能建立溶源性潜藏感染。AAVVirusParticlesAAV载载体体是是目目前前正正在在探探讨讨的的一一类类新新型型平平安安载载体体，它对人类无致病性。它对人类无致病性。AAV可可以以高高效效定定点点整整合合至至人人19号号染染色色体体的的特特定定区区域域19q13.4中中，并并能能较较稳稳定定地地存存在在。这这种种靶靶向向定定点点整整合合可可以以避避开开随随机机整整合合可可能能带带来
27、来的的抑抑癌癌基基因因失失活活和和原原癌癌基基因因激激活活的的潜潜在在危危急急性性，而而且且外外源源基基因因可可以以持持续续稳稳定定表表达达，并并可可受受到到四四周周基基因因的的调调控控，兼兼具具反反转转录录病病毒载体和腺病毒载体两者的优点。毒载体和腺病毒载体两者的优点。AAVAAV载体的缺陷载体的缺陷AAVAAV载体容量小，目前最多只能容纳载体容量小，目前最多只能容纳5 5 kbkb外源外源DNADNA片段；片段；感染效率比反转录病毒载体低感染效率比反转录病毒载体低,在在40%40%-80%80%的成人中存在过感染的成人中存在过感染;可能会引可能会引起免疫排斥。起免疫排斥。常用基因治疗载体常
28、用基因治疗载体整合整合致病性致病性感染细胞感染细胞克隆容量克隆容量反反转转录录病病毒毒 载载体体随随机机整整合合，效率高效率高可能致病可能致病分裂细胞分裂细胞7kb7kb腺腺病病毒毒载载体体不不整整合合，可可能丢失能丢失不致病不致病分分裂裂细细胞胞、非非分分裂裂细细胞胞腺腺相相关关病病毒载体毒载体定定 点点 整整 合合(19(19号号染染色色体体特特定定区区域域)不致病不致病分分裂裂细细胞胞、非非分分裂裂细细胞胞5kb5kb7.5kb7.5kb2.非病毒载体介导的基因转移系统非病毒载体介导的基因转移系统（1）脂质体介导的基因转移技术）脂质体介导的基因转移技术基本原理基本原理:利用阳离子脂质体单
29、体与利用阳离子脂质体单体与DNA混合混合后，可以自动形成包埋外源后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，的脂质体，与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源外源DNA转移至细胞内，并进行表达。转移至细胞内，并进行表达。脂质体介导的基因转移技术运用便利、成本脂质体介导的基因转移技术运用便利、成本低廉。低廉。脂质体介导的基因转移示意图脂质体介导的基因转移示意图（2 2）受体介导转移技术）受体介导转移技术 将将DNADNA通通过过多多聚聚阳阳离离子子与与细细胞胞配配体体偶偶联联，多多聚聚阳阳离离子子与与配配体体共共价价连连接接后后，又又通通过过电电荷荷相相互互作
30、作用用与与带带负负电电荷荷的的DNADNA结结合合，将将DNADNA包包围围，只只留留下下配配体体暴暴露露于于表表面面。这这样样形形成成的的复复合合物物可可被被带带有有特特异异性性受受体体的的靶靶细细胞胞吞吞饮饮，从从而而将将外源外源DNADNA导入靶细胞。导入靶细胞。受体介导转移技术示意图受体介导转移技术示意图（3）基因干脆注射技术）基因干脆注射技术将将促促进进心心脏脏血血管管生生长长的的基基因因干干脆脆注注入入试试验验鼠鼠的的心心脏脏，可可使使其其心心脏脏壁壁内内毛毛细血管增加细血管增加30%40%；将胰岛素基因干脆注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；将胰岛素基因干脆注入鼠骨骼肌
31、细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；肌内注射凝血因子肌内注射凝血因子基因，可产生血友病所需的凝血因子基因，可产生血友病所需的凝血因子。基因干脆注射法的优点基因干脆注射法的优点p制制备备具具有有调调控控部部件件的的质质粒粒DNADNA重重组组体体的的技技术术较较简简洁；洁；p解除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；解除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；p导导入入的的基基因因不不需需整整合合即即可可表表达达，避避开开了了反反转转录录病病毒毒载载体体导导入入整整合合后后，一一旦旦发发生生副副作作用用不不易易中中止止或或逆转的缺点；逆转的缺点；p基基因因干干脆脆注注射射法法可可反反复复运运用用，而
32、而病病毒毒载载体体则则可可能能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。三、基因干预三、基因干预 （geneinterference）（一）反义（一）反义RNARNA（antisense RNAantisense RNA）（二）干扰（二）干扰RNA RNAiRNA RNAi （三）核酶技术（三）核酶技术 四、基因治疗的应用探讨四、基因治疗的应用探讨 （一）遗传病的基因治疗探讨（一）遗传病的基因治疗探讨 (一一)遗传病基因治疗必需符合以下要求遗传病基因治疗必需符合以下要求1.1.在在DNADNA水平明确其发病缘由及机制；水平明确其发病缘由及机制；2.2.必必
33、需需是是单单基基因因遗遗传传病病，而而且且属属隐隐性性遗遗传；传；3.3.该基因的表达不须要精确调控；该基因的表达不须要精确调控；4.4.该该基基因因能能在在一一种种便便于于临临床床操操作作的的组组织织细胞中表达并发挥其生理作用；细胞中表达并发挥其生理作用；5.5.该该遗遗传传病病不不经经治治疗疗将将有有严严峻峻后后果果(如如不不治治疗疗难难以以存存活活等等)。可可供供选选择择并并符符合合上上述述4 4条条以以上上要要求求的的不不过过只只有有3030余余种种遗遗传传病。病。n腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶(ADA)ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)PNP)缺乏症缺乏症 n珠蛋白生成
34、障碍性贫血和血红蛋白病珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病 n血友病和其他血浆蛋白缺乏症血友病和其他血浆蛋白缺乏症 n苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病 n莱莱-纳纳(Lesch-Nyhan)Lesch-Nyhan)综合征综合征 n家族性高胆固醇血症家族性高胆固醇血症 n囊性纤维化病囊性纤维化病 腺苷酸脱氨酶（ADA）基因缺乏症（二）恶性肿瘤基因治疗探讨（二）恶性肿瘤基因治疗探讨 （1 1）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑制癌症的发生、发展和转移；基因以抑制癌症的发生、发展和转移；（2 2）抑制癌基因的活性，通过干
35、扰癌基因的转）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，发挥抑癌作用；录和翻译，发挥抑癌作用；（3 3）增加肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组）增加肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细胞因子修饰，刺激机体免疫系统产织进行细胞因子修饰，刺激机体免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应；生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应；（4 4）通过导入）通过导入“自杀基因自杀基因”杀伤癌细胞。杀伤癌细胞。(5)(5)提高化疗效果的协助基因治疗：药物增敏提高化疗效果的协助基因治疗：药物增敏 基因治疗；基因治疗；耐药基因治疗。耐药基因治疗。临临床床上上对对肿肿瘤瘤患患者者进进行行化化疗疗时时，通通常常面面临临两两大
36、难题：大难题：（1）患患者者机机体体内内的的肿肿瘤瘤细细胞胞对对化化疗疗药药物物的的敏敏感感程程度度存存在在差差异异，特特殊殊是是某某些些经经过过多多次次化化疗疗的的患患者者，其其体体内内的的肿肿瘤瘤细细胞胞已已经经产产生生了了多多药药耐耐药药性性，对对多多种种化化疗疗药药物物产生交叉耐受，最终导致化疗失败。产生交叉耐受，最终导致化疗失败。（2）大大剂剂量量的的化化疗疗可可能能导导致致患患者者的的正正常常细细胞胞，特特殊殊是是骨骨髓造血细胞的功能受到抑制。髓造血细胞的功能受到抑制。药物增敏基因治疗：药物增敏基因治疗：为为了了使使化化疗疗药药物物能能够够最最大大程程度度地地杀杀死死肿肿瘤瘤细细胞
37、胞，可可以以将将某某些些药药物物增增敏敏基基因因导导入入肿肿瘤瘤细细胞胞，特特殊殊是是对对化化疗疗药药物物原原本本不不敏敏感感的的肿肿瘤瘤细细胞胞，使使其其对对抗抗肿肿瘤瘤药药物物的的敏敏感感性性大大大增加，从而达到增加化疗效果的目的。大增加，从而达到增加化疗效果的目的。提高化疗效果的协助基因治疗提高化疗效果的协助基因治疗耐药基因治疗：耐药基因治疗：肿瘤细胞耐药性与多种糖蛋白或酶：肿瘤细胞耐药性与多种糖蛋白或酶：多多药药耐耐药药（mdr-1）基基因因编编码码的的P-糖糖蛋蛋白白、多多药药耐耐药药相相关蛋白（关蛋白（MRP）以及肺耐药相关蛋白等；）以及肺耐药相关蛋白等；细胞内氧化和解毒作用的酶系
38、统：细胞内氧化和解毒作用的酶系统：细细胞胞色色素素P-450（cytochromeP-450）、谷谷胱胱甘甘肽肽S-转转移酶（移酶（GST）以及谷胱甘肽过氧化物酶（）以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等。）等。向向肿肿瘤瘤患患者者的的骨骨髓髓细细胞胞导导入入某某种种耐耐药药基基因因，增增加加骨骨髓髓细细胞胞的的抗抗药药性性，以以便便耐耐受受大大剂剂量量的的化化疗疗药药物物，达达到到彻彻底底杀灭肿瘤细胞的目的。杀灭肿瘤细胞的目的。五、基因治疗的问题与展望五、基因治疗的问题与展望 缺乏高效、缺乏高效、靶向性的基因转移系统靶向性的基因转移系统 缺乏有效的治疗靶基因缺乏有效的治疗靶基因 真核生物表达调控机制未完全阐明真核生物表达调控机制未完全阐明 缺乏精确的疗效评价缺乏精确的疗效评价n感谢！