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1、关于基因治疗的原理第1页，讲稿共28张，创作于星期日一、基因治一、基因治疗的策略的策略 内容提要内容提要二、基因二、基因转移技移技术 三、基因干三、基因干预第2页，讲稿共28张，创作于星期日一、基因治疗一、基因治疗的策略的策略第3页，讲稿共28张，创作于星期日 （一）基因置（一）基因置换换（gene replacementgene replacement）定定定定义义：指将特定的目的基因指将特定的目的基因指将特定的目的基因指将特定的目的基因导导入特定入特定入特定入特定细细胞，通胞，通胞，通胞，通过过定位定位定位定位重重重重组组，以，以，以，以导导入的正常基因置入的正常基因置入的正常基因置入的正
2、常基因置换换基因基因基因基因组组内原有的缺陷基因。内原有的缺陷基因。内原有的缺陷基因。内原有的缺陷基因。目的目的：将缺陷基因的异常序列：将缺陷基因的异常序列进行行桥正。正。第4页，讲稿共28张，创作于星期日（二）（二）基因添加基因添加 基因添加或称基因增基因添加或称基因增补（gene augmentationgene augmentation）:通通过导入外源基因使靶入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。胞表达其本身不表达的基因。类型型:在在有有缺缺陷陷基基因因的的细胞胞中中导入入相相应的的正正常常基基因因，而而细胞胞内内的的缺缺陷陷基基因因并并未未除除去去，通通过导入入正正常常基基因因的
3、的表表达达产物，物，补偿缺陷基因的功能。缺陷基因的功能。向向靶靶细胞胞中中导入入靶靶细胞胞本本来来不不表表达达的的基基因因，利利用用其其表达表达产物达到治物达到治疗疾病的目的。疾病的目的。第5页，讲稿共28张，创作于星期日（三）基因干（三）基因干预预l基因干基因干预预（gene interferencegene interference）:采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过过破坏某个基因的破坏某个基因的结结构而使之不能表达，以达到治构而使之不能表达，以达到治疗疗疾疾病的目的。病的目的。第6页，讲稿共28张，创作于星期日（四）自（四）自杀杀基因治基
4、因治疗疗自自杀杀基基因因治治疗疗:恶恶性性肿肿瘤瘤基基因因治治疗疗的的主主要要方方法法之一。之一。原原理理:将将“自自杀杀”基基因因导导入入宿宿主主细细胞胞中中，这这种种基基因因编编码码的的酶酶能能使使无无毒毒性性的的药药物物前前体体转转化化为为细细胞胞毒毒性性代代谢谢物物，诱诱导导靶靶细细胞胞产产生生“自自杀杀”效效应应，从从而而达达到到清清除除肿肿瘤瘤细细胞胞的的目的。目的。第7页，讲稿共28张，创作于星期日（五）基因免疫治（五）基因免疫治疗 通通过将抗癌免疫增将抗癌免疫增强细胞因子或胞因子或MHCMHC基因基因导入入肿瘤瘤组织，以增，以增强肿瘤微瘤微环境中的抗癌免境中的抗癌免疫反疫反应。
5、第8页，讲稿共28张，创作于星期日二、基因转移二、基因转移技术技术第9页，讲稿共28张，创作于星期日 基因基因转转移移(gene transfer)(gene transfer)技技术术 1.1.病毒介病毒介导的基因的基因转移系移系统。2.2.非病毒介非病毒介导的基因的基因转移系移系统。第10页，讲稿共28张，创作于星期日 1.1.病毒介病毒介导导的基因的基因转转移系移系统统 病毒病毒载体体介介导的基因的基因转移效率移效率较高，因高，因此它也是使用最多的基因治此它也是使用最多的基因治疗载体。据体。据统计，有有72%72%的的临床床实验计划和划和71%71%的病例使用了病的病例使用了病毒毒载体，
6、其中用得最多的是逆体，其中用得最多的是逆转录病毒病毒载体。体。第11页，讲稿共28张，创作于星期日 (1)(1)逆逆转录病毒病毒载体体第12页，讲稿共28张，创作于星期日 逆逆转录转录病毒病毒载载体的特点体的特点 逆逆转录病毒包膜上由病毒包膜上由envenv编码的糖蛋白，能的糖蛋白，能够被被许多哺多哺乳乳动物物细胞膜上的特异性受体胞膜上的特异性受体识别，从而使逆，从而使逆转录病毒病毒携携带的的遗传物物质高效地高效地进入靶入靶细胞。胞。逆逆转录病毒病毒结构基因构基因gaggag、envenv和和polpol的缺失不影响其他的缺失不影响其他部分的活性。部分的活性。前病毒可以高效整合至靶前病毒可以高
7、效整合至靶细胞基因胞基因组中，有利于外源基中，有利于外源基因在靶因在靶细胞中的永久表达。胞中的永久表达。包装好的假病毒包装好的假病毒颗粒（携粒（携带目的基因的重目的基因的重组逆逆转录病病毒毒载体）以芽生的方式分泌至体）以芽生的方式分泌至辅助助细胞培养的上清液胞培养的上清液中，易于分离制中，易于分离制备。第13页，讲稿共28张，创作于星期日 逆逆转录转录病毒病毒载载体的主要缺点体的主要缺点 随机整合，有插入突随机整合，有插入突变、激活癌基因的、激活癌基因的潜在危潜在危险；逆逆转录病毒病毒载体的容量体的容量较小，只能容小，只能容纳7 7 kbkb以下的外源基因。以下的外源基因。第14页，讲稿共28
8、张，创作于星期日 （2 2）腺病毒）腺病毒(adenovirus(adenovirus，AV)AV)载载体体 腺病毒是一种大分子腺病毒是一种大分子(36 kb)(36 kb)双双链链无包膜无包膜DNADNA病毒。病毒。它通它通过过受体介受体介导导的内吞作用的内吞作用进进入入细细胞内，然后腺病毒基胞内，然后腺病毒基因因组转组转移至移至细细胞核内，保持在染色体外，不整合胞核内，保持在染色体外，不整合进进入宿入宿主主细细胞基因胞基因组组中。中。腺病毒是人腺病毒是人类类呼吸道感染的病原体，但目前尚未呼吸道感染的病原体，但目前尚未发发现现与与肿肿瘤瘤发发生有关生有关联联。宿主。宿主细细胞范胞范围围广，可
9、感染分裂和广，可感染分裂和非分裂非分裂终终末分化末分化细细胞，如神胞，如神经经元等。元等。第15页，讲稿共28张，创作于星期日腺病毒腺病毒载体体的的优优点点1.1.1.1.基因基因导入效率高，入效率高，对人人类安全；安全；2.2.2.2.宿主范宿主范宿主范宿主范围围广；广；广；广；3.3.3.3.基因基因基因基因转导转导与与与与细细胞分裂无关；胞分裂无关；胞分裂无关；胞分裂无关；4.4.4.4.重重组腺病毒可通腺病毒可通过口服口服经肠道吸收、或道吸收、或喷雾吸入吸入或气管内滴注；或气管内滴注；5.5.5.5.腺病毒腺病毒腺病毒腺病毒载载体容量体容量体容量体容量较较大，可插入大，可插入大，可插入
10、大，可插入7.5 kb7.5 kb7.5 kb7.5 kb外源基因；外源基因；外源基因；外源基因；第16页，讲稿共28张，创作于星期日 腺病毒腺病毒载载体体的的缺点缺点2.2.2.2.宿主的免疫反宿主的免疫反宿主的免疫反宿主的免疫反应导应导致腺病毒致腺病毒致腺病毒致腺病毒载载体表达短体表达短体表达短体表达短暂暂。3.3.有两个有两个有两个有两个环节环节可能可能可能可能产产生复制型腺病毒。生复制型腺病毒。生复制型腺病毒。生复制型腺病毒。4.4.4.4.靶向性差。靶向性差。靶向性差。靶向性差。1.1.1.1.不能整合到靶不能整合到靶不能整合到靶不能整合到靶细细胞的基因胞的基因胞的基因胞的基因组组D
11、NADNADNADNA中。分裂增殖快的中。分裂增殖快的中。分裂增殖快的中。分裂增殖快的细细胞，胞，胞，胞，导导入的重入的重入的重入的重组组病毒病毒病毒病毒载载体，随分裂而体，随分裂而体，随分裂而体，随分裂而丢丢失的机会增失的机会增失的机会增失的机会增多，表达多，表达多，表达多，表达时间时间相相相相对较对较短。短。短。短。第17页，讲稿共28张，创作于星期日 2.2.非病毒非病毒载载体介体介导导的基因的基因转转移系移系统统 （1 1）脂）脂质质体介体介导导的基因的基因转转移技移技术术 脂脂质质体介体介导导的基因的基因转转移技移技术术使用方便、使用方便、成本低廉。成本低廉。基本原理基本原理:利用阳
12、离子脂利用阳离子脂质质体体单单体与体与DNADNA混合后，可以自混合后，可以自动动形成包埋外源形成包埋外源DNADNA的脂的脂质质体，体，然后与然后与细细胞一起孵育，即可通胞一起孵育，即可通过细过细胞内吞作胞内吞作用将外源用将外源DNADNA（即目的基因）（即目的基因）转转移至移至细细胞内，胞内，并并进进行表达。行表达。第18页，讲稿共28张，创作于星期日（2 2）受体介）受体介导转导转移技移技术术 将将DNADNA与与细胞胞或或组织亲和和性性的的配配体体偶偶联，可可使使DNADNA具具有有靶靶向向性性。这种种偶偶联通通常常通通过多多聚聚阳阳离离子子（如如多多聚聚赖氨氨酸酸）来来实现。多多聚聚
13、阳阳离离子子与与配配体体共共价价连接接后后，又又通通过电荷荷相相互互作作用用与与带负电荷荷的的DNADNA结合合，将将DNADNA包包围，只只留留下下配配体体暴暴露露于于表表面面。这样形形成成的的复复合合物物可可被被带有有特特异异性性受受体体的的靶靶细胞胞吞吞饮，从从而而将将外外源源DNADNA导入入靶靶细胞。胞。第19页，讲稿共28张，创作于星期日 （3 3）基因直接注射技）基因直接注射技术术 不需要不需要进进行基因工程的繁行基因工程的繁琐琐操作，直接将操作，直接将裸露基因裸露基因DNADNA注入注入动动物肌肉或某些器官物肌肉或某些器官组织组织内。内。第20页，讲稿共28张，创作于星期日三、
14、基因干预三、基因干预第21页，讲稿共28张，创作于星期日基因干预的种类：n n1.1.反反义义RNA(antisense RNA)RNA(antisense RNA)n n2.2.干干扰扰RNA(RNA interference)RNA(RNA interference)第22页，讲稿共28张，创作于星期日 （一）反（一）反义义RNARNA 1.1.反反义义RNARNA与基因表达与基因表达调调控控 利用反利用反义义RNARNA对对体外培养的体外培养的细细胞胞进进行基因表达行基因表达调调控，控，通常采用的方法有两种：通常采用的方法有两种：（1 1）体外合成反）体外合成反义义RNARNA，直接作用
15、于培养，直接作用于培养细细胞，胞，细细胞吸收胞吸收RNARNA后，后，发挥发挥作用。作用。（2 2）构建能）构建能转录转录反反义义RNARNA的重的重组质组质粒，将粒，将质质粒粒转转入入细细胞，胞，转录转录出反出反义义RNARNA而而发挥发挥作用。作用。第23页，讲稿共28张，创作于星期日2.2.受体介受体介导导反反义义RNARNA技技转转移移术术 基基本本原原理理：将将脱脱唾唾液液酸酸血血清清类粘粘蛋蛋白白（ASGPASGP）与与多多聚聚赖氨氨酸酸（PLPL）共共价价连接接，得得到到ASGP-PLASGP-PL复复合合物物，成成为运运载核核酸酸的的工工具具。ASGP-PLASGP-PL反反义
16、RNARNA复复合合物物可可以以专一一性性地地被被肝肝细胞胞表表面面的的ASGPASGP受受体体所所识别，并并吞吞噬噬到到肝肝细胞胞中中，反反义RNARNA进入肝入肝细胞后，可被逐胞后，可被逐渐释放出来放出来发挥作用。作用。借借助助受受体体介介导DNADNA转移移方方法法把把DNADNA换成成反反义RNARNA，就可以就可以实现受体介受体介导的反的反义RNARNA的的转移。移。第24页，讲稿共28张，创作于星期日（二）干（二）干扰扰RNARNA 1.RNA1.RNA干干扰现象象 RNA干扰（干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双链）是一种由双链RNA诱发的基因沉默诱发的基
17、因沉默现象。在此过程中，与双链现象。在此过程中，与双链RNA有同源序有同源序列的信使列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑）被降解，从而抑制该基因的表达。制该基因的表达。第25页，讲稿共28张，创作于星期日 2.RNA2.RNA干干扰扰的机制的机制 RNARNARNARNA干干干干扰过扰过程主要有程主要有程主要有程主要有2 2 2 2个步个步骤：（1 1 1 1）小干）小干扰性性RNARNARNARNA（siRNAsiRNAsiRNAsiRNA）（2 2）siRNAsiRNAsiRNAsiRNA与与与与细细胞内的某些胞内的某些胞内的某些胞内的某些酶酶和蛋白和蛋白和蛋白和蛋白质质形成复合体，称
18、形成复合体，称形成复合体，称形成复合体，称为为RNARNARNARNA诱导诱导的沉默复合体（的沉默复合体（的沉默复合体（的沉默复合体（RNA-induced silencing RNA-induced silencing RNA-induced silencing RNA-induced silencing complex,RISC)complex,RISC)complex,RISC)complex,RISC)。该该复合体可复合体可复合体可复合体可识别识别与与与与siRNAsiRNAsiRNAsiRNA有同源序列的有同源序列的有同源序列的有同源序列的mRNAmRNAmRNAmRNA，并在特异的
19、位点将，并在特异的位点将，并在特异的位点将，并在特异的位点将该该mRNAmRNAmRNAmRNA切断。切断。切断。切断。长长双双双双链链RNARNARNARNA被被被被细细胞内的双胞内的双胞内的双胞内的双链链RNARNARNARNA特异性核酸特异性核酸特异性核酸特异性核酸酶酶DicerDicerDicerDicer切成切成切成切成21-2321-2321-2321-23个碱个碱个碱个碱基基基基对对的短双的短双的短双的短双链链RNARNARNARNA，称，称，称，称为为小干小干小干小干扰扰性性性性RNARNARNARNA（small interfering RNAsmall interferin
20、g RNAsmall interfering RNAsmall interfering RNA，siRNAsiRNAsiRNAsiRNA）。）。）。）。第26页，讲稿共28张，创作于星期日 3.RNA3.RNA干干扰扰的的应应用前景用前景 RNA RNA干干扰扰研究目前已研究目前已经经在功能基因在功能基因组组学研学研究、微生物学研究、基因治究、微生物学研究、基因治疗疗和信号和信号转导转导等等广泛广泛领领域取得了令人瞩目的域取得了令人瞩目的进进展，使其在医展，使其在医学、生物学学、生物学领领域的域的应应用有着广用有着广阔阔的前景。的前景。第27页，讲稿共28张，创作于星期日感感谢谢大大家家观观看看第28页，讲稿共28张，创作于星期日