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1、窗体顶部部中华人民民共和国国国家标标准GBB 1556700-19995农药登记记毒理学学试验方方法Tooxiccoloogiccal tesst mmethhodss off Peestiiciddes forr reegisstraatioon1 主题题内容与与适用范范围本标标准规定定了农药药登记毒毒理学试试验的方方法、条条件的基基本要求求。本标标准适用用于为农农药登记记而进行行的毒理理学试验验。2 急性经经口毒性性试验221 目的的求出试试验农药药对试验验动物的的半数致致死剂量量（LDD50）；通过观观察急性性毒性效效应的临临床表现现，初步步估测毒毒作用的的靶器官官和可能能的毒作作用机理
2、理；为亚亚慢性、慢慢性和其其他毒性性试验的的剂量水水平设计计提供参参考；为为急性毒毒性分级级和制定定安全防防护措施施提供依依据。222 试验验农药原原药和制制剂。223 试验验动物2231 主要要选用品品系、遗遗传背景景明确的的初年大大鼠。各各剂量组组内同性性别动物物体重差差异应小小于平均均体重的的10%，组间间同性别别动物体体重均值值差异应应小于55%。232 每一一剂量组组的大鼠鼠8110只（雌雌雄各半半），试试验前要要对动物物观察一一周，确确认健康康后，方方可使用用。24 剂量量分组2241 至少少应设445个个剂量组组，各剂剂量组之之间要有有适当的的剂量间间距。以以便各组组出现不不同程
3、度度的毒性性效应（死死亡率），求求得剂量量效应曲曲线及LLD500。242 如剂剂量达550000mg/kg体体重以上上，动物物仍不出出现死亡亡，则不不需要进进行更高高剂量的的试验。25 给药方法及观察时间251 动物给药前应隔夜禁食但不禁水，称重后，一次灌胃给药，给药后至少间隔2h进食。252 灌胃量大鼠按100g体重给1mL，小鼠按20g体重给0.4mL计算，灌胃可用水溶液、油溶液或悬液。253 给药后立即观察并记录动物的中毒表现，症状出现和消失的时间及死亡时间。给药当日应连续观察，其后，每日至少观察2次，观察期为14d。如在给药96h后出现迟发性新效应，则应延长观察期至3周或4周。26
4、观察指标261 中毒症状全面观察中毒的发生、发展过程和规律以及中毒特点和毒作用的靶器官。观察的系统包括：a中枢神经系统和神经肌肉系统：体位异常、叫声异常、不安、呆滞、痉挛、抽搐麻痹、运动失调、对外反应过敏或迟钝；b植物神经系统：瞳孔扩大或缩小、流涎或流泪；c呼吸系统：鼻孔流液、鼻翼煽动、呼吸深缓、呼吸过速、蜂腰；d泌尿生殖系统：会阴部污秽、有分泌物、阴道或乳房肿胀；e皮肤和毛：皮肤充血、紫绀、被毛蓬松、污秽；f眼：眼球突出、结膜充血、角膜混浊；g消化系统：腹泄、厌食。262 体重给药前、死亡时各称量一次体重，观察期间每3d称量一次。263 一般不做病理组织学检查和生化指标检验，但对死亡动物应做
5、大体病理学观察。如24h以上的存活动物，肉眼检查有病变时应做病理组织学检查。27 结果评定271 用统计方法计算LD50值。计算方法见附录A（补充件）。272 按农药的急性经口毒性分级标准进行评定（见表1）。表1急性经口毒性分级标准级别经口LDD50,mmg/kkg剧毒高毒毒中毒低毒毒50003 急性性经皮毒毒性试验验3.11 目的的了解农药药对试验验动物皮皮肤直接接接触引引起局部部皮肤损损伤、全全身中毒毒的特征征等毒性性效应，求求出半数数致死剂剂量（LLD500），为为制定农农药生产产和应用用中的防防护措施施提供依依据。32 试验农农药原药药和制剂剂。33 试验验动物3331 为有有足够的的
6、涂药面面积，首首选成年年大鼠，体体重要求求2000-3000g。332 各剂剂量组大大鼠810只只（雌雄雄各半）。34 剂量分组341 至少应设4个剂量组，各剂量组应有一定的间距，使给药组能出现毒性表现和死亡。342 如果2000mg/kg剂量仍不出现死亡时，则不需要再进行高剂量试验。35 给药方法及观察时间351 给药前24h背部去毛，注意勿损伤皮肤，涂药面积应占体表面积10%，大鼠45cm2，兔1214cm2，豚鼠710cm2。352 液体农药用原药液，粉末农药用水或溶剂稀释。353 先将动物固定，在略小于剃毛面积内进行定量敷药，然后覆盖一个与脱毛面积相当的盒式罩，再用胶布固定。以防止动物
7、舔食试验药品。354 涂药持续时间为4h。355 涂药4h后取下罩盒，用温水洗去皮肤上的试验农药，再进行局部观察。356 观察时间为2周。36 观察指标361 中毒的临床表现，参照2.6.1。362 死亡时间及死亡率。37 结果评定371 用统计方法计算LD50值。计算方法见附录A（补充件）。372 按农药的急性经皮毒性分级标准进行评定（见表2）。表1急性经皮毒性分级标准级别经皮LDD50(4 hh),mmg/kkg剧毒高毒毒中毒低毒毒2200004 急性性吸入毒毒性试验验41 目的的测试可可能经呼呼吸道进进入机体体的农药药（尤其其是挥发发性强的的农药）对对呼吸道道及全身身的损伤伤及其危危害程
8、度度。求出出吸入接接触的半半数致死死浓度（LC50），为农药的安全评价和制定生产应用中的防护措施提供依据。42 试验农药原药和制剂。43 试验动物431 一种以上的哺乳动物，大鼠为首选动物。432 动物性别、体重和每组动物数量的要求同2.3。44 剂量分组441 至少应设3个出现毒性效应直至死亡的剂量组。442 如果以浓度2000mg/m3给药2h仍无死亡，则无需再做高浓度试验。45 给药方法及观察时间451 给药方式包括鼻、头部接触和全身置于染毒柜内接触两种方式。452 染毒柜内应保持恒定的空气流量、农药浓度、温度及湿度，并要求柜内保持微负以免农药外漏。453 吸入给药一般为2h。454 给
9、药后至少观察14d。46 观察指标461 中毒的临床表现，参照2.6.1。462 死亡时间及死亡率。47 结果评定471 用统计方法计算LC50值。计算方法见附录A（补充件）。472 按农药的急性吸入毒性分级标准进行评定（见表3）。表3急性吸入毒性分级标准级别LC500(2 h),mg/m33剧毒高毒毒中毒低毒毒2200005急性性皮肤刺刺激试验验51 目的的测定农农药对哺哺乳动物物皮肤是是否有刺刺激或腐腐蚀作用用，估计计人体接接触该农农药时可可能出现现的类似似危害。52 试验农药原药和制剂。53 试验动物531 兔或豚鼠，首选动物为白色家兔。532 至少4只皮肤完好的健康动物。54 剂量54
10、1 一次涂药量为0.5mL或0.5g。542 动物自身皮肤做为对照。55 试验步骤551 试验前24h将背部毛剪掉，面积约6cm2。552 涂上试验农药，再用纱布盖上，以胶布固定或采用其他封闭性盖罩，避免试验动物舔食。553 涂敷持续时间一般为4h。时间结束时，用水或适当的溶剂洗去残留的农药，但注意不要操作皮肤。554 根据需要做进一步的观察，以确定反应的可逆性。一般观察期不超过14d。56 结果评定每一只动物试验结果按表4进行刺激反应评分，计算出平均分值，按表5进行强度评定。表4皮肤刺激反应评分症壮及程程序积分A 红斑斑形成无无红斑勉勉强可见见明显红红斑中等等至严重重红斑紫紫红色斑斑并有焦焦
11、痂形成成B 水肿肿形成无无水肿勉勉强可见见水肿隆隆起轮廓廓清楚水水肿隆起起轮廓清清楚水肿肿隆起约约1mmm水肿隆隆起超过过1mmm，范围围扩大01233401234总分A+B表5 皮皮肤刺激激强度分分级强度分值无刺激性性轻度刺刺激性中中等刺激激性强刺刺激性0-0.40.5-11.922.0-5.996.00-8.0注：pHH2或ppH11.5的农农药可不不进行本本试验66 眼刺刺激试验验61 目的的了解试试验农药药对眼睛睛的刺激激作用和和程度，为为农药生生产和使使用中的的安全防防护提供供依据。62 试验农药原药和制剂，但对具有强酸、强碱性质的化合物（pH2,pH11.5）不需做此试验。63 试
12、验动物成年的白色家兔至少4只。试验前24h检查试验家兔双眼，有异常者不得使用。64 剂量液体农药或100倍稀释液0.1mL,粒状农药不超过100mg，且应先将颗粒磨成细粉。65 给药方法及观察时间651 将一侧下眼睑轻轻下拉，把试验农药滴入结膜囊内，为防止药液外溢，立即轻轻闭合眼睑约1min。如果用喷雾给药法，将眼睑分开，在眼前方10cm距离处迅速喷雾1s。652 给药后24h内不洗眼。653 对侧眼为对照。654 给药后于1，24，48，72h分别检查眼睛。如72h仍无刺激反应时，则终止试验。655 如果出现角膜操作或眼睛其他部位出现反应，要继续观察损伤的经过及其可逆性，观察期最长不超过21
13、d。656 72h刺激反应仍不消退时，至少另选4只家兔观察洗眼效果。即滴入药物后分别在4s和30s时用生理盐水洗眼5min，观察洗眼后的眼睛反应情况。66 观察指标除了观察结膜、角膜、虹膜外，还应注意其他部位的损害。67 结果评定按表6将每只动物的角膜、虹膜和结膜的刺激反应的分值相加，即是一只动物眼刺激反应的总积分。每个动物的刺激反应积分的总和除以动物数，就是该试验农药对眼刺激性的最后分值。再按表7评定眼刺激程度。表 6眼损伤程度评分部位及程程度积分角膜A 混浊（以以最致密密部位为为准）无无混浊散散在或弥弥漫性混混浊，虹虹膜清晰晰可见01续表 66部位及程程度积分半透明区区易分辩辩，虹膜膜模糊
14、不不清出现现灰白半半透明区区，虹膜膜细节不不清，瞳瞳孔大小小勉强看看 清角角膜不透透明，由由于混浊浊，虹膜膜无法辨辨认B 角膜受受损范围围1/41/4-11/211/2-3/443/44-123411234最高积分分80(积积分AXXBX55)虹膜正常常邹折明明显加深深，充血血，肿胀胀，角膜膜周围有有轻度充充血，瞳瞳孔对光光仍有反反应出血血，肉眼眼可见破破坏，对对光无反反应（或或出现其其中之一一反应）012最高积分分10（积积分x55)结膜A 充血状状态（系系指睑结结膜、球球结膜部部位的血血管）血血管正常常充血血血管充血血呈鲜红红色血管管充血呈呈深红色色，血管管不易分分辨弥漫漫性充血血呈紫红红
15、色B 水肿无轻微水水肿（包包括瞬膜膜）明显显水肿，伴伴有部分分眼睑外外翻水肿肿至眼睑睑近半闭闭合C 分泌物物无少量分泌泌物使眼眼睑和睫睫毛潮湿湿或粘着着分泌物物使整个个眼区潮潮湿或粘粘着01233012340123最高积分分20AA+B+C)XX2角膜、虹虹膜、结结膜反应应累加最最高积分分110(80+10+20)表7 眼眼刺激性性分级刺激强度度眼刺激积积分指数数(I.A.OO.I)眼刺激的的平均指指数(MM.I.O.II)无刺激性性轻度刺刺激性轻轻度至中中度刺激激性中度度刺激性性中度至至重度刺刺激性重重度刺激激性0-555-15515-30330-660600-80080-110048h00
16、48hh54dd57dd2077d4007 皮肤肤变态反反应（致致敏）试试验71 目的的测试动动物在反反复接触触农药后后，机体体产生免免疫传递递的皮肤肤反应的的可能性性，从而而确定农农药的变变态反应应性（致致敏）。72 试验农药制剂。73 试验动物豚鼠、每组动物数1020只。74 剂量致敏（诱导）浓度允许引起皮肤轻度刺激反应（即最高耐受浓度）。激发浓度一般低于致敏浓度，不得引起原发刺激性炎症反应。75 试验步骤751 接触致敏的发病过程包括致敏和激发两个阶段。a致敏接触实验前224h将将动物背背部左侧侧去毛33cm3cmm。将试试验农药药0.110.2mll涂在22cm2cmm滤纸上上，并将将
17、其敷贴贴在去毛毛区，用用两层纱纱布，一一层油纸纸或不透透水塑料料膜覆盖盖，再以以无刺激激胶布封封闭固定定，持续续6h。第第7d和和第144d以同同样方法法重复一一次。bb激发发接触实实验前224h将将动物背背部右侧侧去毛22cm2cmm。末次次致敏后后1428dd，将00.10.22mL或或低于诱诱导浓度度的试验验农药斑斑贴于右右侧去毛毛区，覆覆盖方法法同7.5.11a.持持续6hh，去掉掉斑贴及及试验农农药后，每每日观察察至第112d。如如无致变变，可再再次激发发以确定定试验农农药能否否引起过过敏反应应。752试验验须设阳阳性或阴阴性对照照组，阴阴性对照照组仅给给予激发发接触。76结果评定将
18、出现皮肤红斑或水肿（不论程度轻重）的动物数除以动物总数，求出动物致敏率，再按表8进行致敏率强度评定。表8致敏率强度分级致敏率分级强度分类类0-899-288弱致敏物物轻度致致敏物续表 88致敏率分级强度分类类29-664655-80081-1000中度致敏敏物强度度致敏物物极强度度致敏物物8 亚急急性经口口毒性试试验81目的的通过经经口途径径在14周的的时期内内，连续续多次给给予不同同剂量的的试验农农药，观观察因试试验农药药的蓄积积作用所所产生的的不良反反应，确确定亚急急性无作作用剂量量和靶器器官，并并为亚慢慢性或慢慢性毒性性试验的的剂量设设定提供供依据。82试验农药原药。83 试验动物831
19、 首选大鼠。作为长期试验的预试验时，两种试验应使用同一种属和品系的动物。832选用大鼠的年龄一般为68周，体重变异应不大于平均体重的10%。833每剂量组至少10只动物，雌雄各半。若试验过程中需要提前剖杀一些动物检查，或需要一个观察毒性反应可逆性的附加组时，则在试验开始时要作相应的增加。84剂量分组一般设三个剂量组和一个对照组。根据类似化合物的资料，预计经口给药剂量超过1000mg/kg不会产生毒性时，可设二个剂量组。841高剂量组应使动物产生较明显的毒性效应。842 中剂量组应产生轻微的可观察到的毒性反应。843低剂量组不应出现任何毒性效应，但须超过人的可能接触剂量。844 对照组除了不接触
20、试验农药外，其他处理均应与试验组完全相同。85给药方法将试验农药渗入饲料或溶于饮水中，以固定浓度喂养或按动物体重以固定剂量通过胃管灌胃。作为长期毒性试验的预备试验时，两种试验应采用相同的给药方式。喂养给药应连续进行。管饲法每天在同一时间给药，并按一定的间隔时间（每周），根据体重调整给药量。86给药时间连续给药728d或5d/周。为了观察毒性反应的可逆性，附加组动物在停止给药后再饲养14d，再进行毒性效应的测试。87临床观察和检查871观察给药期间和给药后试验动物的毒性效应、出现时间、持续时间和程度。如发现濒死动物应及时解剖。每周至少测量一次进食量（或饮水量）和体重。872血液学检查检测项目包括
21、血红蛋白含量、红细胞数、白细胞数及其分类等873血液生化检查检测项目一般应包括肝、肾功能，如血清天冬氨酸氨基转换酶、丙氨酸氨基转换酶、尿素氮、肌酐等。必要时还须检测总蛋白、白蛋白、血糖、总胆固醇、总胆红素、高铁血红蛋白、胆碱酯酶、钾、钠、钙、磷等。88病理学检查881系统解剖所有试验动物包括试验过程中死亡的动物都应进行完整的系统解剖和仔细的肉眼观察。肉眼可见的损伤或可疑损伤部位都应采样固定，作进一步组织学检查。882脏器重量称取脾、肝、肾、肾上腺、睾丸等脏器重量并计算其脏器系数（脏器重/体重100%）。883 组织学检查对照组和高剂量组动物以及系统解剖时发现的异常组织均需作详细的组织学检查。其
22、他剂量组一般仅在高剂量组有异常发现时进行。附加组动物应对试验组已确证有毒性效应的组织和器官重点检查。检查脏器一般包括脑、肝、脾、肾、肾上腺、睾丸、卵巢和其他肉眼观察发现有损害或大小出现变化的器官。一般以肝、肾及可颖靶器官为主。此外，还应包括与农药直接接触的组织或器官，如胃等。9 亚急性经皮毒性试验91 目的按经皮方式反复给药21d，观察由此产生的不良反应，求出无作用剂量。92 试验农药原药。93 试验动物按8.3进行。94 剂量分组941 一般设三个剂量组和一个对照组。必要时还应设溶剂对照组。942 最高剂量组应出现明显的中毒效应，但死亡动物数不能妨碍有效的评定。943 如果用1000mg/k
23、g体重以上的剂量给药而未出现任何毒性效应，则不必再设其他更高剂量组。95 给药方法951 剃去动物背部体毛，在无损部分均匀地涂敷试验农药，并用无刺激性的塑料膜和纱布覆盖，胶布固定，使农药与皮肤保护良好的接触，并防止被动物舔食。952 涂药面积一般不少于动物体表面积的10%（大鼠约为2040cm2）。高毒农药涂药面积可略减，涂布时要尽量薄而均匀。953 如动物敷用农药后，产生严重的皮肤刺激和损伤，要降低试验农药的浓度，重新进行试验。96 给药时间每天一次，每次46h，或5d/周，共给药21d。为了观察毒性效应的可逆性，附加组动物在停止给药后再饲养14d，再进行毒效反应的测试。97 临床观察和检查
24、按8.7进行。98 病理学检查除按8.8进行外，尚需增加与农药直接接触的皮肤检查。10 亚急性吸入毒性试验101 目的在规定的3-4周时期内，按吸入方式反复给药，观察由于连续经呼吸道给药所产生的不良反应，求出无作用剂量。102 试验农药原药。103试验动物按8.3进行。104 剂量分组按8.4进行。105 给药方法1051 应维持被检农药在染毒柜中分布均匀，氧含量不低于19%。1052 浓度监测染毒柜内被检农药浓度应定期或连续监测，并尽可能地维持恒定。106 染毒时间每天一次，每次4h，或5d/周。连续染毒21-28d。停止染毒后，附加组动物再饲养14d，观察毒性反应的可逆性。107 临床观察
25、和检查按8.7进行。108 病理学检查除按8.8进行外，尚需增加与农药直接接触的呼吸系统，如肺等的检查。11 亚慢性经口毒性试验111 目的明确试验农药的亚慢性经口毒性效应的表现，取得试验农药亚慢性经口的最大无作用剂量参数，为试验农药慢性毒性试验提供剂量参考数据。112 试验农药原药。113 试验动物1131 首选大鼠，4-6周龄，雌雄各半，组间同性别动物体重均值差异应小于平均体重的10%。1132 动物数量各组雌雄大鼠均不少于10只。试验中间剖杀时，应相应增加。114 试验期3-6个月。115 剂量分组一般设三个剂量组和一个对照组。1151 高剂量组应使动物产生较明显的毒性效应，但动物死亡不
26、应超过10%。1152 中剂量组应使动物产生轻微的毒性效应。若设多个中剂量组时，应产生不同程度的毒性效应。1153 低剂量组不应引起任何毒性效应，属无作用剂量。1154 对照组除不接触试验农药外，其他应与试验组相同，当试验农药为制剂，对其助剂、添加剂等的生物活性不清楚时，还应设相应的助剂对照组。116 给药途径1161 给药方式混入饲料或溶于饮水。连续给予动物，每周7d。若因试验农药引起饲料和饮水的适口性不良，影响动物正常摄入量时，可用管饲法。1162 除营养素外，混入饮料的试验农药一般不应超过5%。饲料或饮水中的试验农药浓度应定期监测，观察其均匀性和稳定性。117 临床观察和检查1171 临
27、床观察外观体征、行为活动及粪便形状等每天逐个观察。详细记录毒性效应出现时间和变化，如发现死亡或濒死动物应及时解剖。体重和食物消耗量每周测量一次。1172 血液学检查检查指标包括红细胞计数、白细胞计数及其分类、血红蛋白含量等。检测时间为试验开始时和3个月后结束时进行，每次检查各剂量组雌雄大鼠至少各6只，非啮齿类动物则全部检查。1173 尿液检查检查项目包括外观、pH值、蛋白、糖、隐血（半定量）和沉淀物镜检（半定量）。检测时间和数量同血液检查，并尽可能同一动物检查。1174 血液生化检查检测项目包括血清天冬氨酸氨基转换酶、丙氨酸基转换酶、碱性磷酸酶、尿素氮、肌酐、总蛋白、白蛋白、血糖、总胆固醇、总
28、胆红素、胆碱酯酶等。118 病理学检查1181 系统解剖所有试验动物包括试验过程中死亡动物都应进行完整系统解剖和详尽的肉眼观察。所有肉眼可见的病变或可疑病变组织都应留样固定，作进一步病理组织学检查。1182 脏器重量称取脑、心、肺、肝、脾、肾、肾上腺、睾丸等脏器重量并计算其脏器系数（脏器重/体重100%）。1183 病理组织学检查对照组和高剂量组动物及系统解剖时发现的异常组织均需作详尽的组织学检查。其他剂量组一般仅在高剂量组有异常发现时才进行组织学检查。检查脏器一般包括脑、脊髓、心、肺、肝、脾、肾、胰、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠、膀胱、肾上腺、垂体、甲状腺（包括甲状旁腺）、胸腺、睾丸
29、、附睾、前列腺、卵巢、子宫、乳腺、皮肤、肌肉、骨、淋巴结、眼球等。吸入染毒时，尚应包括呼吸道。119 结果评定在仔细总结研究各项检测结果，并注意对照组与剂量组之间的统计学差异和各剂量间的剂量反应关系的基础上，评定以下内容。1191 试验农药的动物经口毒性效应的主要表现。1192 试验农药的亚慢性经口动物最大无作用剂量。1193 可供参考的试验农药动物经口慢性毒性试验的适宜剂量范围。12 蓄积毒性试验121 目的了解试验农药蓄积毒性的强弱，并为慢性毒性试验及其他有毒性试验的剂量选择提供参考。122 试验农药一般用原药，当大鼠经口LD50大于5000mg/kg，或已作过代谢试验有半衰期（t1/2）
30、数据的，可免去此项试验。123 试验动物刚成年的哺乳动物，选用大鼠或小鼠，雌雄各半。无经口LD50数据者，需预测其经口LD50。124 给药方式采用经口方式。为了准确掌握给药剂量，须采用灌胃法。125 剂量固定的20d蓄积法1251 剂量分组将试验动物机分成四个剂量组，低剂量为1/20LD50，顺次为1/10LD50、1/5LD50和1/2LD50四个剂量组。另设一个阴性（不给药）对照组，每组动物为10只，雌雄各半。1252 给药时间剂量组动物每日一次定时给药，连续给药20d。对照级除不给试验农药外，其他条件均与剂量组相同。1253 观察指标各剂量组雌雄合计的动物死亡数量。1254 结果评定各
31、剂量组均无死亡，好为蓄积性不明显；如仅高剂量（1/2LD50）组有死亡，其他组均无死亡，则为弱蓄积性；如低剂量组无死亡，其他各组间死亡数有剂量反应关系时，则为中等蓄积性；如低剂量组有死亡，且有剂量反应关系，则为强蓄积性。126 剂量递增蓄积系数法1261 剂量分组将试验动物随机分成雌雄两组，每组20只。1262 给药时间及剂量以4d为一期，连续给药。第一期每只动物给药剂量为0.1LD50，以后各期顺次递增50%，即第二期为0.15LD50，第三期为0.225LD50，依次类推，直至雌雄两组合计死亡一半（20只），或继续给药至累计剂量达5.0LD50以上（20d）为止。1263 给药期间每期（4
32、d）须按实测动物体重，计算给药绝对量。1264 结果计算停止给药后按式（1）计算蓄积系数K：K=LD50(n)/LD50(1).(10 LD50(n)-试验动物在给药期间每只动物共摄入试验农药相当的LD50数；LD50(1)-试验农药对本试验动物的经口LD50剂量。1265 结果评定按下列标准评定被检农药蓄积毒性强弱：K1 高度蓄积性；K1 明显蓄积性；K3 中等蓄积性：K5 轻度蓄积性。13 迟发性神经毒性试验131目的了解试验农药的迟发性神经毒性，求出迟发性神经毒性无作用剂量。132 试验农药原药。133 试验动物1331 选用遗传背景明确、健康、步态正常的母鸡，鸡龄814个月，体重1.5
33、-2kg。1332 数量每剂量组母鸡数量应保证在观察结束时存活至少有6只。到期处死，如需观察恢复情况，则应在开始实验时增加延长观察期的动物数。134 给药方法1341 剂量分组一般设三个不同剂量的试验组，一个阳性对照组和一个空白对照组。其赋形剂等生物活性不明确时应增设一个赋形剂对照组。13411 高剂量组：根据：LD50和预试验确定，一般采用LD50剂量。观察期结束时可引起试验动物胆碱酯酶活性下降，以及部分动物死亡。13412 低剂量组：根据预试验确定，可能引起或不引起迟发性神经毒状，其剂量一般为高剂量的五分之一至十分之一左右。13413 中剂量组：在高低之间，其症状在级以上，少部分动物可达级
34、（见13.6.1）。13414 阳性对照组：500mg/kgTOCP（三邻甲苯磷酸酯）。13415 空白对照：除不接触试验农药外，其他各种条件与试验组相同。1342 给药方式通常采用经口途径，包括灌胃、胶囊吞咽或咽峡部滴注等方法。1343 给药前预处理隔夜禁食，经口给药前10min内，所有试验鸡均肌肉注射10mg/kg硫酸阿托品作保护处理。135 试验期限1351 急性试验观察期一般为21d。如未见异常反应或有可疑反应时，须再次给药，继续观察21d。到期处死作组织病理学检查。如特殊需要，部分动物可延长24周或更长时间观察恢复情况。1352 亚慢性试验连续给药13周并观察，停药后再观察一周。13
35、6 临床观察和检查1361 中毒症状给药后每天观察记录试验鸡的外观体征，行为活动，特别是鸡的站立和运动姿势及运动失调程度。必要时可强迫母鸡活动，如爬楼梯等，以便观察迟发性神经毒性的最小反应。其典型症状的分级标准为：步态稍异常；步态严重异常；能以跗站立；不能站立。一般迟发性神经毒性反应在第710d开始出现并逐渐加重。13.6.2 每周称体重一次。13.6.3 病理组织学检查对死亡动物和到期处死动物检查延髓/桥脑、大脑皮质、小脑皮质、脊髓（包括上位颈段、胸段中部、腰骶结合部和坐骨神经等）并作组织切片。一般用灌流或其他方法，使被检脑神经组织固定在原来位置上。坐骨神经切片要作髓鞘和轴索的特殊染色。光镜
36、观察，必要时可作电镜观察检查。137数据整理与结果评定将数据汇总列表，说明每组实验动物数，有上述损伤或异常反应的动物数，出现损伤和异常反应的百分率，并用卡方等统计方法分析组间差异的显著性。评定试验农药能否引起迟发性神经毒性及其反应。评定时应结合所观察到的神经毒性效应和神经病理组织学检查结果综合考虑。14 致突变试验141 目的检测试验农药的诱变性。预测其遗传危害和潜在致癌作用的可能性。142 试验农药原药。143 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）1431 菌株本试验至少要用TA97、TA98、TA100和TA102四种标准突变型菌株。1432 试剂14321 40%葡萄糖溶液：称取4
37、00g葡萄糖，加入蒸镏水稀释至1000mL，在115（0.56kg/cm2）10min高压下灭菌。143220.5mmol/L组氨酸-生物素溶液：D-生物素（分子量247.3） 30.9mgL-组氨酸盐酸盐（分子量191.7） 24.0mg蒸镏水 250mL14323 S-9混合液（按每毫升S-9混合液计算）：大鼠肝S-9 100uLMgCl2-KCl盐溶液 20uL6-磷酸葡萄糖 5umol辅酶 4umol0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4） 500muL无菌蒸镏水 380muL14324 盐溶液1.65mol/L氯化钾（KCl）+0.4mol/L氯化镁（MgCl2）：氯化钾（KCl）
38、 61.5g氯化镁（MgCl26H2O） 40.7g蒸镏水 500.0mL在121（15Ib）20min高压下灭菌。14325 0.2mol/L磷酸盐缓冲剂（pH7.4）：磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O） 0.593g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O） 5.803g蒸镏水 100.0mL在121（1.05kg/cm2）20min高压下灭菌。143260.15mol/L氯化钾溶液：精确称取氯化钾11.18g，用蒸镏水稀释1000mL，121C(1.05kg/cm2)30min高压下灭菌，冷却后冰箱保存。14327氨苄青霉素溶液（8mg/mL）：称取三羟氨苄青霉素80mg，加入0.02mo
39、l/L氢氧化钠溶液10mL。14328 0.1%结晶紫溶液：称取结晶紫10mg，加10mL无菌水。14329 四环素溶液（8mg/mL）：称取四环素40mg，加入0.02mol/L盐酸溶液5mL，用于四环素抗性试验。1433 培养基14331 顶层培养基：琼脂 1.2g氯化物 1.0g蒸镏水 200.0mL在12130min高压灭菌后，加入0.5mmol/L组氨酸-生物素溶液20mL。14332底层培养基：琼脂 7.5g蒸镏水 465.0mL在12130min高压灭菌后，加入（V-B）培养基E10mL和40%葡萄糖溶液25mL，混匀，按每皿30mL倒平皿，冷凝固化合倒置于37培养箱中2448h
40、。14333Vogel-Bonner(V-B)培养基E：硫酸镁（MgSO47H2O） 10.0g柠檬酸（C6H8O7H2O） 100.0g磷酸氢二钾（K2HPO4） 500.0g磷酸二氢钠（NaH2PO44H2O） 175.0g先将柠檬酸、磷酸氢二钾和磷酸二氢钠溶解后，再加入硫酸镁，待完全溶解后倒入容量瓶中，用蒸镏水稀释至1000mL，分装于锥形瓶内，在12130min高压下灭菌。14334 肉汤培养基：牛肉膏 2.5g胰胨 5.0g氯化钠（NaCl） 2.5g磷酸氢二钾（K2HPO4） 1.0g蒸镏水 500.0mL在12130min高压下消毒。14335 肉汤斜面或平板：琼脂 7.5g肉汤
41、培养基 500.0mL在12130min高压灭菌后，倒斜面或平皿。用于菌株鉴定或常规试验用菌株保存。1434溶剂和剂量分组常用溶剂为蒸镏水、二甲基亚砜。此外还可用丙酮、二甲基甲酰胺、甲酰胺、95%乙醇等溶剂，最高加入量为0.1mL。试验农药的剂量范围可在每皿0.1-5.0mg，或对细菌发生毒性的剂量之间。每种试验农药至少设三个剂量组，每个剂量至少三个重复样品。每次试验必须设阳性对照和阴性对照。1435 标准菌株对阳性诱变剂的反应（见表9）。表9 标准沙门氏菌株对阳性诱变剂的回变反应诱变剂剂量（uug)S-9TA977TA988TA1000TA1002柔毛霉素素叠氨化化钠2,4,77-三硝硝基-
42、99-芴酮酮4-硝硝基O-次苯二二胺4-硝基喹喹啉-NN-氧化化物甲基基磺酸甲甲酯2-氨基芴芴苯并（aa）芘6.011.500.2220.000.551.001.001.00-+1247768 337722 1660522817741 742233773 122338 224411 599929922336 11941143473 0000400079884 222022 73303 026693775921188116028776 55862261225514336 菌株株准备与与鉴定114361 组氨氨酸的要要求：将将组氨酸酸营养缺缺陷型菌菌株分别别接种于于含有和和不含有有组氨酸酸的培养养
43、基中，于于37培养224h，观观察细菌菌生长情情况。114362 脂多多糖屏障障缺陷：将含00.1mmL试验验菌株增增菌液的的顶层琼琼脂培养养液倒入入肉汤琼琼脂培养养基上，冷冷凝后，将将无菌圆圆形滤纸纸片置于于培养基基中央，再再滴上00.1%结晶紫紫溶液110mLL，经377培养224h。在在纸片周周围有抑抑菌圈。即即表示结结晶紫分分子已进进入菌体体内并抑抑制其生生长。114363 紫外外线损伤伤修复缺缺陷：将将被测菌菌株在肉肉汤琼脂脂培养基基上划线线，然后后用黑纸纸覆盖一一半，在在15WW的紫外外灯下，距距离333cm处处照射88s，37培养224h后后，TAA97、TTA988、TAA10
44、00和TAA1022在没有有照射的的那一半半生长，在在照射的的那一半半不能生生长。114364 抗氨氨苄青霉霉素试验验：将带带有R因子的的菌株TTA977、TA998、TA1100和和TA1102在在肉汤琼琼脂培养养基上划划线，然然后把沾沾有氨苄苄青霉素素溶液的的滤纸条条与划线线交叉，置置37培养224h，观观察滤纸纸条周围围菌株生生长情况况。144365 抗四四环素试试验：将将被测菌菌株增菌菌液在营营养肉汤汤培养基基上划线线，待干干后，将将四环素素溶液与与菌株划划线处交交叉划线线，经337培养224h后后，对四四环素有有抗性的的TA1102菌菌株生长长不受抑抑制。114366 自发发回变：每种被被测菌株株都以一一定的频频率自发发地产生生回变。TA97、TA98、TA100和TA102经过体外代谢活化后，自发回变数要比不经体外代谢活化的自发回变数略高。14367 操作步骤板平板掺入法：向融化并保温在45的2.0mL顶层培养基试管中依次加入试验农药、0.1mL增菌液0.5mLS-9混合液（或不加S-9混合液）混匀，迅速倾入底层培养基上，使其均