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1、医药导报 2014 年 9 月第 33 卷第 9 期 药物研究 替 莫 唑 胺 耐 药 人 脑 胶 质瘤 细 胞 系 U251 / T 建 立 及 耐 药 机 制 潘强 ， 杨学 军 ， 高松 ， 纪延伟 ， 张文高 1121 （ 1 山东省莱芜市人民医院 、 泰山医学院附属莱芜医院神经外科，莱芜 科，天津 300052； 3 天津医科大学附属肿瘤医院胰腺肿瘤科，天津 南 250031； 5 河北省沧州市中心医院神经外科，沧州 061001） 271100； 2 天津医科大学总医院神经外 300060； 4 山东省交通医院 神经外科，济 摘 要 目的 建立替莫唑胺耐药人脑胶质瘤细胞系 ， 探讨
2、其耐药 机制 ， 以期为临床 优化药 物化疗 方案提供 参考 。 U251 ， ； 方法 通过体外分步诱导方法使人 胶质瘤细胞对替莫唑胺产生耐 药 噻 唑蓝比色 法检测耐药 指数及细胞 存活率 6 采用Western -Blot、 逆转 录 -聚 合 酶 链 免疫 （ T-PC ） 、 免 疫 荧 光 、 免 疫 组 化 法 检测 O -甲 基 鸟 嘌 呤 -DNA 甲 基 转 移 酶 （ MGMT） 表达变化 ， 分析细胞耐药机制 。 结果 历经 8 个月成功建立了 对替莫唑胺耐药的胶质瘤细胞 U251 / T ， 在替 莫 50 U251 胶质瘤细胞的 7 倍 （ P = 0 00） ，
3、其耐药指数约为 7 00； U251/ T 细胞 MGMT 表达水平较未经诱导的 U251 胶质瘤细 胞明显增加 （ P = 0 00） 。 结 论 通过分 步诱导方法于体外成功建立 1 株对替莫唑胺耐药的 U251 / T 细胞系 。 MGMT 表 达水平升高是导致 U251 / T 细胞对替莫唑胺耐药的主要机制 。 关键词 替莫唑胺 神经胶质瘤 ； ； O -甲基鸟 嘌呤 -DNA 甲基 转移酶 抗药性 ； 中图分类号 979 1； 969 文献标识码 A 文章编号 1004 0781（ 2014） 09 1121 05 Establishment of a TMZ-resistant H
4、uman Glioma Cell Line U251 / T and the Mechanism of Drug -resistance PAN Qiang ， YANG Xue-jun ， Gao Song ， JI Yan-wei ， ZHANG Wen-gao （ 1 Department of Neurosurgery， People s Hospital of Laiwu City， Laiwu Hospital Affilliated to Taishan Medical College， Laiwu 271100， China； 2 Department of Neurosurg
5、ery， Tianjin Medical University General Hospital， Tianjin 300052， China； 3 Department of Pancreatic Neoplasms， Cancer Hospital， Tianjin Medical University， Tianjin 300060， China； 4 Department of Neurosurgery， Shandong Jiaotong Hospital， Jinan 250031， China； 5 Department of Neurosurgery， Cangzhou Cen
6、tral Hospital of Hebei Province ， Cangzhou 061001， China） ABST ACT Objective To establish a drug-resistance cell line of human glioma with temozolomide （ TMZ ）， investigate its resistance mechanisms， and provide experimental evidence for optimal TMZ therapy Methods A TMZ-resistant human glioma cell
7、line， U251 / T ， was established by stepwise exposure of human parental U251 cells to TMZ esistance index and cell viability were accessed by MTT assay Western-Blot， T-PC ， immunohistochemistry and immunofluorescence were used to detect MGMT expression for the analysis of resistance mechanism esults
8、 A TMZ-resistant human glioma cell line， U251 /T ， was 50 times higher compared with that in U251 cells （ P = 0 00 ） The MGMT expression was significantly increased in U251 / T cells compared with that in parental U251 cells （ P = 0 00） Conclusion A TMZ-resistant human glioma cell line， U251 /T ， wa
9、s established by stepwise exposure of human parental U251 cells to TMZ The primary mechanism of TMZ resistance is associated with increased activity of MGMT KEY WO DS Temozolomide； Glioma； O -methylguanine-DNA methyltransferase； Drug-resistance 胶质母细胞瘤（ glioblastoma， GBM） 是颅内最常见 咪唑四嗪类衍生物，口服的生物利用度近 10
10、0% ，不经 的恶性肿瘤，占所有颅内肿瘤的 12% 15% 。 临床 肝脏代谢，能迅速透过血 脑脊液屏障 - ，直接在脑胶质 上主要采用以手术治疗为主，辅助放射治疗 、 化学治疗 瘤组织碱性环境中分解，生成活性物质 5-（ 3-甲基三氮 （化疗）及生物治疗的综合方案 。 高脂溶性 、 小分子和 烯 -1）咪唑 -4-酰胺 5-（ 3-methyl-triazen1-yl） imidazole-4- 易于透过血 脑脊液屏障的烷化剂 - ，是目前公认的治疗 carboxomide， MTIC，疗效佳，不良反应小，目前备受临 脑 胶 质 瘤 的 标 准 化 疗 药 物 。 替 莫 唑 胺 床青睐 。
11、 然而，肿瘤细胞内在或获得性耐药限制了烷 （ temozolomide， TMZ）属于第 2 代烷化剂 化疗药物，为 化剂的临床应用效果，目前 GBM 患者平均生存时间只 * 1 2 3 4 5 1 1 025 gmL ， 16 00 gmL ， U251 / T （ IC ） 6 1 2 3 4 5 1 developed after 8 months of stepwise induction with 025 16 00 gmL TMZ IC in U251 /T cells was approximately 7 6 1 2 1122 12 15 。 ， TMZ Herald of M
12、edicine Vol. 33 No. 9 September 2014 16 00 g mL 。 有 个月 迄今多数研究业已证实 O - 导致胶质 -DNA 终浓 度为 16 00 gmL TMZ 每 个月定 时 加入 7 d， TMZ 瘤细胞对烷化 剂耐药 的机制与 6 甲基鸟 嘌呤 溶液培养 使 耐药细胞 甲 基 转 移 酶 （ O - methylguanine -DNA 系 U251 / T 的耐药性保持稳定 。 methyltransferase，MGMT） 表达水平有关 。 笔者通过分 1 3 2 T） MTT 法检 测 U251 胶质瘤 耐药 细胞 （ U251 / U251
13、TMZ ， ， 耐药指数 将对数生长期 胶质瘤耐药细胞 步诱导法构建对 耐药细胞 检测其耐药机制 以 （ U251 / T ） 和 U251 胶质瘤细胞，按照接种浓度为每 期为进一步研究耐药机制 、 克服耐药提供参 考 。 1 材料与方法 1 1 细胞系来源 GBM 细胞系 U251，购自中国科学 院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所 中国科学院细胞库，稳定传代 10 代后用于实验 。 1 2 药品与试剂 TMZ 由天津天 士力医药 公司提 供 。 二甲亚 砜 （ dimethyl sulfoxide， DMSO ） 购自 美 国 Sigma 公 司 。 噻 唑 蓝 （ thiazo
14、lyl blue， MTT ） 购 自美 国 Sigma-Aldrich 公司 。 免疫试 剂中 抗 工作 液 MGMT 小鼠 抗人单克隆抗体 MT3 1（ MAB16200） 为 Chemicon 公司产品， 抗工作液中辣根过氧化物酶标记的山羊 抗小鼠 IgG（ BA1038） 由武汉 博士德生物工程有限公 司提供 小鼠 ， -actin 单克隆抗体购自美国 Santa Cruz 公司；所有抗体工作浓度均为 1 1 000。 聚偏二氟乙 烯膜购 自 美国 Millipore 公 司 。 实时 聚 合 酶 链反 应 - （ real time-polymerase chain reaction
15、， T -PC ） 相关试 剂购自日 本 Takara 公司，达尔伯克改良伊格尔培养液 （ Dulbecco s modified Eagle s medium， DMEM）购自北京 索莱宝公司 。 胎牛血清（ fetal bovine serum， FBS）由美 国 Hyclone 公司提供 。 1 3 实验方法 1 3 1 细 胞培养及 细胞耐药 分步诱导 GBM 细胞 U251 置于含体积分数为 10% FBS 的 DMEM 完全培养 2 常规培养 。 TMZ 溶于 DMSO 溶液，储存液质量浓度为 100 mgmL ，细胞培养过程中 DMSO 浓度始终维持 0 10% ，以免影响细胞生
16、长 。 处于对数生长期的 U251 胶质瘤细胞制成细胞悬液 1 10 个 mL ，常 规 培 养 24 h 后 加 入 初 始 诱 导 剂 量 的 TMZ 0 25 gmL ，继续培养 15 20 d，待细胞生长稳定 后倍增药物诱导浓度，每一 诱导浓度 培养 15 20 d， 收稿日期 2013 09 09 修回日期 2013 11 09 基金项目 国家自然科学基金资助项目（ 30772228） 作者简介 潘强（ 1980 ），男，山东 莱芜人，主 治医 师，硕 士，研究方向：神 经上 皮 来源 肿瘤 。 电话：（ 0） 13561724411， E- mail： pqianglin 163
17、com。 通讯作者 杨学军（ 1965 ），男，天 津人，教授，博 士生 导 师，博 士，研 究 方 向： 神 经 上 皮 来 源 肿 瘤 。 电 话： （ 0 ） 13011329950， E-mail： ydenny yahoo com。 1 1 6 1 ， 37 、 5% （ CO ） 、 1 3 5 1 1 * 孔细胞 3 10 个接种于 96 孔培养板内，每一浓度设复 孔 6 个，培 养 24 h 后 分 别 滴 加 5， 50， 100 和 500 molL TMZ 溶 液 ，继续 培养 72 h； 弃 上清 液，检测前 4 h 每孔加入 MTT 溶液（ 5 g L ） 20 L，
18、 继续 原条 件 下培 养 4 h，弃 去 上清 液，每 孔再 加 入 DMSO 溶 液 150 L 以终止 反应，振荡 10 min，经 Bio- ad 酶标仪检测每孔在波 长 570 nm 下的吸光度 （ A） 值，以 490 nm 为参考波长 。 按照耐药指数 = 半数抑制 50 50 细胞耐药指数 。 1 3 3 Western-Blot 法检测 MGMT 蛋白表达 选择 对数生长期的待检测的 U251 胶质瘤细胞 5 10 个进 行 Western-Blot 检测 。 提取总蛋白后采用二喹啉甲酸 法行蛋白浓度测定，上样量为 50 g，行 十二烷基硫酸 钠 -聚丙 烯 酰 胺 凝 胶
19、电 泳 （ sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis ， SDS-PAGE）电泳后转 膜，膜封闭液室温封闭 3 h 后，滴加 MGMT 小鼠抗人单 克隆抗体（ 抗） 和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小 鼠 IgG（ 抗）进行孵育；化学发光物按照比例（ 1 1） 混匀 、 加于聚偏二氟乙烯膜上， X 线片适度曝光后进行 -肌动蛋 白 （ -actin） 二 次 杂交，即 70 水 浴洗 膜 30 min Tris-HCl （ pH 6 8） 62 50 mmol L ，体积分 数 2% SDS， -巯基乙醇 100mmol L
20、 ，同法，以小鼠 -actin 单 克 隆抗 体 （ 1 1 000） 孵 育后 曝 光，以 - action 作为内参照物 。 采用 Alpha Innotech 凝胶成像 仪检测结果，以 FluoChem V2 0 版软件计算各条带的 平均 A 值 。 每个样本重复检测 3 次 。 1 3 4 T-PC 检 测 采用 Trizol 法 提 取细 胞 总 NA，用 NanoDrop ND-1000 进行定量 NA 浓度，逆转 录 为 cDNA。 MGMT （ Genebank accession no NM _ 002412 ） 设 计 引 物， forward， 5 -CCTGGGAACA
21、A- GCGTGTCT-3 ； reverse， 5-CTGGACAGCGGCTATGGC-3 ， 产物 236 bp。 -actin PC 引 物 序 列： forward， 5 - TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3 ； reverse， 5 -GAAGCA- TTTGCGGTGGACGAT-3 ，产物 315 bp。 以逆转录合成 cDNA 为模板，在 200 L EP 管中按下列顺序加入反 应体系： Master Mix 10 L，上下游引物混合物 1 L， cDNA 溶 液，纯 化水，充 分 混匀 各 组分，反应 体 系为 3 1 4 1 （ IC ） （ U251 /
22、T ） / IC （ U251） ， U251 / T 6 1 1 医药导报 2014 年 9 月第 33 卷第 9 期 20 L。 MGMT 反应条件： 94 预变性 5min， 94 变 U251 细胞无或弱荧光 ，而 U251 / T 1123 细胞质呈绿色荧 30 s， 52 30s ， 72 30 s， 40 ， （ 3） 。 DAPI ， ； 性 退火 延 伸 个循 环 光 图 胞核为 染色 呈蓝色 免疫组化法检 72 总延伸 5 min。 -actin 反 应条件： 94 预 变性 测 U251 及 U251 / T 细 胞中 MGMT 表 达情 况发 现， U251 ， U25
23、1 / T 5 min， 94 变性 30 s， 52 退火 30 s， 72 延伸 30 s， 36 ， 72 5 min。 PC 2% 细胞无着色 （ 3） 。 而 细胞呈棕黄色或褐色 U251 / T MGMT 个循环 总延伸 扩增产物在 着色 图 以上结果说明 细胞中 琼脂糖凝胶中电泳检测 。 1 3 5 免疫荧光检测 将肿瘤细胞消化成细胞悬液 稀释成约 1 10 个 mL ，培养 24 h 后 4% 多聚甲醛 固定 细 胞 30 min，磷 酸 盐 缓 冲 液 （ phosphate buffer solution， PBS）洗涤后， 1% 牛血清清蛋白（ albumin from
24、bovine serum， BSA ） 封闭 30 min，一抗（ 1 1 000 稀释） 4 过夜，洗涤后，荧光二抗（ 1 1 000 稀释） 37 孵 育 1 h。 避光， 4 ， 6-二脒基 -2-苯基吲哚（ 4 ， 6-diamidino- 2-phenylindole， DAPI）染核 20 min，封片 。 荧光倒置显 微镜下观察并摄像 。 1 3 6 免疫组化检测 按免疫荧光方式固定细胞，一 抗 、 二抗处理细胞后，滴加链霉亲和素 -生物素复合物 溶液， 37 孵 育 20 min， 3， 3 -二 氨基 联 苯胺 （ 3， 3 - diaminobenzidine， DAB）
25、显色，苏木精复染，梯度脱水， 封片显微镜下观察并摄像 。 表达较 U251 细胞中明显增强 。 图 1 TMZ 对 U251 细 胞和 U251 /T 曲线 细 胞的 剂量 反 应 - 1 4 统计学方法 。 数据采用 SPSS16 0 版统计软件进 （ x s ） ， Fig 1 T cells Dose-response curve of TMZ on U251 and U251 / 行分析 Probit 计量资 料以均 数 TMZ 标准 差 表示 由 过程分析 不同浓度梯度与细胞生长抑制率 之间的关系；直线回归方程计算两组 U251 胶质瘤细 胞各自的半数抑制浓度 （ IC50 ） ；两
26、样本均数间的比较 行 t 检验， P 0 05 为差异有统计学意义 。 2 结果 2 1 细胞耐药性检测 采用分步诱导法经过 8 个月 成功建立对 TMZ 具有稳定耐药的 U251 / T 细胞 。 结 果显示， TMZ 对 U251 / T 细胞产生作用的剂量 反应 - 曲线（图 1） 上移，经回归方程计算 U251 胶质瘤细胞 IC50 为（ 33 12 1 52） molL ， U251 / T 细胞 IC50 为（ 220 87 2 34） mol L ， U251 / T 对 U251 胶 质瘤细胞的耐药指数约为 7，即 U251 / T 细胞对 TMZ 的耐受程度为 U251 胶质
27、瘤细胞的 7 倍，二者差异有 统计学意义（ t = 116 54， P = 0 00） 。 且 U251 / T 细 胞经 2 个月无 TMZ 体外培养后，采用诱导终浓度进行 刺激培养 10 d，其耐药性仍维持 5 倍，并可于之后的传 代培养过程中保持耐药性，表明该细胞耐药性稳定。 T 图 2 细胞中 Fig 2 4 1 1 1 Western -Blot 和 T-PC 检 测 U251 细 胞和 U251 / MGMT 的表达 MGMTexpressionin U251andU251/Tcellsby 2 2 U251 及 U251 / T 细 胞 MGMT 表 达 变 化 Western-
28、Blot and T-PC detection Western-Blot 、 T-PC 检测结果显 示， U251 胶 质瘤细 3 讨论 胞不表达 MGMT 或呈低表达， U251 / T 细胞 MGMT 表 达水平明显升高，差异有统计学意义（ P = 0 00，图 2） 。 检测 U251 及 U251 / T 细胞中 MGMT 表达情况发现， 虽然目前神经外科影像 、 手术技术已经得到了长 足发展，但是 GBM 的治疗效果仍不尽如人意 。 化疗自 20 世纪 80 年代开始作为对脑肿瘤的辅助治疗手段 ， 5 1124 Herald of Medicine Vol. 33 No. 9 Sep
29、tember 2014 A U251 细胞 （ 免疫荧光法 ）； B U251 /T 细胞 （ 免疫荧光法 ）； C U251 细胞 （ 免疫组化法 ） ； D U251 /T 细胞 （ 免疫组化法 ） 图 3 免疫荧光法和免疫组化法对 U251 细胞和 U251 /T 细胞中 MGMT 的检测结果 （ 200） A U251 cells（ immunofluorescence）； B U251 /T cells （ immunofluorescence ）； C U251 cells（ immunohistochemistry ）； D U251 /T cells（ immunohistoc
30、hemistry） Fig 3 MGMT expression in U251 and U251 /T cells by immunofluorescence and immunohistochemistry （ 200） 在延长胶质瘤患者生存期方面发挥了重要作用 。 GBM 基因启动子区 CpG 岛的非甲基化是导致 MGMT 表达 的化疗药物一般选择脂溶性 、 小分子 、 易于透 过血 -脑 的原因 。 但笔者的研究揭 示 MGMT 基因 启动子区 脊液屏障的细胞毒性药物，其中，临床以亚硝脲类药物 CpG 岛的甲基化状态与 MGMT 的表达无相关性，如肿 最受推崇 。 口服烷化剂 TMZ 以
31、其确切的临床疗效，为 瘤自身增殖 、 血管生成 、 侵袭 、 免疫调节过程中某些因 GBM 的化疗带来了希望，但肿瘤细胞内在的或获得的 素的改 变可能 也影响 MGMT 表达 。 另外，野 生型 耐药性限制 了药 物的 临床效 果 其 年生 存率 因此 阐明 细胞耐药机制并探讨其逆转方 式，将对新药的研发，逆转耐药性，改善患者生存状态， 优化临床化疗方案等具有重大意义，而耐药细胞系的 建立是进行此类研究的基础 。 关，其 调 控 机 制 是 独 立 于 启 动 子 甲 基 化 的 。 在本研究中，笔者通过体外分步诱导的方法使人 U251 胶质瘤细胞暴露于不同浓度的 TMZ 中，历经 8 个 （
32、 LOH） 与 MGMT 失活相关 。 在本研究中， U251 胶质 月，成功地诱导了一株耐药指数约为 7 的耐药细胞系 瘤细胞在诱导培养过程中 MGMT 表达水平明显升高， U251 / T。 经免疫荧光法 、 免疫组化法 、 Western-Blot、 对 检测结果显 示 细胞表达 而 胶 质 瘤 细 胞 则 不表 达 或 极 低 表 达 MGMT（ P 0 01） 。 根据肿瘤 细胞 MGMT 是否表达， 参考文献 1 潘强，杨 学军，纪延 伟，等 胶 质母细 胞瘤 MGMT 基因 启 的 MGMT 基因重新表达的缘故 。 有学者认为， MGMT 动子甲基化与蛋白表达 J 中华神经 外科
33、杂志， 2010， 6 8 1 p53（ wild-type p53， wt-p53） MGMT 9 抑制作用 。 也有学者持相反观点认为，突变型 p53 MGMT （ ） 10 。 B MGMT 10-11 12 IDBAIH 1p 19q MGMT 。 由于 TMZ 主要通过 DNA 甲基化对肿瘤细胞产生 6 毒性作用，而MGMT 可以去除鸟嘌呤 O 位加合的甲基 6 DNA ， MGMT 。 ， + MGMT Mer ， ， Mer 。 ， ， ， 代培养的U251 胶质瘤细胞属于 Mer 细胞，对 TMZ 敏 阶段适度递增 TMZ 浓度是细胞顺利产生耐药性的重 ； U251 / T M
34、er ， TMZ ，。 。 TMZ ， ， 地建立对TMZ 稳定耐药的胶质瘤细胞系， MGMT 表达 T98G细胞 即 MGMT 呈高表达，对 TMZ 耐 药性明显 。 TMZ ； U251 Mer 细胞，但不排除在其群 TMZ ， 、 + Mer ， TMZ 耐药性逆转和临床药物化疗方案的优化奠定基础 。 在 + Mer细胞被杀死，而少量 Mer 细胞得以存活，并成为 ， 、 7 以后耐药细胞克隆生长的母体 。 HAMPSON 等 则认 。 ， MGMT Mer ， ， 医药导报 2014 年 9 月第 33 卷第 9 期 （ 26） ： 527 530 8 CHISTIANS A， HA
35、TMANN 1125 C， BENNE A， et al 2 ALNAAMI I M， AL-NUAIMI S K ， SENTHILSELVAN A， et Prognostic value of three different methods of MGMT al Effectiveness of adjuvant temozolomide treatment in promoter methylation analysis in a prospective trial on patients with glioblastoma J Neurosciences （ iyadh） ， new
36、ly diagnosed glioblastoma EB /OL 2012-03-13 3 2013， 18（ 4） ： 349 355 王俊杰，王刚 刘明华， 替莫唑胺耐药细胞系 U87 / T 的 9 http： / / www ncbi nlm nih gov / pubmed /22428052 S IVENUGOPAL K S， SHOU J， MULLAPUDI S ， et al 构建及槲皮 素对 其耐 药 性的 逆转 作 用 J 医药 导 报， Enforced expression of 6 wild-type p53 curtails the 2013， 32（ 6）： 7
37、10 714 transcription of the O -methylguanine-DNA methyl- 4 5 6 7 KANZAWA T， GE MANO I M， KOMATA T， et al ole of autophagy in temozolomide-induced cytotoxicity for malignant glioma cells J Cell Death Differ， 2004， 11（ 4） ： 448 457 MA KUS B Anticancer drug resistence in primary human brain tumors J Br
38、ain es ev， 2001， 35（ 20）： 161 204 潘强，杨学 军 MGMT 表达 在胶质瘤 对烷化 剂耐药 中的 作用 J 国际神经病 学神经 外科学 杂志， 2009， 36（ 1） ： 33 36 HAMPSON ， HUMBE T O， MACPHE SON P， et alMis- match repair defect and O - methylguanine-DNA methyltransferase expression in acquired resistence to methylating agents in human cells J J Biol C
39、hem， 1997， 272（ 45） ： 28596 28606 10 11 12 DOI transferase gene in human tumor cells and enhances their sensitivity to alkylating agents J Clin Cancer es， 2001， 7（ 5）： 1398 1409 VLACHOSTE GIOS P J， HATZIDAKI E， PAPAND EOU C N MGMT repletion after treatment of glioblastoma cells with temozolomide and
40、 O -benzylguanine implicates NF -B and mutant p53 J Neurol es， 2013， 35（ 8） ： 879 882 魏新亭 杜伟， ，郑杰，等 人脑 胶质瘤耐 药基 因 MGMT 和 NF-B 的 表 达 及 意 义 J 中 国 实 用 神 经 疾 病 杂 志， 2008， 11（ 10） ： 8 10 IDBAIH A， OMU O A ， DUC AY F， et al Molecular gene- tic markers as predictors of response to chemotherapy in gliomas J Curr Opin Oncol， 2007， 19（ 6）： 606 611 10 3870 / yydb 2014 09 001 櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆 2015 年 医药