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1、河北科技大学 硕士学位论文 藻类荧光对重金属毒性响应规律的研究 姓名：田程 申请学位级别：硕士 专业：环境工程 指导教师：崔建升 20101212 摘要 废水环境效能的评价己成为社会的迫切需求，生物毒性作为水质生态评价的综 合指标，因能快速得出多种污染物共存下的生物效能受到广泛重视。生物毒性测试 不仅能较全面地反应废水中复合污染物的联合毒性作用，并能充分了解各种环境因 子（如 pH值、温度、溶解度等）对污染物毒性效应的具体影响，直观地反映出污染 水体对生物种群的综合毒性，是预测和控制化学物质污染的一种不可缺少的辅助手 段。叶绿素荧光被认为是研究光合作用的理想探针，藻类光合作用在其细胞代谢中 占
2、有核心地位，利用微藻叶绿素荧光检测重金属毒性，具有快速、敏感的特点，在 水质安全评价上具有良好的应用前景。 本课题通过文献初筛三种微藻一斜生栅藻、蛋白核小球藻、铜绿微囊藻作为实 验供试藻。通过预实验确定四种典型重金属离子 Cd2+、 Hg2+、 Cu2+、 Zn2+作为实验胁 迫因子，当供试藻生长到对数生长期值在 0.3以上，将重金属溶液母液稀释成一 定浓度梯度后添加到 藻培养液中进行胁迫实验。通过重金属对三种供试藻生长及光 合色素影响研究得出四种重金属对供试藻的毒性作用顺序，斜生栅藻为 Hg2+Cd2+CU2+Zn2+;蛋白核小球藻为 Cd2+Cu2+Zn2+Hg2+;铜绿微囊藻为 Cu2+
3、Hg2+Zn2+Cd2+。 并分析供试藻种对四种重金属离子的毒性耐受顺序， Cd2+为 铜绿微囊藻 斜生栅藻 蛋白核小球藻； Hg2+为蛋白核小球藻 铜绿微囊藻 斜生栅藻； Cu2+为斜生栅藻 蛋白核小球藻 铜绿微囊藻； Zn2+为斜生栅藻 铜绿微囊藻 蛋白核 小球藻。 通过重金属胁迫供试藻荧光响应实验，研究了供试藻对四种典型重金属离子 Cd2+、 Hg2+、Cu2+、 Zn2+的荧光响应。实验结果表明，重金属对藻种的荧光性影响效 果显著，随着胁迫浓度和时间的延长藻光合作用受抑制明显，藻种焚光值与叶绿素 含量间有良好的正相关关系，荧光值呈现先上升再下降的趋势。荧光胁迫实验得到 的结果与藻生长抑
4、制和光合色素的影响趋势基本一致，证明藻种的荧光值变化可以 反应重金属毒性，利用藻荧光响应特性检测重金属浓度胁迫是可行的。 在敏感藻确定实验中以 2 min作为测试间隔，测定 20 min藻种荧 光值的变化 * 以藻种荧光强度作为首要考虑条件，时间、重金属种类数及重金属响应效率作为分 析参考依据，最终确定荧光重金属敏感藻为斜生栅藻。并以 HgCh作为典型毒性代 表物质，分析了反应时间与 HgCl2溶液浓度、斜生栅藻荧光变化差值间的线性关系， 确定 16 min为测试的稳定时间，根据藻荧光差值与对应的 HgCh浓度初步建立了水 质毒性评价等级。 关键词叶绿素荧光；重金属毒物；生物毒性检测；斜生栅藻
5、；蛋白核小球藻；铜 绿微囊藻； Abstract The effectiveness evaluation of water environment has become the urgent needs of society, biological toxicity as water ecological evaluation index of pollutants can quickly concluded by the biological efficiency under the coexistence. Biological toxicity test is a kind of in
6、dispensable assistant method which be used to Predicte and control chemical pollution. Because it can response the joint toxicity role of compound pollutants in aste water comprehensively, and it can describe the compositive toxicity to biological population which done by the polluted water intuitiv
7、e. The chlorophyll fluorescence is considered the best probe to research photosynthesis. The photosynthesis of microjalgae occupies the core status of cell metabolism. So there have prospects to detection tonicity which belonds to heavy metals by chlorophyll fluorescence, because it has advantages o
8、f quickly and sensitively. After Literature retrieval, the author selected three strains microalgae for experiment, there are Scenedesmus obliquus, Chlorella pyrenoidosa, Microcystis aeruginosa. Cd2+, Hg2+, Cu2+, Zn2+ four types of typical metals for the Stress testing. The Concentration of metals d
9、esigned as 0.004 |imol L“1, 0.01 iimol-L*1, 0.02 lmol-L*1, 0.21 iimol-L1, 2.09 Hmol.I/丨， 20.9 urnol-I/1. We can add some heavy metal solution to the culture solution, when the testing micoalgae growth to logarithmic growth, and its value of OD more than 0.3. . | First, we do the experiment about the
10、 growth and photosynthetic pigment influence of three strains microalgae by Cd2+, Hg2+, Cu2+, Zn2+ four types of typical metals Stressed. The results show that, the toxicity of four kinds of heavy metals to three strains I microalgae as follows. The toxic effects to Scenedesmus obliqutis is Hg2+Cd2+
11、Cu2+Zn2+; the toxic effects to Chlorella pyrenoidos is Cd2+Cu2+Zn2+Hg2+; the toxic effects to Microcystis aeruginosa is Cu2+Hg2+Zn2+Cd2+. In order of patience with toxic heavy metals by three strains microalgae as follows. Hg2+: Chlorella pyrenoidosa Microcystis aeruginosa Scenedesmus obliquus; Cu2+
12、: Scenedesmus obliquus Chlorella pyrenoidosa Microcystis aeruginosa Zn2+: Scenedesmus obliquus Microcystis aeruginosa Chlorella pyrenoidosa. Then the author do the experiment about the Chlorophyll fluorescence response with four types of typical metals Stressed. Get a conclusion: the response of Chl
13、orophyll fluorescence sex of algae striking by metals Stressed. The results of experiment showed that the fluorescence affect of Microalgae by heavy metal significantly. Photosynthesis restrained seriously on account of prolonging stress concentration and time. Fluorescence stress experiment results
14、 obtained with algae growth inhibition and photosynthetic pigment is basically the same influence of trend, proof by fluorescence value change, use toxic heavy metals responses can algae fluorescence response characteristics testing heavy metal concentration stress is feasible. The experiment of det
15、ermining sensitive algae to test the fluorescence value change in 20 minutes With two minutes frequency. Finally determined fluorescence heavy metal sensitive algae is Scenedesmus obliquus. HgC as a typical toxicity representative material, analyzed the different time linear relationship between HgC
16、l2 solution concentration and algae fluorescence value change. Determine the 16 minutes for testing the stable time, according to the algae fluorescence value for the difference and corresponding HgC concentration initially established a water quality toxicity assessment level. Key words Chlorophyll
17、 fluorescence; Heavy metal toxicants; Biotoxicity detection; Scenedesmus obliquus, Chlorella pyrenoidosa; Microcystis aeruginosa, 第 1 章绪论 1.1研究背景 随着社会经济的快速发展，工业化程度越来越大，重金属污染物向环境的排放 量日趋增加。这些污染物质主要来源于电镀、采矿、冶金、石油等多种工业行业产 生的废水，是对生态环境危害极大的一类污染物。所谓重金属是指密度浓度 4.0以上 约 60种元素或密度 5.0之上的 45种元素。砷、硒是非金属，但它的毒性及某些性质
18、 与重金属相似，所以将砷、硒列入重金属污染物的范围内。环境污染方面所指的重 金属主要是指生物毒性显著的汞、锅、铅、铬以及类金属金属砷，还包括具有毒性 的重金属锌、铜、钴、镍、锡等污染物 m。自然界中的重金属 般不易 消失，它可以 通过食物链而被富集，不能被微生物降解，相反的，其长期蓄积性强，可能由于生 物放大效应而使某些重金属协同转换为毒性更大的金属有机化合物。 汞是一种毒性较大的重金属离子是水体污染的重要来源。水体中的汞主要来源 于食盐电解、化工、农药等工业废水。有机汞因为具有很强的脂溶性容易透过细胞 膜进入机体而比无机汞的毒性更大。无机汞进入生物体内，通过食物链的浓缩被人 类食用就会引起中
19、毒。日本的 水俣病 就是人们吃了甲基汞富集的鱼类所导致的。 自然水域中汞含量很小，通常不超过 0.1呢 .L是我国实施的总量控制指 标。人们 饮用含汞50 mg/L的水 2 L就会中毒死亡。有研究显示，较低的浓度下汞就降低藻类 的固氮酶的活性，诱使藻类细胞形态发生畸变。 镉是剧毒性物质，它可以协同体内的其他毒物使毒性增大。主要来源于电镀、 冶炼、染料等工业废水。它通常以正二的价态存在于自然界中，当水中镉的含量为 O .l m g .L -1时，会抑制地表水的自净作用；当农溉水中 Cd2+浓度为 O.OOTmgU1时会 造成轻度污染，浓度达到0.04 mg.I； 1时土壤和稻米的受污染情况明显
20、【 2】 。镉作为我国 排放总量控制指标，国家标准限值为：废水中的最高允许排放量为： .1 m&U13。 镉具有肾毒性，对白细胞也产生毒性，是机体抗细菌感染的能力下降； 1993年国际 抗癌联盟将镉定为 IA级致癌物，当镉中毒时肾脏对钙、磷的重吸收率下降，对维生 素 D代谢异常 4。 铜主要来源于金属矿石的开采，冶炼和金属加工、机器制造、有机合成及其他 工业废水中，是一种常见的环境污染物 51。与其他重金属不同的是铜、锌具有双重作 用，它们是机体生长代谢所必须的微量营养元素高浓度的铜是一种应用广泛的藻类 生长抑制剂， 如硫酸铜、络合铜广泛运用于杀藻剂的研究。铜对植物的光合作用有 很强的抑制作用
21、，它能抑制 PSII的电子传递，抑制光合磷酸化和非光合磷酸化过程， 抑制 RuBP羟化酶的活性等 6。 根据重金属毒性及其对生物和人体的危害，概括重金属有如下的特点 【 7】： 1) 微量的重金属便能产生毒性效应，自然水体中一般重金属的毒性范围是 1-10 mg!； 1，汞、镉等毒性较强的重金属毒性范围更小一般在 0“ l- .001mgl/l以上； 2) 自然水体中的某些重金属可在微生物富集作用下转化为毒性更强的有机重金 属，如汞的甲基化； 3) 重金属进入水生生态系统后不能被水生生物降解，蓄积性更强，随着生物链 的放大作用逐级放大，当这些污染物质经过长期积累并达到很高浓度时，破吁生态 环境
22、的物种组成及其群落结构 4。当污染累积到一定程度后不仅会影响水生生，的正 常的生理代谢、生命活动，更严重的是会直接或间接地威胁人类的社会生产、 活。 如 2005年 11月松花江苯类污染事件， 2 5年 12月广东北江韶关段镉污染事彳 f等近 年来水污染突发事故频发，都严重影响了周边 城市生产和社会生活。我国的 +表饮 用水源地主要为湖泊、河流、水库，但经检验这些水源都遭到不同程度的污染如： 徐小清的研究结果表明，由于沿长江城市和工厂 三废 的排放使长江三峡库运江段 的重金属元素含量严重超标。而由于各重金属成分特性所造成的毒性、遗传毒性、 雌激素效应等生物效应都给废水水质评价带来了一定的困难。
23、 1.2毒性物质检测方法的研究进展 ! 有毒物质进入水生生态系统后不被水生生物降解，而通过食物链的生物敢大对 高营养级的生物甚至人类造成危害，严重威胁人类健康和生命安全。我国对宁毒性 物质的检测起步很早，最早采用特定物质分析法 8】 等理化方法。这种方法发展 f、 方 法完善，但不能直接和全面反映各种有毒物质对水体的综合影响。目前一般兔做对 毒性成分的深度分析。 D 生物毒性是指外源化学物质与机体接触或进入体内的易感部位后，能引起损害 作用的相对能力（包括致癌、致突变、致畸、损害器官或免疫系统和母体毒性 f方面 ) 或简称为损伤生物体的能力。生物毒性作为水质污染的基础指标之一对水生也物和 水体
24、生态平衡有着重要意义，是国际普遍应用的综合性监测指标。它能正确的反映 出水体的污染负荷与生物学效应的关系，直观地反映污染水体对生物种群的综合毒 性，是预测和控制化学物质污染的一种不可缺少的辅助手段，因此该项指标己越来 越得到世界范围的重视。 水生生物急性毒性实验即是测定高浓度污染物在短时期 (一般不超过几天 )内对 水生生物所产生的明显毒害作用，用以评价污染物毒性的实验方法，作为理化分析 方法的补充，是水质评价的新手段 【 9-11】 。生物毒性检测方法是由单指标生物毒性实验 发展起来的，但是水体中的生物种类繁多，仅凭一种水生生物对毒性的反应来评价 整个水体并不客观，因此鉴于单指标生物毒性实验
25、的不足，到 70年代后又发展了利 用同一营养级的几种生物同时对某个环境样品或污染物进行多指标生物测试 (Multispecies Bioassay)。 20世纪 90年代细胞生物学和分子生物学快速发展，近年来 对生物毒性的研究更加趋向于微观。在急性毒性分析方面，新的检测手段不断建立， 其指示生物包括细菌、鱼、无脊椎动物和藻类等。 1.2.1发光细菌毒性检测实验 自 1672年 R.Boyle观察到发光的菌体所发出的光易被化学物质抑制后，许多科 学家开始对细菌的发光效应进 行大量的研究，直到 20世纪 80年代国外科学家首次 从海洋鱼类体表成功分离出一种发光菌。通过研究他们认识到发光细菌在毒性检
26、测 方面具有巨大的优势，由此一套完整的生物发光毒性检测技术 (L.B.T.)被逐步的建立 起来。我国在这方面的起步也比较早，肋年代中期，中科院南京土壤所、南專大学 便开始引用推广此项技术。由于发光菌检测时间短、灵敏度高得到广泛认可，：方法 得以迅速普及，我国于 1995年将其列为环境毒性检测的标准方法 (GB/T15441-1995)。 发光菌体内的荧光素酶会催化荧光素发生氧化反应，是菌体正常发 光，但当有毒性 物质存在时，发光菌的荧光素酶受到毒性物质的抑制而使发光强度减弱。由于这种 减弱程度与毒性物质的浓度成一定的线性关系，可以根据这个原理来测定污染物或 者废水的毒性 12】 。该方法适合各
27、种有毒化合物如废水、沥出液 (土壤、固体废物等 )、 化工原料、土壤、海洋中受污染区域的生物毒性的测定。可广泛应用于质检、环境 监测、水产养殖等领域，在实验室被广泛应用于各种物质毒性的测定。 发光菌法虽然具有灵敏度高、相关性好、反应速度快等优点，但其再现性欠佳 13， 细胞发光强度本底差异大，检测期间发光自然变化幅度较宽的问题，并且由 +发光 菌的培养条件等限制，方法只能在实验室内进行。林志芬 14等研究了培养时间、培 养世代、培养温度等条件对测定值的影响，并通过引入校正因子改进了测试方法， 使实验数据的标准偏差降低，提高了实验的重现性。发光菌法中广泛使用的明亮发 光杆菌是一种海洋生物，在测试
28、过程需要 3%NaCI以维持细菌正常生存，这对海洋 污染的毒性测试比较合适，对于淡水体系样品测试会导致样品中一些有毒物质毒性 大小发生变化。 1985年，中国学者从青海湟鱼体表分离出了 种淡水型发光菌一青 海孤菌，该菌具有在淡水体系中能正常发光的特点，更适用于淡水环境样品的生物 毒性测试。童中华等利用该菌对印染废水中的 14种染料进行了毒性检测，结果表明， 发光菌比化学参数能更准确地反映废水的生物毒性。马梅等将淡水发光菌与明亮发 光杆菌测试结果进行了平行对比，结果表明，淡水发光菌对重金属的毒性检测具有 更高的灵敏度。 1.2.2藻类毒物检测方法 在水生毒理学研究中，藻类因其个体小、繁殖快、对毒
29、物敏感、在较短时间内 可得到化学物质对其世代及种群水平的影响并可直接观察细胞水平上的中毒症状等 特点，得到广泛的应用。藻类生物测定 (AlgalBioassay) 般用于有毒化学品的环境毒 性测试，到目前为止，已经成为一种比较成熟的测试系统。藻类生物测试最早是在 1967年美国提出的 暂行藻类测试程序 “(Provisional Algal Assay Procedure， 简称 PAAP)， 而后修改成 AA-BT(藻类测试玻璃瓶法， Algal Assay Bottle Test)15】 。 .美国公 共卫生协会等三组织 1975年将 AA-BT定为通用标准方法 16。 OECD(美国经济
30、合作 与发展组织 )于 1981年提出 藻类生长抑制实验方法 (Alga Growth Inhibition Test ， AGIT)171。 1982-1984年间，国际化标准组织 (ISO)提出了借助藻类判断化学品毒性的 Draft方法。而 OECD的藻类生长抑制实验是目前最常用的一种方法， OECD建议采 用单细胞微藻作为实验藻种。 1993年中国国家环境保护局编写了水生生物检测手 册 ，制定了详细的环境监测技术规范【 18】 。 2004年欧盟公布了国际标准水质 .用单 细胞藻进行淡水藻类生长抑制性实验 (IS08692: 2004) 19并 取代了 EN28692: 1993。 这些
31、标准和规范应用至今，在评价水环境中有毒有物的生态风险等方面发挥着重要 作用。 当藻类暴露给毒物之后，藻类受毒物影响：生长速率下降，内含物变粗，细胞 畸变或分裂受阻，酶活性丧失，代谢迟缓甚至停止。依据藻类的这些反应并结合藻 类生长量的变化，即可对被试毒物的毒性强弱及其环境效应做出较为客观的综合性 评价 【 20。以藻生物量作为测试指标，多是对藻批量培养后观察藻生物 量数量上的变 化。藻生物量包括：细胞数、光密度、干重等，目前常用的方法有藻类的生长抑制 实验、藻类细胞形态及超微结构的变化、生物标志物检测、藻类种群群落的变化、 遗传 物质的损伤等 211，它们都是以 24-96 h的 EC5 的值作
32、为结果的表达。尽管实验 结果准确可靠，但是实验工作量较大，测试周期长。 水体中的环境毒素均能直接或间接抑制单细胞类的光合作用，其中多数除草剂 就是通过抑制光合作用来达到除草目的 【 22】 而污染物对藻类荧光光合率影响敏感， 藻类荧光强度被认为是理想的生物毒性探针 【 23。水质毒性分析荧 光仪 24】 是以单细胞 藻为指示生物，利用水质毒性对其光合活性的抑制，以藻荧光量的变化为参比的生 物毒性检测技术。利用这种方法检测生物毒性大大提高了检验的灵敏度，而且检验 快速，适用于现场检验，具有广泛的应用前景。但由于缺乏藻类对不同化合物的毒 性资料以及不同藻类对毒性化合物的灵敏度资料而使该项技术还没有
33、得到推广 * 1.2.2.1藻类检测方法的优缺点 利用藻类监测水体污染的优越性主要表现在综合反映环境污染对生态系统的 影响； 2)直接观察污染物对生命系统的危害； 3)可早期发现环境污染 ： 4)能监测长期 的影响。但藻类监测也存在着一些问题： 1)传统的藻类监测耗时较长，同时要求监测 人员具有相当广泛的专业知识； 2)藻类监测更多的是一种定性的描述，难以进行定量 的评价和制定相应的水质标准； 3)缺乏藻种对不同化合物的毒性资料。 1.2.3其他检测方法 由于鱼类对水环境的变化敏感，水蚤繁殖能力强，同时对多种有毒物质敏感的 特点这两种指示物在生物毒性实验中应用较早，技术较为成熟 25_27。水
34、蚤也，国际 上普遍采用的标准毒性实验生物 6， 29。近年来，一些学者发现采用生物生理 _行为 上的变化 (如捕食行为、趋光行为及代谢过程等 )作为毒性测试指标可以缩短 $验时 间，提高灵敏度。德国 BBE公司研发的大型蚤水质毒性检测仪 3()以发光蚤中 4各项 生理行为参数，算出水质毒性数据，实现连续在线监测，在 2002年冬季奥运舍得到 很好的应用。 | 生物传感器法 (如：酶传感器 31、微生物传感器 32、 DNA传感器 33_351和免疫传 感器等 )、Ames实验 (该方法己被确立为 ISO标准体系中用于监测环境水的生物遗传 毒性的标准方法 )等多种微生物检测技术己被建立，都对重金属等有毒物质响应高， 检测时间短、操作简便。表 1-1将五种毒性检测实验进行了综合比较。