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1、桂林工学院 硕士学位论文 部分农药、重金属及其混合物对青海弧菌 Q67的抑制毒性 姓名：宋晓青 申请学位级别：硕士 专业：分析化学 指导教师：刘树深 20080401 摘 选择部分除草剂、杀虫剂和重金属为目标化合物，以对青海弧菌如扣 igAflie/ts/s SP.-Q67)发光强度的抑制为毒性指标，应用微板毒性分析法考察了目标化合物及其混合物 的毒性变化规律，其成果可为相关农药和重金属化合物的生态风险评价提供基础数据与技 术支持。 应用微板毒性分析法，测定了敌草净、嗪草酮、苯嗪草酮、西草净、扑灭通、环嗪酮、 草甘瞵、磺草灵、百草敌、敌草快、除草定和敌敌畏等 12种农药， CdClr2.5H2
2、0、 Ni(N03)2-6H20、 CoS04 7H20、 ZnS04.7H20、 HgCl2、 Fe(N03)3.9H20、 MnCl2.4H20 和 CUS05H20等 8种重金属化合物对 Q67的抑制毒性。结果表明所有检验物质都具有典型 的 S型剂量 -效应曲线(dose-response curve, DRC)， 且均可用 Weibull或 Logit函数有效表征。 测定了敌敌畏、除草定、敌草快、环嗪酮、扑灭通和西草净等 6种农药的 3个等效应 浓度比混合物 (EE6-01、 EE6-10和 EE6-50)和 6个均匀设计浓度比混合物 (UD6-1 UD6-6)对 Q67的毒性，并分别
3、应用剂量加和 (DA)与独立作用 (IA)模型对各种浓度组成的混合物的总 效应进行预测。结果发现，除含敌草快浓度较高的 EE6-50、 UD6-2和 UD6-4三个混合物 的总剂量 “效应曲线明显偏离 DA模型预测的 DRC表现出独立作用或协同作用的特征外， 其余 6个混合物均可用剂量加和表征。为了考察敌草快对混合物毒性的特殊影响，又设计 了 3个不含敌草快的5组分农药混合物，其测试结果表明，新设计的混合物的毒性可用剂 量加和模型表征。 考察了由百草敌、磺草灵、西草净、除草定和环嗪酮等 5种除草剂， CdClr2.5H20、 Ni(N03)r6H20、 CoS(V7H20和 ZnS04_7H2
4、0等 4种重金属化合物组成的 3个等效应浓度 比混合物 (EE9-05、 EE9-10和 EE9-50)和 10个均匀设计浓度比混合物 (UD9-01UD9-10)对 Q67的毒性，通过与 DA和 IA模型预测毒性进行比较分析可知，不同类型除草剂与多种重 金属的各种浓度组合的混合物毒性均可用 DA模型进行评估。 关键词：农药，重金属，青海弧菌 Q67,均匀设计，剂量加和，独立作用 Abstract Some herbicides, insecticides, and heavy metals were selected as the target compounds. Using the in
5、hibition of luminous intensity of Vibrio qinghaiensis sp. Q67 as toxicity indicators, the rules of toxicities change for the target compounds as well as their mixtures were studied through the microplate toxicity test procedure. The results can provide theoretical basis and statistic supports for th
6、e ecological risk assessment of pesticides and heavy metals. Using the microplate toxicity test procedure, the toxicities of twelve pesticides (desmetryn, metribuzin, metamitron, simetryn, prometon, velpar, glyphosate, asulam, dicamba, diquat, bromacil, and dichlorvos) and eight heavy metal compound
7、s (CdCl2*2.5H2 , Ni(N 3)2,6H2 , COS04-7H20, ZnS04-7H20, HgCl2, Fe(N 3)3-9H20, MnCl2-4H20, and CuS04-5H20) to Vibrio qinghaiensis sp. Q67 were examined. The result showed that all the tested substances have the typical S-shaped dose-response curve (DRC), and all the DRCs can be effectively described
8、by the Weibull or Logit function. The combined toxicities among three equivalent-effect concentration ratio mixtures (EE6-01, EE6-10, and EE6-50) and six uniform design concentration ratio mixtures (UD6-1-UD6-6) including six pesticides, dichlorvos, bromacil, diquat, velpar, prometon, and simetryn,
9、to Vibrio qinghaiensis sp.一 Q67 were examined. The total-response of mixtures with the diverse concentration compositions of six pesticides were predicted by the dose addition (DA) and independent action (IA) principles. It was found that the total-dose-response curves (t-DRCs) of three mixtures, EE
10、6-50, UD6-2, and UD6-4, which have a high concentration of diquat were deviated from the DRCs predicted by DA principle, showed independent action or synergism feature, whereas the combined toxicities of the other six mixtures could be evaluated by the DA model. To examine the special effect of diqu
11、at on the mixture toxicity, three five- pesticide mixtures excluding the diquat were constructed. The results showed that the DRCs of the new three mixtures had no significant differences from the DRCs predicted by the DA model. Finally, 5 herbicides, Dicamba, Asulam, Simetryn, Bromacil, and Velpar,
12、 and 4 heavy metal compounds, CdCl2.2.5H2 , Ni(N 3)2.6H2 , C0SO4.7H2O, and Z11SO4.7H2C) were selected as the target compounds. The combined toxicities among three equivalent-effect concentration ratio mixtures (EE9-05, EE9-10, and EE9-50) and ten uniform design concentration ratio mixtures (UD9-01-U
13、D9-10) to Vibrio qinghaiensis sp. Q67 were examined. Through comparing the observed toxicities and the ones predicted by DA and IA models, we can see that the toxicities of mixtures with the diverse concentration compositions of five different herbicides and four heavy metals could be evaluated by t
14、he DA model. Keyword: Pesticides; Heavy metals; Vibrio qinghaiensis sp. Q67; Uniform design; Dose addition; Independent action 缩写与符号 本文所用的缩写及公式和图中符号所代表的含义如下 : DA Dose Addition， 剂量加和 IA Independent Action,独立作用 DRC Dose-Response Curve，剂量 -效应曲线 F 稀释因子 CL 毒物的最低效应所对应的浓度 CH 毒物的最高效应所对应的浓度 C 毒物的储备液浓度 c 毒物的设
15、置的浓度 E 效应 Q 产生效应 X%的混合物中组分 f的浓度 EC 组分 i“ 单独产生效应 X%时的浓度 Cmix 混合物浓度 ECmu) 混合物在总浓度为时的产生的总效应 R 实验值与拟合值之间的相关系数 RMSE 实验值与拟合值之间的均方根误差 Obs 观测值 “ 代表实验测定值 代表空白对照值 代表剂量加和 （ DA)预测线 代表独立作用 （ IA)预测线 研究生学位论文独创性声明和版权使用授权说明 独 创 性 声 明 本人声明：所呈交的论 是我个人在刘树深教授指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含他人已经发表或撰写过的研
16、究成果，也不包含为获得桂林工学院或其它教育机 构的学位或证书而使用过的材料。对论文的完成提供过帮助的有关人员已在论文 中作了明确的说明并致以了谢意。 学位论文作者（签字 ): 签字曰期 : 版权使用授权说明 本人完全了解桂林工学院关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照 学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和 电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它 复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部 内容。（保密论文在解密后遵守此规定 ） 学位论文作者（签字 ): 指导教师签字 : 签字日期 : 第 1 章
17、 绪 论 1.1混合污染物毒性研究进展简述 随着我国经济建设的发展，各种各样的化学品正以前所未有的速度涌入商品市场。然 而，正像任何一类经济发展都有其正、负两方面的效应一样，大量的混合化学物制品进入 人类的生存环境，在扩大生产和生活品种范围的同时，也使人群遭受化学物联合暴露的危 险与日俱增。这不仅对于公众的健康构成了新的潜在威胁，而且对于诸如医疗保健、职业 卫生和环境保护等有关领域的管理和专业工作者来说，显然要面临越来越大的挑战。长期 以来，不管是在毒理学的基础研究中，还是从健康保护和预防管理的角度，多化学物对机 体的联合毒作用一直是一个尚未完全解决的难题 1。 1.1.1混合污染物毒性前期研
18、究 混合化学物的毒性研究己经进行了几十年，但是进展并不快。前期研究涉及的是大多 是双组分混合物，多采用等效应浓度 (大都是 EC5 )比配置，结合等效线图、毒性单位法 (toxicity unit, TU)、 相加指数法 (addition index， AI)、 相似性参数 (X)及混合物毒性指数法 (mixture toxicity index， MTI)等进行研究。 国内对混合污染物毒性的研究较少，而且多是应用联合作用指数法进行研究。如袁星 等 m用相加指数法研究了 2,4-二硝基甲苯分别与邻二硝基苯、对甲苯胺、 N,N-二甲苯胺、 苯胺按等剂量混合时对明亮发光杆菌的联合毒性，得出 2,
19、4-二硝基甲苯与苯的氨基衍生物 成拮抗作用，与邻二硝基苯呈协同作用，并将原因归结为苯的硝基衍生物与苯的氨基衍生 物对发光菌的毒性具有不同的反应机制。林春等 3】 应用毒性单位法、相加指数法、混合物 毒性指数法和相似性参数法分别研究了 2,4-二硝基甲苯与 5种硝基苯衍生物在等剂量下的 二元混合物对明亮发光杆菌的毒性，最后评价 2,4-二硝基甲苯与这 5种硝基苯的衍生物在 等剂量混合时对发光菌的联合作用均为协同作用。刘清等 4研究了 Cu、 Zii、 Cd、 Hg分别 2种、 3种、 4种按 EC5 混合时对青海弧菌的毒性，得出具有不同的联合效应。 在国外， Thomulka等 研究了硝基苯与三
20、硝基苯在不同剂量配比下对发光菌的毒性， 用等效线图法得出的结论是加和作用，而用相加指数法得出的结论是协同作用。 Lange等 6 研究了硝基苯与二硝基苯在不同剂量配比下对发光菌的毒性，用等效线图与 MTI指数评价 它们之间呈加和作用，而用 AI指数评价它们之间有拮抗作用。 由于方法所限，前期研究具有几个明显的缺陷：组分数一般不超过 3,无法模拟真实 环境中的多组分混合暴露；没有充分利用剂量 -效应曲线的信息，特别是低剂量段的非线性 部分，无法模拟真实环境中的低剂量暴露；组分浓度配比只考察了混合物浓度空间的某几 个点。 传统毒理学认为毒物剂量越高，毒性越大；剂量越低，毒性越小，最终毒性消失。低
21、剂量暴露研究非常重要，而这恰恰是馄合物毒性前期研究欠缺的地方。近年来越来越多的 物质被观察到具有非单调剂量 “ 效应曲线，在低剂量区域产生了毒物兴奋效应 (Hormesisf， 81。 若组分以低剂量混合，毒性如何评价，前期评价混合物毒性的方法就无能 为力了。 1.1.2多组分混合物毒性研究 直到 2000年 Backhaus等 19， 10】将剂量加和 (dose addition， 简称 DA)与独立作用 (Independent action， 简称 IA)用于多组分混合物 DRC预测， 2001年德国不来梅大学的一个 课题组应用非线性函数模拟剂量 -效应曲线和采用回归代替点估计求算低效
22、应浓度 111，化学 混合物的联合毒性研究才真正进入多组分混合物领域。 近年来，剂量加和 (DA)和独立作用 (IA)模型在混合物毒性研究领域中被广泛应用 。 DA 和IA都是在已知混合物中各单独组分的毒性的基础上对混合物毒性进行预测。通常来说， 具有相同作用靶点及相似作用机理的毒物的联合作用可以用 DA模型来描述，而具有不同 作用靶点及不同作用机理的毒物的联合作用可以用 IA模型来描述。 DA模型己经被证实了 能准确预测一些混合物的毒性。如 Faust等报道的 18种三嗪类除草剂 121和 Jimghans等研 究的 8种磺酰脲类除草剂 131、8种氯乙酰苯胺类除草剂 【 14】 和 25种
23、农药 15对绿藻 (“ Sce/iedeiWMS 的毒性； Altenburger等考察的 16种多氯代酸相似作用物 161和 Backhaus等研究的 10个喹诺酮相似作用物对发光菌 (附 rfo /Isc/tm) 的毒性；莫凌云等报 道的 5种苯酚类化合物 17和葛会林等研究的 5种苯胺类化合物 18对青海弧菌 (F历 nb qinghaiensis sp. Q67)的毒性；以及 Arrhenius等考察的 12种苯脲类除草剂对生物群落的 毒性 1191。 IA模型也广泛的应用于一些混合物体系的毒性预测。如 Faust等研究的 16种不同作用 机理的杀菌剂 120和 Walter等报道的莠
24、去津等 11种相异作用物 121对淡水藻类 vflcwoito)的毒性； Backhaus等研究的 8-氮鸟嘌呤等 14种相异作用物对发光菌 (附咖 的毒性 1()I和 KCN等 6种相异作用物对藻类的毒性 22】。然而，对于环境混合物的毒 性评价，选择 DA还是 IA作为最佳模型仍在争议中 231。 1.2农药混合物的毒性研究 1.2.1农药的种类 农药的品种很多，分类的方法也各式各样。主要有： （ 1)按防治对象分类； （ 2)按成分和 来源分类； （ 3)按作用方式及毒理机制分类； （ 4)按化学结构分类。同时，也有将上述几种综 合或交叉分类。例如：先以防治对象分为杀虫剂、杀菌剂、除草剂
25、 后，再以化学结构 如有机磷、有机氯 进行分类；或再以作用方式及资源来源进行分类。其中，以防治对 象进行分类最为广泛，可分为杀虫剂、杀蹒剂、杀菌剂、杀线虫剂、除草剂、植物生长调 节剂、杀鼠剂、杀鸟剂 .杀软体动物剂、杀卵剂、脱叶剂、干燥剂、种子处理剂等 341 目前全世界作为商品 注册的农药品种约 1200个，用于农业的 250余种，其中 100种 杀虫剂，50种除草剂， 50种杀菌剂， 20种杀线虫列， 30种其他农药等。药剂类型达 60000 种。美国目前是世界上农药使用最多的国家，如不使用农药，作物收成和家禽会立即减少 30%,农副产品价格至少上涨 50%70%;我国农药使用量居世界第二
26、位，农药生产品种有 120多个 25】。然而农药使用只有 10%落在作物上，其余 90%散落在土壤和水体中，加之有 些农药难于降解，通过生物链进入食物，从而进入人体，造成严重的危害。 1.2.2有机磷农药的危害 早在 1936年前后就开始研究合成有机磷化合物 (organophosphoms compound)。 1944年 德国化学家 Schrader等合成了特普、八甲磷和对硫磷等，由于这类化合物杀虫效率高，残 效期短，受到世界各国的广泛重视。 有机磷农药的中毒特征是血液中胆碱酯酶活性下降，由于胆碱酯酶的活性受到抑制， 致使神经系统机能失调，于是一些受神经系统支配的心脏、支气管、肠、胃等脏器
27、发生功 能异常。有机磷农药具有较高的毒性，在环境中有一定残留水平，在生物体内易形成具有 生物活性的轭合残留和结合残留，对人体健康或生 态环境构成潜在威胁，很多国家将乐果、 敌敌畏、对硫磷等有机磷农药确定为环境优先污染物。中国环境监测总站周文敏等根据国 内有机化合物的污染特征，结合国外的文献资料，提出了反映我国环境特征的中国优先污 染物黑名单，其中有机磷农药有敌敌畏、乐果、对硫磷、甲基对硫磷、敌百虫 261。 具有杀虫力强、适用范围广等特点的有机磷农药，在农业病虫害防治中起重要作用， 但同时不可避免地污染了环境，引起生态系统中非靶标生物的中毒和死亡。并通过食物链 与食物网的传递、移动，对整个生态
28、系统结构和功能产生不利影响。对有机磷农药的毒性 已有一些研究，如滕亚娟等报道了敌百虫对三疣梭子蟹幼体的急性毒性，结果表明随着三 疣梭子蟹幼体的发育，其半致死质量浓度以及安全质量浓度呈上升趋势 【 273。丁成曙等研究 了敌百虫对中华绒螯蟹不同生长期幼体的急性毒性，发现中华绒螯蟹蚤状幼体和大眼幼体 呈现出同样的变化趋势，即随着敌百虫浓度的升高，其存活率都呈明显的下降趋势；同时， 随着时间的增加，其半致死浓度也逐渐降低 281。秦文弟等考察了 5种有机磷农药对鱼腥藻 和铜绿微囊藻的急性毒性，结果表明不同有机磷农药对鱼 腥藻和铜绿微囊藻的生长都有不 同程度的影响，鱼腥藻和铜绿微囊藻对不同有机磷农药的
29、敏感性不同 29。 Burkepile等研究 了二嗪农对水环境中的 5种非靶标生物体的影响，发现 5种生物对二嗪农的敏感顺序由强 至 1J弱为：水蚤 (Ceriodaphnia dubia)、 水圣 (Daphnia magna)、 片脚类动物 (ffyaleHa azteca)、 非咬礞黑呆头鱼 Reyes 等考察了二嗪农、 对硫磷和谷硫磷对小奸 (LZtopenaeMs Vflnmwief)的耗氧量的影响，结果发现被这三种有机隣 农药污染的水中虾的耗氧量降低 31I: Sparling等研究了毒死蜱、二嗉农、马拉硫磷以及它 们的氧化衍生物对青蛙幼体的毒性，发现衍生物的毒性比相应的母体物质毒
30、性 要高 10到 100倍 32。 Guzzella等报道了 11种有机磷农药对海洋无脊椎动物切 .和 的的急性毒性，其中毒死蜱是对两种指示生物毒性最大的杀虫剂 331。 Bailey 等评价了毒死蜱和二嗪农以 LC5 混合时对各种水环境 (实验室水、天然水和城市雨水 )中的 水蚤的 联 合 毒 性，结 论 是 毒 死 蜱 和 二 嘆 农 的 混 合 物 表 现 出 加 和 毒 性 作 用 34】。 1.2.3除草剂的毒性研究 除草剂是近 20年来逐渐发展起来的一种农药类型。随着工业的发展，除草剂的品种 也逐渐增多。在一些国家中其产量已超过了杀虫剂而跃居农药工业第一位，据统计，目前 世界范围内
31、除草剂品种已将近 300种 35。除草剂作为农药的重要组成部分，在粮食增产、 提高人民生活水平方面发挥了巨大的作用。但随着除草剂大量地施用，导致了其在食物、 地下水和土壤中的残留，野生动物、家畜和人类的意外中毒和自杀中毒事件也时有发生 , 这些生态环境安全何题越来越引起人们的关注。 自 1956年发现西玛津和草达津的高度除草活性以 来，三嗪类除草剂迅速发展，并成 为现代除草剂中最重要的类型之一，众多品种相继问世并广泛应用，其杀草谱之广，适用 范围之大，在所有除草剂中是首屈一指的。然而，三嗪类除草剂在农田及其它地区的大量 使用过程中引起了一系列危害人类健康及农业生态的问题，造成巨大经济损失 36。三嗪类 化合物是国内外广泛使用的选择性内吸收传导型除草剂，多年来由于作为预防农田杂草生 长除草剂的广泛使用己成为水环境中无处不在的污染物 3738】 ，它们对水生系统中的藻类和 其它初级生物是高毒的 121。三嗪类除草剂日益得到广泛的应用和重视 ，但在应用过程中对 天然水体、土壤和食品等方面有较大的污染，因此三嗪类除草剂对环境的毒性的研究具有 重要的意义。