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1、项目六项目六接种、分离纯化与培养接种、分离纯化与培养学习目标学习目标了解微生物的遗传和变异了解微生物的遗传和变异熟悉微生物保藏的原理和方法熟悉微生物保藏的原理和方法掌握微生物接种、分离与培养的掌握微生物接种、分离与培养的方法方法微生物的遗传和变异微生物的遗传和变异亲代与子代相似亲代与子代相似遗传遗传：变异：变异：亲代与子代、子代间不同亲代与子代、子代间不同个体不完全相同个体不完全相同微生物遗传和变异的物质基础：微生物遗传和变异的物质基础：染色体染色体质粒质粒微生物变异的类型：微生物变异的类型：表型变异表型变异遗传型变异遗传型变异 环境发生变化环境发生变化 DNA DNA发生变化发生变化 暂时暂
2、时 长久长久 可逆可逆 不可逆不可逆 不可遗传不可遗传 可遗传可遗传 微生物变异的原因：微生物变异的原因：突变突变基因基因突变：突变：染色体染色体畸形：畸形：DNADNA链上的一对或少数几对碱链上的一对或少数几对碱基发生置换、插入或丢失引起基发生置换、插入或丢失引起的，是的，是DNADNA小损失。小损失。大段大段DNADNA的缺失、重复、的缺失、重复、倒位、异位和染色体数倒位、异位和染色体数目的改变，是目的改变，是DNADNA大的大的损失损失突变特性：可遗传性、可逆性、稀少性、独立突变特性：可遗传性、可逆性、稀少性、独立性、不对应性、自发性、诱发性性、不对应性、自发性、诱发性微生物变异的原因：
3、微生物变异的原因：基因重组：两个不同微生物个体的基因重组：两个不同微生物个体的基因通过基因通过DNADNA分子的转化、转导、溶分子的转化、转导、溶源转变、接合、原生质融合等方式，源转变、接合、原生质融合等方式，将一个个体的基因转移到另外一个将一个个体的基因转移到另外一个个体的细胞内个体的细胞内，使两个不同细胞基，使两个不同细胞基因重新组合产生出新的因重新组合产生出新的DNADNA分子的过分子的过程程菌种的选育菌种的选育育种育种方法方法自然育种自然育种诱变育种诱变育种杂交育种杂交育种代谢控制育种代谢控制育种基因工程基因工程菌种的衰退、复壮和保藏：菌种的衰退、复壮和保藏：1.1.菌种的衰退菌种的衰
4、退菌落和细胞菌落和细胞形态的改变形态的改变生长缓慢、生长缓慢、产孢子越来越少产孢子越来越少代谢产物生产能力代谢产物生产能力或对寄生能力的下降或对寄生能力的下降衰退的原因衰退的原因（1 1）基因突变）基因突变 菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。当控制产量菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。当控制产量的基因发生负突变，就会引起产量下降；当控制孢子生成的基的基因发生负突变，就会引起产量下降；当控制孢子生成的基因发生负突变，则使菌种产孢子的性能下降等。一般而言，菌因发生负突变，则使菌种产孢子的性能下降等。一般而言，菌种的退化是一个从量变到质变的逐步演变过程。开始时，在群种的退化是一个从量变到质变
5、的逐步演变过程。开始时，在群体中只有个别细胞发生负突变，这时如不及时发现并采用有效体中只有个别细胞发生负突变，这时如不及时发现并采用有效措施，就会造成群体中负突变个体的比例逐渐增高，最后发展措施，就会造成群体中负突变个体的比例逐渐增高，最后发展成为优势群体，从而使整个群体表现出严重的退化现象。因此，成为优势群体，从而使整个群体表现出严重的退化现象。因此，突变在数量上的表现依赖于传代，即菌株处于一定条件下，群突变在数量上的表现依赖于传代，即菌株处于一定条件下，群体多次繁殖，可使退化细胞在数量上逐渐占优势，于是退化性体多次繁殖，可使退化细胞在数量上逐渐占优势，于是退化性状的表现就更加明显，逐渐成为
6、一株退化了的菌体。状的表现就更加明显，逐渐成为一株退化了的菌体。（2 2）分离现象）分离现象 通通过过遗遗传传育育种种获获得得的的多多核核（或或是是单单核核）菌菌种种，由由于于其其DNADNA双双链链中中仅仅一一条条单单链链发发生生突突变变，随随着着传传代代，其其生生产产性性状状也也将将发发生生退退化化。这这种种退退化化是是由由于于诱诱变变获获得得的的高高产产菌菌株株本本身身不不纯纯，高高产产突突变变只只发发生生在在一一个个核核和和一一条条DNADNA单单链链上上，随随着着细细胞胞分分裂裂，核核发发生生分分离离，因因而而突突变变基基因因与与未未突突变变基基因因发发生生分分离离，于于是是就就出出
7、现现了了突突变变的的高高产产菌菌株株和和未未突突变变的的低低产产菌株。菌株。（3 3）环境条件）环境条件 环环境境条条件件是是影影响响菌菌种种退退化化的的一一个个重重要要原原因因。如如培培养养条条件件对对菌菌种种退退化化的的影影响响，可可用用糖糖化化酶酶产产生生菌菌泡泡盛盛曲曲霉霉来来说说明明。泡泡盛盛曲曲霉霉经经诱诱变变得得到到的的突突变变株株，在在3 3种种不不同同培培养养基基上上连连续续传传代代1010次次，发发现现不不同同培培养养基基和和传传代代次次数数对对淀淀粉粉葡葡萄萄糖糖苷苷酶酶的的产产量量有有不不同同影影响响。环环境境温温度度也也是是影影响响菌菌种种退退化化的的重重要要因因素素
8、，例例如如，温温度度高高，基基因因突突变变率率也也高高；温温度度低低，则则突突变变率率也也低低，因因此此菌菌种种保保藏藏的的重重要要措措施施就是低温。就是低温。防止衰退防止衰退的方法的方法控制传代的次数控制传代的次数创造良好的培养条件创造良好的培养条件合理的育种合理的育种 （1 1）合理的育种）合理的育种 选选育育菌菌种种时时，应应尽尽可可能能使使用用孢孢子子或或单单核核菌菌株株，避避免免使使用用多多核核细细胞胞；合合理理选选择择诱诱变变剂剂的的种种类类和和剂剂量量，以以减减少少分分离离回回复复现现象象的的发发生生；同同时时，在在诱诱变变处处理理后后进进行行充充分分的的后后培培养养及及分分离离
9、纯纯化化，以以保保证证所所获获得得的的保保藏藏菌菌种种的的纯纯度度。这这些些可可有有效效地防止菌种的退化。地防止菌种的退化。（2 2）选择适合菌种生长的培养条件和外界环境）选择适合菌种生长的培养条件和外界环境 菌菌种种培培养养基基的的培培养养条条件件应应适适宜宜，才才能能使使菌菌种种生生长长健健壮壮，减减少少退退化化的的发发生生。营营养养不不足足和和过过于于丰丰富富对对菌菌种种生生长长均均不不利利。栖栖土土曲曲霉霉3.9423.942在在培培养养时时，发发现现培培养养温温度度从从28283030提提高高到到33333434，可可防防止它产孢子能力的退化。止它产孢子能力的退化。此此外外，由由于于
10、微微生生物物生生长长过过程程积积累累的的有有害害代代谢谢产产物物，也也会会引引起起菌菌种种退退化化，故故不不应应使使用用陈陈旧旧的的培养物作为种子培养。培养物作为种子培养。（3 3）控制传代次数）控制传代次数 由由于于微微生生物物存存在在着着自自发发突突变变，而而突突变变都都是是在在繁繁殖殖过过程程中中发发生生而而表表现现出出来来的的，所所以以应应尽尽量量避避免免不不必必要要的的移移种种和和传传代代，并并将将必必要要的的传传代代降降低低到到最最低低限限度度，以以减减少少发发生生自自发发突突变变的的几几率率。菌菌种种传传代代次次数数越越多多，产产生生突突变变的的几几率率就就越越高高，因因而而菌菌
11、种种发发生生退退化化的的机机会会就就越越多多。对对于于生生产产菌菌种种，要要尽尽可可能能利利用用它它们们的的有有效效保保藏藏期期，可可以以采采取取一一次次接接种种足足够够数数量量的的原原种种进进行保藏，在整个保藏期内使用同一批原种。行保藏，在整个保藏期内使用同一批原种。（4 4）采用有效的菌种保藏方法）采用有效的菌种保藏方法 用用于于工工业业生生产产的的一一些些微微生生物物菌菌种种，其其主主要要性性状状都都属属于于数数量量性性状状，而而这这类类性性状状恰恰好好是是最最容容易易退退化化的的。因因此此，在在实实验验室室或或生生产产上上，选选用用合合适适的的菌菌种保藏方法也可以有效防止菌种的退化。种
12、保藏方法也可以有效防止菌种的退化。（5 5）对对菌菌种种可可能能遭遭受受病病毒毒的的感感染染应应保保持持足足够够的警惕的警惕 对对有有疑疑问问的的菌菌种种要要及及时时检检验验，确确定定已已感感染染病病毒毒，尤尤其其是是病病毒毒粒粒子子含含量量大大，菌菌丝丝体体及及子子实实体体性性状已受到严重影响的菌种，应及时淘汰。状已受到严重影响的菌种，应及时淘汰。退化菌种的复壮退化菌种的复壮 菌菌种种退退化化是是指指群群体体中中退退化化细细胞胞在在数数量量上上占占一一定定优优势势后后，所所表表现现出出群群体体性性能能变变劣劣的的现现象象。因因此此，在在已已经经退退化化的的群群体体中，仍有一定数量尚未退化的个
13、体。中，仍有一定数量尚未退化的个体。狭狭义义的的复复壮壮是是指指在在菌菌种种已已经经发发生生退退化化的的情情况况下下，通通过过纯纯种种分分离离和和筛筛选选，从从已已经经退退化化的的群群体体中中筛筛选选出出尚尚未未退退化化的的个个体体，以以达达到到恢恢复复菌菌种种的的原原有有典典型型性性状状的的措措施施。而而广广义义的的复复壮壮是是在在菌菌种种的的典典型型特特征征或或生生产产性性状状未未退退化化前前，就就经经常常而而有有意意识识地地进进行行纯纯种种分分离离和和生生产产性性能能的的测测定定工工作作，以以期期从从中中选选择择到到自自发发的的正正突突变变个个体体。由由此此可可见见，狭狭义义的的复复壮壮
14、是是一一种种消消极极的的措措施施，而而广广义义的的复复壮壮才才是是一一种种积积极极的的措措施施。具具体体的的菌种的复壮措施如下：菌种的复壮措施如下：复壮方法复壮方法纯种纯种分离分离粗放型：菌落纯粗放型：菌落纯精细型：细胞纯精细型：细胞纯通过寄主体进行复壮通过寄主体进行复壮淘汰已衰退的个体淘汰已衰退的个体1 1纯种分离法纯种分离法 纯种分离法是指通过纯种分离和性能纯种分离法是指通过纯种分离和性能测定，从已经退化的菌种群体中把仍保持测定，从已经退化的菌种群体中把仍保持原有原有典型优良性状的个体分离出来典型优良性状的个体分离出来。在进。在进行纯种分离前，可将待分离的退化菌种先行纯种分离前，可将待分离
15、的退化菌种先接触一些恶劣环境，如药物、低温、高温接触一些恶劣环境，如药物、低温、高温等，往往可以起到等，往往可以起到淘汰生活力弱、留下强淘汰生活力弱、留下强壮菌株的作用壮菌株的作用，因而能提高纯种分离的效，因而能提高纯种分离的效果。果。2 2通过宿主进行复壮通过宿主进行复壮 对对于于一一些些寄寄生生型型微微生生物物，特特别别是是一一些些病病原原菌菌，长长期期在在实实验验室室人人工工培培养养会会发发生生致致病病力力降降低低的的退退化化。可可将将退退化化菌菌株株接接种种到到相相应应宿宿主主体体内内以以提提高高菌菌株株的的活活力。力。3 3淘汰已退化的个体淘汰已退化的个体 有有人人发发现现，若若对对
16、细细黄黄链链霉霉菌菌“54065406”农农用用抗抗生生素素的的分分生生孢孢子子采采用用-10-10-30-30的的低低温温处处理理5 57d7d，使使其其死死亡亡率率达达到到80%80%左左右右。结结果果会会在在抗抗低低温温的的存存活活个个体体中中留留下下未未退退化化的的个个体体，从从而而达达到到了了复复壮壮的的效效果。果。菌种保藏菌种保藏原理：原理：根据不同菌种的生理、生化特点，根据不同菌种的生理、生化特点，创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态方法：方法：首先要挑选优良纯种、休眠体，其首先要挑选优良纯种、休眠体，其次创造良好的环境条件（干燥、低温、缺次创
17、造良好的环境条件（干燥、低温、缺氧、缺乏营养、添加保护剂、酸度中和剂）氧、缺乏营养、添加保护剂、酸度中和剂）菌种保藏的方法很多，一般有下面几种：菌种保藏的方法很多，一般有下面几种：A A 斜面冰箱保藏法（酵母）斜面冰箱保藏法（酵母）斜斜面面保保藏藏是是一一种种短短期期、过过渡渡的的保保藏藏方方法法，用用新新鲜鲜斜斜面面接接种种后后，置置最最适适条条件件下下培培养养到到菌菌体体或或孢孢子子生生长长丰丰满满后后，放放在在44冰箱保存。一般保存期为三个月到六个月。冰箱保存。一般保存期为三个月到六个月。B B 石蜡油封存法（酵母）石蜡油封存法（酵母）向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，向培
18、养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。存期约一年左右。三、菌种保藏的方法C C 沙土管保藏法（细菌，霉菌，防线菌沙土管保藏法（细菌，霉菌，防线菌 ）这是国内常采用的一种方法。适合于产孢子或这是国内常采用的一种方法。适合于产孢子或芽孢的微生物。它的制备方法是：芽孢的微生物。它的制备方法是：首首先先，将将沙沙与与土土洗洗净净烘烘干干过过筛筛后后，按按沙沙与与土土的
19、的比比例例为为l l2l2l混混合合均均匀匀，分分装装于于小小试试管管中中，装装料料高高度度约约为为1 1厘厘米米左左右右，121121C C间间歇歇灭灭菌菌三三次次，灭灭菌菌试试验验合合格格后后烘烘干干备备用用。一一般般沙沙用用8080目目过过筛筛，土土用用3030100100目目过过筛筛。其其次次，将将斜斜面面孢孢子子制制成成孢孢子子悬悬浮浮液液接接入入沙沙土土管管中中或或将将斜斜面面孢孢子子刮刮下下直直接接与与沙沙土土混混合合，于于干干燥燥器器中中用用真真空空泵泵抽抽干干，放放在在冰冰箱箱内内保保存存。一一般般保保存存期期为为1 1年年左左右。右。D真空冷冻干燥保藏法（真空冷冻干燥保藏法
20、（细菌，防线菌）真空冷冻干燥保藏法是目前常用的较理想的一种方法。其基本真空冷冻干燥保藏法是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低的温度下（原理是在较低的温度下（1515），快速将细胞冻结，并且保），快速将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，微持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。因此，菌种可以保存很长时间，因此，菌种可以保存很长时间，一般一般5 5年左右年左右。这种保藏方法。这种保藏方法虽然需要一定的设备，要求亦比较严格，但由于该方法保藏效虽然需要一定的设
21、备，要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种微生物都适用。所以，国内外都已较普遍地应用。果好，对各种微生物都适用。所以，国内外都已较普遍地应用。这种方法的基本操作过程是先将微生物这种方法的基本操作过程是先将微生物制成悬浮液，制成悬浮液，再与保护再与保护剂混合，然后放在特制的安瓶管内，用低温酒精或干冰，使其剂混合，然后放在特制的安瓶管内，用低温酒精或干冰，使其迅速冻结，在低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔封，迅速冻结，在低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔封，并低温保藏。并低温保藏。保护剂一般采用脱脂牛奶或血清。保护剂一般采用脱脂牛奶或血清。保护剂的作用可能是在冷冻保护剂的作用可能是
22、在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分（细胞膜）的构干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分（细胞膜）的构型，防此细胞膜因为冻结而破坏。型，防此细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用，保护剂还可以起支持作用，使微生物疏松地固定在上面。使微生物疏松地固定在上面。E E 液氮超低温保藏法（细菌，真菌）液氮超低温保藏法（细菌，真菌）液液氮氮超超低低温温保保臧臧法法足足近近几几年年才才发发展展起起来来的的，此此法法国国外外已已较较普普遍遍采采用用，是是适适用用范范围围最最广广的的微微生生物物保保藏藏法法。尤尤其其是是一一些些不不产产孢孢子子的的菌菌丝丝体体，用用其其它它保保藏藏方方法法不
23、理想，可用液氮保藏法。其保存期最长。不理想，可用液氮保藏法。其保存期最长。a a 原理原理 用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达一可达一196196，远远低于其新陈代谢作用停止的温度，远远低于其新陈代谢作用停止的温度（一（一130130），所以此时菌种的代谢活动已停止，化），所以此时菌种的代谢活动已停止，化学作用亦随之消失。学作用亦随之消失。b b 操作方法及步骤操作方法及步骤（1 1）安安瓿瓿管管要要求求 由由于于液液氮氮保保存存于于超超低低温温状状态态，所所使使用用的的安安瓿瓿管管需需能能承承受受大大的的温温差差而而不不致致于于破破裂裂，一一
24、般般用用9595料料或或GCl7GCl7的的玻玻璃璃管管，安安瓿瓿管管选选好好后后印印上上标标记记，加加棉棉塞后灭菌，烘干后备用。塞后灭菌，烘干后备用。（2 2）菌种准备及分装菌种准备及分装 因为液氮法菌种要经受超低温因为液氮法菌种要经受超低温的冷冻过程。所以也需要保护剂，常用的保护剂为的冷冻过程。所以也需要保护剂，常用的保护剂为1010甘油。用保护剂制备好菌液后，加入准备好的安瓶甘油。用保护剂制备好菌液后，加入准备好的安瓶管中，一般安瓿管的装量为管中，一般安瓿管的装量为0.20.21mL1mL。（3 3）冻冻结结 液液氮氮法法的的关关键键是是先先把把微微生生物物从从常常温温过过渡渡到到低低温
25、温。这这样样在在细细胞胞接接触触低低温温前前，使使细细胞胞内内自自由由水水通通过过膜膜渗渗出出而而不不使使其其遇遇冷形成冰晶而伤害细胞。冷形成冰晶而伤害细胞。美美国国 ATCCATCC采采用用先先将将菌菌液液降降温温到到00，再再以以每每分分钟钟降降低低11的的速速度度，一一直直降降低低到到3838，然然后后才才把把装装有有菌菌液液的的安安瓿瓿管管放放入入液液氮氮罐罐的的气气相相中中。由由于于液液氮氮要要蒸蒸发发，这这样样温温度度就就会会上上升升，冰冰晶晶状状态态发发生生变变化化，从从而而导导致致菌菌种种死死亡亡。所所以以要要常常常常注注意意液液氮氮的残存量，定期补加。的残存量，定期补加。（4
26、 4）重新培养）重新培养 当要使用或检查所保存的菌种时，可将安瓿管当要使用或检查所保存的菌种时，可将安瓿管从冰箱中取出，室温或从冰箱中取出，室温或35354040水浴中迅速解冻，当升温至水浴中迅速解冻，当升温至00时即可打开安瓿管，将菌种移到适宜的培养基斜面上培养。时即可打开安瓿管，将菌种移到适宜的培养基斜面上培养。我国国内目前已有部分单位采用液氮法保存菌种。我国国内目前已有部分单位采用液氮法保存菌种。保藏方保藏方法法主要原主要原理理设备条件设备条件适宜菌适宜菌种种保藏保藏期期特点特点斜面低斜面低温保藏温保藏法法低温低温44冰箱冰箱各大类各大类3636个月个月简便、短时、易污简便、短时、易污染
27、退化染退化液体石液体石蜡保藏蜡保藏法法低温、低温、缺氧缺氧44冰箱、冰箱、无菌石蜡无菌石蜡油油各大类各大类1212年年简便、短时、需直简便、短时、需直立放置立放置砂土保砂土保藏法藏法低温、低温、干燥干燥 、缺营养缺营养44冰箱或冰箱或室温室温产孢子产孢子类类110110年年简便有效、较长时，简便有效、较长时，易退化变异易退化变异冷冻干冷冻干燥保藏燥保藏法法低温、低温、干燥、干燥、缺氧缺氧保护剂、保护剂、整套冷冻整套冷冻设备设备各大类各大类515515年年长时高效、繁杂技长时高效、繁杂技术要求高术要求高斜面培养基接种法斜面培养基接种法原理：主要用于接种纯菌，使其增殖后用原理：主要用于接种纯菌，使
28、其增殖后用于鉴定或保存菌种，可以挑取平板培养基于鉴定或保存菌种，可以挑取平板培养基上的纯培养物上的纯培养物或挑取斜面、肉汤中的纯或挑取斜面、肉汤中的纯培养物按无菌操作的要求接种到斜面培养培养物按无菌操作的要求接种到斜面培养基上，是进行菌种扩大培养、菌种保藏等基上，是进行菌种扩大培养、菌种保藏等任务的最常用的方法。任务的最常用的方法。操作步骤操作步骤物品清点物品清点与摆放与摆放超净工作台超净工作台的消毒的消毒手消毒手消毒接种接种琼脂平板划线分离法琼脂平板划线分离法基本原理基本原理A 平板分离法普遍用于微生物的分离与纯平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化化B 微生物在固体培养基上生长形成的单个微生
29、物在固体培养基上生长形成的单个菌落是由一个细胞繁殖而成的集合体，通菌落是由一个细胞繁殖而成的集合体，通过在平板上划线可得到单个菌落，因此，过在平板上划线可得到单个菌落，因此，可通过挑取但菌落而获得一种纯培养物可通过挑取但菌落而获得一种纯培养物操作步骤操作步骤融化培养基融化培养基倒平板倒平板做分区标记做分区标记分区划线操作分区划线操作恒温培养恒温培养挑取挑取菌落菌落清理清理涂布分离法涂布分离法基本原理基本原理涂布分离法是指取少许梯度稀释菌悬液，涂布分离法是指取少许梯度稀释菌悬液，置于已凝固的无菌平板培养基表面，然后置于已凝固的无菌平板培养基表面，然后用无菌涂布器把军也均匀地涂布在整个平用无菌涂布器把军也均匀地涂布在整个平板表面，禁培养或，在平板培养基表面会板表面，禁培养或，在平板培养基表面会形成多个独立分布的单菌落，然后挑取典形成多个独立分布的单菌落，然后挑取典型的代表移至斜面，经培养后保存型的代表移至斜面，经培养后保存适合好氧菌或有气生菌丝的放线菌的分离适合好氧菌或有气生菌丝的放线菌的分离与计数与计数操作步骤操作步骤倒平板倒平板菌液稀释菌液稀释涂布平板涂布平板平板培养平板培养挑取单挑取单菌落菌落滴加菌液滴加菌液