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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 微生物的接种、分别纯化与培育方法试验目的： 学习把握无菌操作技术；学习接种方法； 学习常用的分别、 纯化菌种的方法；实验内容：一、接种将微生物接到适于它生长繁衍的人工培育基上或活的生物体内的过程叫做接种；、接种工具和方法在试验室或工厂实践中,用得最多的接种工具是接种环、接种针；由于接种要求或方法的不同,接种针的针尖部常做成不同的外形,有刀形、耙形等之分；有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种；在固体培育基表面要将菌液匀称涂布时,需要用到涂布棒；（图）图 接种和分别工具1接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄
2、 8.小解剖刀常用的接种方法有以下几种：）划线接种 这是最常用的接种方法；即在固体培育基表面作来回直线形的移动,就可达到接种的作用；常用的接种工具有接种环,接种针等；在斜面接种和平板划线中就常用此法； ）三点接种 在讨论霉菌外形经常用此法；此法即把少量的微生物接种在平板表面上,成等边三角形的三点,让它各自独立形成菌落后,来观看、讨论它们的外形；除三点外,也有一点或多点进行接种的；）穿刺接种 在保藏厌氧菌种或讨论微生物的动力经常采纳此法；做穿刺接种时,用的接种工具是接种针； 用的培育基一般是半固体培育基；它的做法是： 用接种针蘸取少量的菌种,沿半固体培育基中心向管底作直线穿刺,如某细菌具有鞭毛而
3、能运动,就在穿刺线四周能够生长；）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培育皿中,然后再倒入冷却至45C左右的固体培育基,快速轻轻摇匀,这样菌液就达到稀释的目的；待平板凝固之后,置合适温度下培育,就可长出单个的微生物菌落；）涂布接种 与浇混接种略有不同,就是先倒好平板,让其凝固,然后再将菌液倒入平板上面, 快速用涂布棒在表面作来回左右的涂布,让菌液匀称分布,就可长出单个的微生物的菌落；）液体接种 从固体培育基中将菌洗下,倒入液体培育基中,或者从液体培育物中,用移液管将菌液接至液体培育基中,或从液体培育物中将菌液移至固体培育基中,都可称为液体接种；名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页,
4、共 5 页精选学习资料 - - - - - - - - - ）注射接种 该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内,如人或其它动物中,常见的疫苗预防接种,就是用注射接种, 接入人体, 来预防某些疾病；）活体接种 活体接种是特地用于培育病毒或其它病原微生物的一种方法,由于病毒必需接种于活的生物体内才能生长繁衍；所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织,例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚；接种的方式是注射,也可以是拌料喂养；、无菌操作培育基经高压灭菌后,用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培育基上,这个过程叫做无菌接种操作；在试验室检
5、验中的各种接种必需是无菌操作；试验台面不论是什么材料,一律要求光滑、水平；光滑是便于用消毒剂擦洗；水平是倒琼脂培育基时利于培育皿内平板的厚度保持一样；在试验台上方, 空气流淌应缓慢,杂菌应尽量削减,其四周杂菌也应越少越好；为此,必需清扫室内,关闭试验室的门窗,并用消毒剂进行空气消毒处理,尽可能地削减杂菌的数量；空气中的杂菌在气流小的情形下,随着灰尘落下,所以接种时,打开培育皿的时间应尽量短；用于接种的器具必需经干热或火焰等灭菌；接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上充分烧红 （接种柄, 一边转动一边渐渐地来回通过火焰三次）,冷却,先接触一下培育基,待接种环冷却到室温后,方可用它来挑取含菌材料
6、或菌体,快速地接种到新的培育基上； （图）然后,将接种环从柄部至环端逐步通过火焰灭菌,复原；不要直接烧环,以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间；平板接种时, 通常把平板的面倾斜,把培育皿的盖打开一小部分进行接种；在向培育皿内倒培育基或接种时,试管口或瓶壁外面不要接触底皿边,试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过；二、分别纯化含有一种以上的微生物培育物称为混和培育物（胞均来自于一个亲代细胞,那么这个菌落称为纯培育（Mixed culture ）；假如在一个菌落中全部细 Pure culture ）；在进行菌种鉴定时,所用的微生物一般均要求为纯的培育物；得到纯培育的过程称为分别纯化,方法有很多 种；
7、、倾注平板法名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页,共 5 页精选学习资料 - - - - - - - - - 第一把微生物悬液通过一系列稀释,取肯定量的稀释液与熔化好的保持在 4050 左右的养分琼脂培育基充分混合,然后把这混合液倾注到无菌的培育皿中,待凝固之后, 把这平板倒置在恒箱中培育；单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落,取单个菌落制成悬液,重复上述步骤数次,便可得到纯培育物；（图,a）图 倾注平板法（ a）涂布平板法（b）图解 1.菌悬液 2.熔化的培育基 3.培育物 4.无菌水图 倾注平板法（ a）涂布平板法（b）图解 1.菌悬液 2.熔化的培育基 3.培育物 4.无菌水
8、、涂布平板法第一把微生物悬液通过适当的稀释,取肯定量的稀释液放在无菌的已经凝固的养分琼脂平板上,然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液匀称地涂布在培育基表面上,单个菌落；（图, b） 、平板划线法经恒温培育便可以得到最简洁的分别微生物的方法是平板划线法；用无菌的接种环取培育物少许在平板上进行划 线；划线的方法很多, 常见的比较简洁显现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等； （图）当接种环在培育基表面上往后移动时,接种环上的菌液逐 渐稀释,最终在所划的线上分散着单个细胞,经培育,每一个细胞长成一个菌落；（图） 、富集培育法富集培育法的方法和原理特别简洁；我们可以制造一些条件只让所需
9、的微生物生长,在这些条件下, 所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争,微生物；所制造的条件包括挑选最适的碳源、能源、温度、光、在生长才能方面远远超过其他 pH、渗透压和氢受体等；在相同的培育基和培育条件下,经过多次重复移种,最终富集的菌株很简洁在固体培育基上长出单菌落；假如要分别一些专性寄生菌,就必需把样品接种到相应敏锐宿主细胞群体中,使其大量生长；通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌；名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页,共 5 页精选学习资料 - - - - - - - - - 、厌氧法在试验室中,为了分别某些厌氧菌,可以利用装有原培育基的试管作为培育容器,把这支试管放在
10、沸水0 浴中加热数分钟, 以便逐出培育基中的溶解氧；然后快速冷却, 并进行接种；接种后,加入无菌的石蜡于培育基表面,使培育基与空气隔绝；另一种方法是,在接种后,利用 N2 或 CO2取代培育基中的气体,然后在火焰上把试管口密封；有时为了更有效地分别某些厌氧菌, 可以把所分别的样品接种于培育基上,养装置中；三、培育然后再把培育皿放在完全密封的厌氧培微生物的生长,除了受本身的遗传特性打算外,仍受到很多外界因素的影响,如养分物浓 度、温度、水分、氧气、等；微生物的种类不同,培育的方式和条件也不尽相同；、影响微生物生长的因素微生物的生长,除了受本身的遗传特性打算外,仍受到外界很多因素的影响；影响微生物
11、 生长的因素很多,简要介绍如下； 1 养分物浓度细菌的生长率与养分物的浓度有关 典型的双曲线；: = max*C/K+C 养分物浓度与生长率的关系曲线是 K 值是细菌生长的很基本的特性常数；它的数值很小,说明细菌所需要的养分浓度特别之低,所以在自然界中,它们处处生长；然而养分太低时,细菌生长就会遇到困难,甚至仍会死亡； 这是由于除了生长需要能量以外,细菌仍需要能量来维护它的生存；这种能量称为维持能；另一方面,随着养分物浓度的增加,生长率愈接近最大值；）温度在肯定的温度范畴内,每种微生物都有自已的生长温度三基点：最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度；在生长温度三基点内,只有处于最适生长温度时
12、,生长速度才最快,微生物都能生长,但生长速率不一样；微生物 代时最短； 超过最低生长温度,微生物不会生长,温度太低,甚至会死亡；超过最高生长温度,微生物也要停止生长,温度过高；也会死名师归纳总结 亡；一般情形下, 每种微生物的生长温度三基点是恒定的；但也常受其它环境条件的影响而第 4 页,共 5 页发生变化；依据微生物最适生长温度的不同,可将它们分为三个类型： a.嗜冷微生物：其是适生长温度多数在-10 20之间 b.中温微生物：其最适生长温度一般在20 45之间 c.嗜热微生物：生长温度在45以上；- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - ）水分水分是微生物
13、进行生长的必要条件；芽孢、孢子萌发,第一需要水分；微生物是不能脱离水而生存的； 但是微生物只能在水溶液中生长,而不能生活在纯水中；各种微生物在不能生长发育的水分活性范畴内,均具有狭小的适当的水分活性区域；）氧气依据微生物对氧气的需要情形,可将它们分为以下五个类型； a.需氧微生物这类微生物需要氧气供呼吸之用；没有氧气,便不能生长,但是高浓度的氧气对需氧微生物也是有毒的； 很多需氧微生物不能在氧气浓度大于大气中氧气浓度的条件下生长；绝大多数微生物都属于这个类型； b.兼性需氧微生物这类微生物在有氧气存在或无氧气存在情形下,都能生长,只不过所进行的代谢途径不同罢了；在无氧气存在的条件下,它进行发酵
14、作用,例如酵母菌的无氧乙醇发酵； c.微量需氧微生物这类菌是需要氧气的,但只在0.2 大气压下生长最好；这可能是由一它们含有在强氧化条件下失活的酶,因而只有在低压下作用； d.耐氧微生物这类微生物在生长过程中,不需要氧气,但也不怕氧气存在,不会被氧气所杀死； c.厌氧微生物这类微生物在生长过程中,不需要分子氧； 分子氧存在对它们生长产生毒害,不是被抑制,就是被杀死；、培育方法1）依据培育时是否需要氧气,可分为好氧培育和厌氧培育两大类；好氧培育：也称“ 好气培育”；就是说这种微生物在培育时,需要有氧气加入,否就就不能生长良好； 在试验室中, 斜面培育是通过棉花塞从外界获得无菌的空气；三角烧瓶液体
15、培育多数是通过摇床振荡,使外界的空气源源不断地进入瓶中；厌氧培育：也称“ 厌气培育”；这类微生物在培育时,不需要氧气参与；在厌氧微生物的培育过程中,最重要的一点就是要除去培育基中的氧气；一般可采纳以下几种方法： a.降低培育基中的氧化仍原电位：常将仍原剂如谷胱甘肽、硫基醋酸盐等,加入到培育基中,便可达到目的； 有的将一些动物的死的或活的组织如牛心、羊脑加入到培育基中,也可适合厌氧菌的生长； b.化合去氧：这也有很多方法,主要有：用焦性没食子酸吸取氧气；用磷吸取氧气；用好氧菌与厌氧混合培育吸取氧气；用植物组织如发芽的种子吸取氧气；用产生氢气与氧化合的方法除氧； c.隔绝阻氧：深层液体培育；用石蜡油封存；半固体穿刺培育； d.替代驱氧 用二氧气碳驱代氧气；用氮气驱代氧气；用真空驱代氧气；用氢气驱代氧气；用混和气体驱代氧气；）依据培育基的物理状态,可分为固体培育和液体培育两大类；固质培育：是将菌种接至疏松而富有养分的固体培育基中,在合适的条件下进行微生物培养的方法；液体培育：在试验中,通过液体培育可以使微生物快速繁衍,获得大量的培育物,在肯定条件下,仍是微生物挑选增菌的有效方法；名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页,共 5 页