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1、实验六实验六微生物的分离纯化与接种技术微生物的分离纯化与接种技术一、实验目的一、实验目的1.掌握常用接种工具的使用掌握常用接种工具的使用2.掌握斜面培养基、液体培养基接种法掌握斜面培养基、液体培养基接种法3.掌握倒平板技掌握倒平板技术4.掌握各种分离掌握各种分离单菌落的技菌落的技术二、实验原理二、实验原理接种是微生物实验及科研的一项最基本的操作技接种是微生物实验及科研的一项最基本的操作技术，是将一种微生物移接到灭过菌的新培养基的术，是将一种微生物移接到灭过菌的新培养基的过程。接种方法有斜面接种、液体接种、平板接过程。接种方法有斜面接种、液体接种、平板接种、穿刺接种等。在接种过程中，为了确保纯种
2、种、穿刺接种等。在接种过程中，为了确保纯种不被杂菌污染，必须采用严格的无菌操作。不被杂菌污染，必须采用严格的无菌操作。从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。离法普遍用于微生物的分离与纯化。微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落通常微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单菌落可用稀取单菌落而获得一种纯培养。获取单菌落可用
3、稀释平板法、划线分离法等。释平板法、划线分离法等。三、实验器材及试剂三、实验器材及试剂接种环、酒精灯、试管、移液管、培养皿、接种环、酒精灯、试管、移液管、培养皿、涂布棒、营养琼脂培养基、营养肉汤培养涂布棒、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、生理盐水、大肠杆菌菌液。基、生理盐水、大肠杆菌菌液。四、实验步骤四、实验步骤1.1.接种环的使用接种环的使用接种环是用铂丝或细电炉丝制成的，使用接种环是用铂丝或细电炉丝制成的，使用前后前后都要用酒精灯都要用酒精灯外焰外焰严格灭菌。严格灭菌。接种环的灭菌方法接种环的灭菌方法 四、实验步骤四、实验步骤2.斜面接种斜面接种（每人接种（每人接种2支试管斜面，支试管斜面
4、，1支斜面接支斜面接斜面，斜面，1支液体接斜面）支液体接斜面）将菌种管（若是液体菌种应先摇匀）与空白斜面培养基管将菌种管（若是液体菌种应先摇匀）与空白斜面培养基管握在左手大拇指和其他四指之间，菌种管位于上侧，培养握在左手大拇指和其他四指之间，菌种管位于上侧，培养基管位于下侧，斜面均向上。基管位于下侧，斜面均向上。右手持接种环火焰灭菌。以右手掌心、小指和无名指同时右手持接种环火焰灭菌。以右手掌心、小指和无名指同时夹取两管口的棉塞，将两试管口迅速通过火焰灭菌。夹取两管口的棉塞，将两试管口迅速通过火焰灭菌。在火焰附近，用灭菌的接种环从菌种管挑取少量菌苔或一在火焰附近，用灭菌的接种环从菌种管挑取少量菌
5、苔或一环菌液，伸进待接种的培养基管斜面底部，环菌液，伸进待接种的培养基管斜面底部，向上向上“Z”形形划线划线。接种时。接种时不要划破培养基表面，沾菌的接种环进出试不要划破培养基表面，沾菌的接种环进出试管时不应触及试管口管时不应触及试管口。接种完后灼烧管口，塞上棉塞。灼烧接种环，放回原处。接种完后灼烧管口，塞上棉塞。灼烧接种环，放回原处。将接种好的试管斜面放到将接种好的试管斜面放到37培养箱中培养培养箱中培养24h后观察结后观察结果。果。斜面接种示意图斜面接种示意图3.液体接种液体接种（每人接种（每人接种2支液体试管，支液体试管，1支斜面支斜面接液体，接液体，1支液体接液体）支液体接液体）操作方
6、法与前相同，但要使试管口向上斜，以免操作方法与前相同，但要使试管口向上斜，以免培养基流出。培养基流出。接入菌体后，使接种环和管内壁摩擦几下以利洗接入菌体后，使接种环和管内壁摩擦几下以利洗下环上菌体，接种后塞好棉塞将试管在手掌中轻下环上菌体，接种后塞好棉塞将试管在手掌中轻轻敲打，使菌体充分分散。轻敲打，使菌体充分分散。将接种好的试管斜面放到将接种好的试管斜面放到37培养箱中培养培养箱中培养24h后观察结果。后观察结果。四、实验步骤四、实验步骤四、实验步骤四、实验步骤4.倒平板倒平板（每组倒（每组倒6或或8块营养琼脂平板）块营养琼脂平板）（1）熔化培养基：电炉加热熔化）熔化培养基：电炉加热熔化12
7、0mL（或（或160mL）那瓶）那瓶营养琼脂培养基营养琼脂培养基（电炉加热时（电炉加热时人要在旁边看着，防止培养基爆沸！）人要在旁边看着，防止培养基爆沸！）。（2）倒平板：待培养基冷却到）倒平板：待培养基冷却到50左右（用左右（用手抓瓶子不烫手）后，取无菌培养皿，每皿手抓瓶子不烫手）后，取无菌培养皿，每皿倒入倒入1520mL培养基（自然铺满整个底面培养基（自然铺满整个底面为准），等凝固后备用。为准），等凝固后备用。四、实验步骤四、实验步骤四、实验步骤四、实验步骤5.琼脂平板划线分离法琼脂平板划线分离法琼脂平板划线分离的方法一般有连续划线分琼脂平板划线分离的方法一般有连续划线分离法和分区划线分离
8、法。离法和分区划线分离法。（1）连续划线分离法）连续划线分离法（每人划（每人划1块营养琼脂块营养琼脂平板）平板）a.灭菌接种环，冷却后取适量混匀的菌液。灭菌接种环，冷却后取适量混匀的菌液。b.在培养基表面连续在培养基表面连续“之之”字形划线字形划线，直至划，直至划完整个平板表面。完整个平板表面。四、实验步骤四、实验步骤连续划线法连续划线法四、实验步骤四、实验步骤（2）分区划线分离法）分区划线分离法（每人划（每人划1块营养琼脂平板）块营养琼脂平板）a.灭菌接种环。灭菌接种环。b.冷却后，蘸取少许混匀的菌液，划线于平板培养基冷却后，蘸取少许混匀的菌液，划线于平板培养基表面表面a处。处。c.再将接种
9、环灭菌。再将接种环灭菌。d.冷却后，从冷却后，从a处将菌划出至处将菌划出至b处。处。e.接种环再次灭菌。接种环再次灭菌。f.从从b处划出至处划出至c处。处。g.再次灭菌接种环。再次灭菌接种环。h.从从c处划出至处划出至d处。处。i.将平皿倒置于将平皿倒置于37培养箱中培养培养箱中培养24h后观察结果。后观察结果。四、实验步骤四、实验步骤分区划线法分区划线法第一区划线第一区划线灭菌接种环灭菌接种环第二区划线第二区划线灭菌接种环灭菌接种环第三区划线第三区划线灭菌接种环灭菌接种环灭菌接种环灭菌接种环四、实验步骤四、实验步骤四、实验步骤四、实验步骤6.稀释涂布法稀释涂布法（每组稀释（每组稀释10-2，
10、10-3，10-4稀释稀释度菌液各涂布度菌液各涂布1块平板）块平板）（1）倒平板：电炉加热熔化）倒平板：电炉加热熔化其中一瓶其中一瓶60 mL营养营养琼脂培养基。待培养基冷却到琼脂培养基。待培养基冷却到50左右（用手抓左右（用手抓瓶子不烫手）后，取瓶子不烫手）后，取3个无菌培养皿，每皿倒入个无菌培养皿，每皿倒入1520mL培养基（自然铺满整个底面为准），培养基（自然铺满整个底面为准），等凝固后备用。等凝固后备用。（2）取）取4支装有支装有9mL无菌生理盐水的试管，依次编无菌生理盐水的试管，依次编号号10-1，10-2，10-3，10-4，再取，再取3个倒好营养琼脂个倒好营养琼脂培养基的平板，分
11、别编号培养基的平板，分别编号10-2，10-3，10-4。（3）稀释菌液。取）稀释菌液。取1支无菌移液管，按无菌操作支无菌移液管，按无菌操作的方法吸取的方法吸取1mL菌液于菌液于10-1试管中。另取试管中。另取1支支无菌移液管，在无菌移液管，在10-1中吹吸数次，混匀后吸取中吹吸数次，混匀后吸取1mL菌液至菌液至10-2管中。另取管中。另取1支无菌移液管，支无菌移液管，在在10-2中吹吸数次，混匀后吸取中吹吸数次，混匀后吸取1mL菌液至菌液至10-3管中。另取管中。另取1支无菌移液管，在支无菌移液管，在10-3中吹吸数中吹吸数次，混匀后吸取次，混匀后吸取1mL菌液至菌液至10-4管中。管中。（
12、注意（注意移液管不能混用）移液管不能混用）四、实验步骤四、实验步骤四、实验步骤四、实验步骤（4）用无菌移液管分别吸取）用无菌移液管分别吸取10-2，10-3，10-4三三个稀释度的菌液各个稀释度的菌液各0.1mL，加入相应编号的营，加入相应编号的营养琼脂平板中。养琼脂平板中。（注意移液管不能混用）（注意移液管不能混用）（5）用无菌涂布棒涂抹均匀。）用无菌涂布棒涂抹均匀。（涂抹不同稀释（涂抹不同稀释度菌液要用不同的涂布棒）度菌液要用不同的涂布棒）（6）等菌液吸收进培养基后将平板倒置于）等菌液吸收进培养基后将平板倒置于37培养箱中培养培养箱中培养24h后观察结果。后观察结果。四、实验步骤四、实验步
13、骤四、实验步骤四、实验步骤四、实验步骤四、实验步骤7.稀释倾注法稀释倾注法（每组稀释（每组稀释10-2，10-3，10-4稀释度稀释度菌液各加菌液各加1mL菌液到平板，倾注培养基分离）菌液到平板，倾注培养基分离）（1）熔化培养基。电炉加热熔化）熔化培养基。电炉加热熔化另一瓶另一瓶60mL营养营养琼脂培养基，将熔化的培养基放于琼脂培养基，将熔化的培养基放于45水浴中保温水浴中保温待用。待用。（2）取）取4支装有支装有9mL无菌水的试管，依次编号无菌水的试管，依次编号10-1，10-2，10-3，10-4，再取，再取3个无菌空平板，分别编个无菌空平板，分别编号号10-2，10-3，10-4。（3）
14、稀释菌液。取）稀释菌液。取1支无菌移液管，按无菌操作的支无菌移液管，按无菌操作的方法吸取方法吸取1mL菌液于菌液于10-1试管中。另取试管中。另取1支无菌移液支无菌移液管，在管，在10-1中吹吸数次，混匀后吸取中吹吸数次，混匀后吸取1mL菌液至菌液至10-2管中。另取管中。另取1支无菌移液管，在支无菌移液管，在10-2中吹吸数次，混中吹吸数次，混匀后吸取匀后吸取1mL菌液至菌液至10-3管中。另取管中。另取1支无菌移液管，支无菌移液管，在在10-3中吹吸数次，混匀后吸取中吹吸数次，混匀后吸取1mL菌液至菌液至10-4管中。管中。四、实验步骤四、实验步骤（4）用无菌移液管分别吸取）用无菌移液管分
15、别吸取10-2，10-3，10-4三个稀释度的菌液各三个稀释度的菌液各1mL，加入相应编号的空，加入相应编号的空平板中。平板中。（5）取保温于）取保温于45水浴中的营养琼脂培养基水浴中的营养琼脂培养基倒入上述平板中，每板倒入倒入上述平板中，每板倒入1520mL培养基，培养基，立即平面旋摇使菌液与培养基充分混匀，盖上立即平面旋摇使菌液与培养基充分混匀，盖上平板盖子。平板盖子。（6）等培养基凝固后将平板倒置于）等培养基凝固后将平板倒置于37培养培养箱中培养箱中培养24h后观察结果。后观察结果。五、注意事项五、注意事项1.接种环在接种前后都要消毒。接种环在接种前后都要消毒。2.接种环消毒后伸入菌种管
16、蘸取菌种之前，要接种环消毒后伸入菌种管蘸取菌种之前，要在试管内壁上靠一靠，以冷却铂丝的温度，使在试管内壁上靠一靠，以冷却铂丝的温度，使不至于烫伤菌种。不至于烫伤菌种。3.用接种环在培养基表面划线分离时，不要太用接种环在培养基表面划线分离时，不要太用力，以免划破培养基。用力，以免划破培养基。4.培养皿一定要倒置培养。培养皿一定要倒置培养。5.混匀菌液与培养基时注意不能摇出气泡。混匀菌液与培养基时注意不能摇出气泡。6.用过的沾菌的吸管和涂布棒应放入用过的沾菌的吸管和涂布棒应放入0.1%的的新洁尔灭溶液中浸泡新洁尔灭溶液中浸泡10min以后才能清洗。以后才能清洗。六、思考题六、思考题1.为什么接种环接种前后都要消毒？为什么接种环接种前后都要消毒？2.固体琼脂平板为什么要倒置培养？固体琼脂平板为什么要倒置培养？3.实验室常用哪几种方法分离纯种细菌实验室常用哪几种方法分离纯种细菌？