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1、微生物的接种技术及分离纯化第1页，本讲稿共18页土壤微生物的分离和培养土壤微生物的分离和培养n目的要求目的要求n实验原理实验原理n实验材料实验材料n实验步骤实验步骤n实验结果实验结果n思考题思考题第2页，本讲稿共18页目的要求目的要求n初步掌握微生物的分离、培养和菌种的基本初步掌握微生物的分离、培养和菌种的基本方法。方法。n练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。无菌操作技术。第3页，本讲稿共18页实验原理实验原理n土壤是微生物生活的大本营，为了获得某种土壤是微生物生活的大本营，为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营微生物的
2、纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂，淘汰适宜的培养条件，或加入某种抑制剂，淘汰其他一些不需要的微生物，再用各种方法分其他一些不需要的微生物，再用各种方法分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。稀释涂板法、稀释混合平板法、划线分离第4页，本讲稿共18页第5页，本讲稿共18页实验材料实验材料n样品：样品：新鲜土壤。新鲜土壤。n培养基：培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏一号灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏一号培养基、马铃薯蔗糖培养基。培养基、马铃薯蔗糖培养基
3、。n无菌水：无菌水：带有玻璃珠装有带有玻璃珠装有45mL无菌水三角瓶、装有无菌水三角瓶、装有9mL无菌水的试管。无菌水的试管。n其它：其它：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、电子天无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、电子天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴。平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴。n试剂：试剂：1万万U/mL链霉素液、链霉素液、10苯酚苯酚第6页，本讲稿共18页实验步骤实验步骤n稀释涂板法稀释涂板法n稀释混合平板法（混菌法）稀释混合平板法（混菌法）n划线分离划线分离n微生物的培养微生物的培养第7页，本讲稿共18页n制平板：每制平板：每组制培养皿组制培养皿3付。付。在无菌培养皿底部注明
4、分离菌名、稀释度、组别、班级。第8页，本讲稿共18页实验步骤1（微生物的分离稀释涂平板法）n制备土壤稀释液：制备土壤稀释液：(无菌操作过程见教师示范）无菌操作过程见教师示范）1.称取土壤称取土壤5g，放入，放入45mL无菌水的三角瓶中，振荡无菌水的三角瓶中，振荡10min，即，即为稀释为稀释101的土壤悬液。的土壤悬液。2.另取装有另取装有9mL无菌水试管无菌水试管5支，用记号笔编上支，用记号笔编上102、103、104、105、106。取已稀释成。取已稀释成101的土壤液，振荡后静止的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入土壤悬液加入102的无菌水的
5、的无菌水的试管中，并在试管内试管中，并在试管内轻轻吹吸轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成数次，使之充分混匀，即成102土壤稀释液。同法依次连续稀释至土壤稀释液。同法依次连续稀释至104、105、106土壤土壤稀释液。稀释液。n在土壤稀释过程中，需换用不同的吸管在土壤稀释过程中，需换用不同的吸管第9页，本讲稿共18页图图1 土壤稀释液的土壤稀释液的制备和稀释液的取样制备和稀释液的取样第10页，本讲稿共18页n吸取稀释液吸取稀释液取一吸管，以无菌操作法分别吸取104、105、106土壤稀释液0.1mL，加在已制好的平板培养基上。n涂板涂板用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，倒置于恒温箱培养。n
6、计算出每克土壤中细菌的数量。计算出每克土壤中细菌的数量。即用某一培养皿内真菌的菌落数乘以该培养皿接种液的稀释倍数即得。n挑取单个菌落，进行划线分离。挑取单个菌落，进行划线分离。第11页，本讲稿共18页 实验程序实验程序7 （微生物的分离微生物的分离平板涂抹法）平板涂抹法）第12页，本讲稿共18页实验程序2（微生物的分离混菌法）n制平板制平板n吸取稀释液吸取稀释液取一吸管，以无菌操作法分别吸取104、105、106土壤稀释液0.1mL，加在空培养皿中。n混菌混菌水平轻轻转动培养皿，使菌液、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后倒置于恒温培养箱培养。n计算出每克土壤中放线菌的数量。计算出每克
7、土壤中放线菌的数量。n挑取单个菌落，进行划线分离。挑取单个菌落，进行划线分离。第13页，本讲稿共18页实验程序3（微生物的分离平板划线法）n制成平板。制成平板。n凝固后，用接种环取相应的菌液一环（凝固后，用接种环取相应的菌液一环（101）在平板上划线。）在平板上划线。1.连续划线法：连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。完毕后，倒置于划线。完毕后，倒置于28300C温室培养。温室培养。2.分区划线法：分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在环，先在培养基的一边作第一次平行划线培养基的一
8、边作第一次平行划线34条，再转动培养皿约条，再转动培养皿约600C角，角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，盖二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于温室培养。上皿盖，倒置于温室培养。n挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最后得到挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最后得到纯培养。纯培养。第14页，本讲稿共18页第15页，本讲稿共18页实验程序实验程序10 （微生物的接种方法）微生物的接种方法）n接种方法：
9、常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、试管深层固接种方法：常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、试管深层固体培养基的穿刺接种法。体培养基的穿刺接种法。n接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等（见图玻璃涂棒等（见图6）。）。图6第16页，本讲稿共18页思思 考考 题题n平板培养时为什么要把培养皿倒置？平板培养时为什么要把培养皿倒置？n在划线分离时，为什么每次都需要将接种环上的剩余在划线分离时，为什么每次都需要将接种环上的剩余物烧掉？物烧掉？第17页，本讲稿共18页实实 验验 七七结结 束束第18页，本讲稿共18页