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1、试验六细菌的生化试验细菌的生化试验试验六 细菌的生化试验目的要求1. 通过本试验加深对细菌生化反响原理和意义的理解；2. 把握常规细菌生化试验操作方法。操作步骤一、糖类发酵分解试验原理：细菌含有分解不同蔗糖醇、苷类的酶，因而分解各种糖醇、苷类的力量也不必一样。有些细菌分解某些糖醇、苷 产酸符号：+、产气符号：，培育基由兰变黄指示剂溴指示剂麝香草酚兰由兰遇酸福兰县的结果，并有气泡；有些产酸，仅培育基变黄；有些不分解糖类符号：，培育基仍为兰色。一适用于需氧菌的方法培育基 用邓亨氏Dunham蛋白胨水溶液蛋白胨 1g，氯化钠0.5g，水 100ml，pH7.6 按 0.51的比例分别参加各种辣椒，每
2、100ml 参加 1.2ml 的 0.2溴麝香草酚蓝或用 1.6溴甲酚紫酒精溶液 0.1ml作指示剂。分装于试管每一个试管事先都加有一枚倒立的小发酵管，10 磅高压灭菌 10 分钟。如在培育基中参加琼脂达 0.50.7，则成半固体，可省去倒立的小失水管。 0.2溴麝香草酚蓝溶液配法：溴麝香草酚蓝 0.2g 0.1N NaOH 5ml蒸馏水 95ml方法：从琼脂斜面的纯培育物上，用接种环取少量被检细菌接种于糖发酵管培育基中如为半固体，应穿刺，在 37培育，一般观看 23 天，观看时用上述符号标记之。二适用于厌氧菌的方法培育基：蛋白胨 20g 氯化钠 5g 琼脂 1g1.6硫甲酚紫酒精溶液 1ml
3、 糖 10g硫乙醇酸钠 1g 蒸馏水 1000ml将胨、盐、硫乙醇酸钠、琼脂和水放于水槽内，加热使溶化，再参加所需的糖，调整pH 到 7.0，参加指示剂，分装试管，在 10 磅高压灭菌 15 分钟后，做成高层。方法 将厌氧菌的培育物用穿刺接种法接种于上述培育基的深部， 于 37培育。结果观看同需氧菌。二、VP 试验二乙酰试验原理：某些细菌能从葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇Acetymethyl carbinol2，3-丁烯二醇2，3-bytaylene cylycol，在有碱阿提斯鲁夫尔谷存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用，会带来粉红色的化合物。其反响式为：2CH3HCH33 十 2C
4、O2丙酮酸 乙酰甲基甲醇-2HCH33 KOHCH3H32，3-丁烯二醇 丁二酮二乙酰培育基：含葡萄糖、K2HPO4、蛋白胨各 5g，完全溶解于 1000ml 水中后，分装试管内，间歇灭菌或 10 磅 10 分钟灭菌。方法： 1OMearas 法试剂：40g 氢氧化钾溶于 100ml 蒸馏水中，参加 0.3g 肌酐即成。将被检细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培育后，于 3537培育 48 小时，于每毫升培育物中参加 0.1ml，猛烈摇振混合。2Baritts 法试剂：6-奈酚酒精溶液为甲液，40氢氧化钾为乙液。同上法接种培育霉菌，于 2ml 培育液内改投甲液 1ml 和乙液 0.4 毫升，摇振混合。试
5、验时强阳性者约于 5 分钟后，可产生粉红色反响长时间无反响，置室温过夜，次日不变者为基因型。三、甲基红MR试验原理：某些细菌在糖代谢过程中生成丙酮酸，有的甚至进一步纯化被分解为甲酸、乙酸、乳酸等，而不是生成VP 试验中的二乙酰， 从而使培育基的pH 下降至 4.5 或以下VP 试验的培育物pH 常在4.5 以上，故参加甲基红试剂呈长红色。本试验常与VP 试验一起使用，由于前者呈阳性的细菌，后者通常为阴性。培育基：同VP 试验培育基。甲基红指示剂：0.1g 甲基红溶于 300ml95酒精中，再参加蒸馏水 200ml。方法：接种细菌于培育液之中， 37培育 27 天后，于培育物中参加几滴试剂，变红
6、色者为阳性反响。四、淀粉水解试验原理：细菌如产生淀粉酶可将甲硫氨酸淀粉分解为糖类，在培育基上滴加碘液，可在肉骨粉四周消灭透亮区。淀粉琼脂培育基：pH7.6 的肉浸汤琼脂 90ml无菌羊血清只对不易生长的细菌才加 5ml 无菌 3淀粉溶液 10ml将琼脂加热溶化，冷却到 45，参加淀粉液体及羊血清，混匀后， 倾注平板。方法：将细菌划线接种于上述平板上，在 37培育 24 小时。生长后取出，在菌落处滴加革兰氏碘液少许，观看。结果：培育基呈深蓝色，能水解淀粉的细菌及其菌落四周有透亮的环。五、枸橼酸盐利用试验原理：当细菌利用铵盐作为独一无二氮源，并利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，可在枸橼酸盐培育基上为生长
7、，生成碳酸钠，并同时利用铵盐生成氢，使培育基呈碱性。方法 1：Simmons 氏培育基：柠檬酸钠 lg K2HPO4 lg硫酸镁 0.2g 氯化钠 5g琼脂洗过 20g NH4H2PO4 1g1溴麝香草酚蓝酒精溶液 10ml 蒸馏水 加至 1，000ml调整pH 至 6.8，15 磅 15 分钟高压灭菌后制成斜面。将上述培育基大大削减中的琼脂省去，制成液体培育基，同样可以应用。将被检细菌少量接种到培育基培育基中会， 37培育 24 日，培育基变蓝色者为尿样，不变者为阴性。方法 2：Christenten 氏培育基： 柠檬酸钠 5gKH2PO4 1g葡萄糖 0.2g 氯化钠 5g 酚红 0.01
8、2g半胱氨酸 0.1g 琼脂 15g酵母浸膏 0.5g蒸馏水加至 1000ml有的配方尚加柠檬酸铁铵 0.4g，硫代硫酸钠 0.08g。PH 不必调整。高压灭菌后压成做成短厚的斜面。接种时先划线后穿刺，孵育于 37观看七天。苯丁酸培育基变红色，阴性者培育基仍为红色。六、吲哚试验原理：细菌分解蛋白胨中的葡萄糖，生成吲哚靛基质，经与试剂中的对位二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚。培育基：邓亨氏蛋白胨氢氧化钠同一 试剂：常用下述两种。 1欧立希氏Eplichs吲哚试剂对位二甲基氨基苯甲醛P-dimethyl aminobenzaldehyde 1g 纯乙醇 95ml浓盐酸 20ml先以乙醇溶解试剂，
9、后加盐酸，要避光保存。2Kovacs 试剂对位二甲基氨基苯甲醛 5g 戊醇聚异戊醇 75g 浓盐酸25ml方法：以接种环接种待试细菌的颖斜面培育中所邓亨氏蛋白胨溶液物于， 37培育 2448 小时后可延长 45 天。于培育液中参加戊醇或二甲苯 23ml，摇匀，静置片刻后，沿试管壁参加试剂 2 毫升。在戊醇或二甲苯下面的液体变黄色红色者为阳性反响。也可将一指头有大的脱脂棉，滴上两滴欧立希氏复原剂，再在同 处加滴两滴高硫酸钾K2S2O4饱和水溶液，置于含培育液的被检试 管中，离液面约半寸，置烧杯内水浴煮沸为止，脱脂棉上消灭明显红 色为阳性。此法略繁，但省试剂且准确，由于将试剂加到液体中，吲 哚和粪
10、臭素均呈阳性，而用此法，只是吲哚它能挥发呈阳性反响。亦可以滤纸一小片浸湿 1%的二甲基苯丙烯铅的 10浓HCl 溶液， 然后以接种环刮取一环琼脂的纯培育物凝胶涂布于该滤纸上。细菌涂印四周线状蓝色者为阳性，细菌涂印四周无色泽变化或淡黄色者为阴性。厌氧菌用蛋白胨冷水蛋白胨 20g葡萄糖 10g 硫乙醇酸钠 1gNa2HPO4无水 2g 琼脂 1g蒸馏水 1000ml加热溶解，调整pH 至 7.47.6，过滤，分装小试管，15 磅高压15 分钟。七、硫化氢试验原理：有些细菌能分解含硫核苷酸氨基酸，产生硫化氢H2S， H2S 会使培育基中的醋酸铅或氯化铁形成黑色的硫化铅或硫化铁。方法 1：醋酸铅琼脂法
11、培育基：肉汤琼脂 100ml 10硫代硫酸钠溶液配 2.5ml10醋酸铅溶液 3ml三种成分分别高压灭菌，前二者丰泓后待凉至 60，参加醋酸铅溶液，混合均匀，无菌分装试管达 56cm 高，马上浸入冷水中，使冷凝成琼脂高层。方法：用接种针蘸取纯培育磁石，沿管壁作穿刺，孵育于37 12 天后观看，必要时可延长 57 天。培育基变黑色者为阳性。或将细菌培育于肉汤、肝浸汤琼脂斜面或血清葡萄糖琼脂斜面， 在试管的棉花塞下方挂一约 6.50.6cm2 的浸蘸饱和氯铅溶液10g 醋酸铅溶于 50 毫升沸蒸馏水中即成且已枯燥的滤纸六条，于 37培育， 观看 7 天，纸条变黑者为红细胞结果。方法 2：五氯化铁明
12、胶培育基法培育基：硫胨Thiopeptone 25g 明胶 120g牛肉膏 7.5g 氯化钠 5g蒸馏水加至 1000ml上述成份灭菌后趁热参加 5ml 灭菌的 10氯化铁溶液。马上以无菌操作分装试管，达 56cm 高，快速冷凝成高层。方法：穿刺接种，培育于 37观看 7 天，培育基变黄色者为阳性。八、硝酸盐复原试验原理：有的细菌能把硝酸盐复原为亚硝酸盐，而亚硝酸盐能和对氨基苯磺酸作用填入对重氮基苯磺酸，且对重氮基苯磺酸与-萘胺铬酸钾作用能生成红色的化合物N-萘胺偶氮苯磺酸，其反响式为：对氨基苯磺酸 对重氮基苯磺酸一适用于需氧菌的方法培育基：硝酸钾不含NO2- 0.2g 蛋白胨 5g蒸馏水 1
13、000ml溶解，调整pH 至 7.4，分装试管。每管约 5 毫升，15 磅高压灭菌15 分钟。试剂：甲液 对位氨基苯磺酸 0.8g 5N 醋酸溶液 100ml乙液 萘胺 0.5g 5N 醋酸溶液 100ml 方法：接种细菌后 37培育 4 天，沿管壁参加甲液二滴与乙液二滴，当时观看。阳性者马上呈红色。二豆科植物硝酸盐培育基法培育基：硝酸钾不含NO2-，化学纯 1g 磷酸氢二钠 2g葡萄糖 1g 琼脂 1g蛋白胨 20g蒸馏水 1000ml加热溶解，调整pH 至 7.2，过滤，分装试管，15 磅高压灭菌 15 分钟。方法：接种后作厌氧培育，试验方法和结果观看同上法，但培育12 日即可。九、石蕊牛
14、乳试验原理：紫乳培育基中的主要包括成分为干酪素、乳糖及指示剂等。由于各种细菌对这些成分的促进作用不同，已引起有鉴于培育基的变 化也有不同，观看的主要涨落为：产酸：典型从乳糖产生酸，指示剂变酸色石蕊为红色，溴甲酚紫为黄色。酸凝或加有产气：产酸，并有牛乳的凝固pH4.7 以下；如有气体形成，则凝块中有裂隙，在魏氏梭菌则呈“暴烈发酵”。凝乳酶产生：很少或无酸产生，牛乳凝固。胨化：局部或大局部牛奶变清亮。产碱：产生蛋白酶可将干酪素分解产生胺或氨，使培育基的pH 进一步上升，呈深紫色。培育基：加石蕊的酒精于颖脱脂牛奶中，使达浅紫色，分装于小试管，用流淌蒸汽灭菌，每天 1 次，每次 1 小时，共 3 天。
15、接种细菌后，培育及观看一周。石蕊酒精溶液的制备：8g 石蕊在 30ml40乙醇中研磨，吸出上清液，再如此用乙醇操作方式两次。加 40乙醇到总量为 100ml，并煮沸 1 分钟。取用上清液，必要时可加几滴 1N 盐酸使达艳紫色。如今多应用溴甲酚紫代替石蕊，即于 100ml 脱脂参加 1.2ml 的 1.6溴甲酚紫的碳酸铯。方法：将细菌中所接种于紫乳培育基中，37培育 17 天后观看结果，依据细菌的种类不同，可再现一种上述一种或几种现象。十、凝固血清液化试验原理：有些病原产生胞外酶，可使凝固的血清液化，借此鉴别细菌。吕氏血清培育基：1葡萄糖肉汤pH7.6100 毫升，无菌羊牛、猪血清 300ml，
16、混合后，分装于无菌试管，每管约 57ml，在血清凝固器内摆成斜面，间歇灭菌。第一天，80 l 小时，于 37过夜；其次天，851 小时，于 37 过夜；第三天，901 小时，于 37过夜。弃去有污染的管。方法与结果：将纯培育物在斜面上作划线接种，于 37培育 1 周， 观看凝胶有无液化。十一、肉渣消化试验原理：有些细菌能够产生蛋白酶，消化肉渣。熟肉基：即于pH7.47.6 的牛肉汤中，于分装试管前，参加半指高的肉渣。液面上加冷却液一小局部凡士林或液体石蜡，15 磅高压灭菌 30 分钟。方法：用无菌毛细玻管或接种环接种细菌后才，用小写蜡笔于培育基的肉渣层上缘划一横线作标记，在 37培育几天，观看
17、管内肉渣的高度有无变化，即可方可判定番茄酱是否已被局部消化。十二、明胶液化试验原理：有些细菌能产生黏液于细胞蛋白外的明胶酶，降解明胶为氨基酸，使半固体的明胶培育基成为液体。培育基：明胶培育基见附录 培育基 27方法 1、电解液琼脂平板法可于一般琼脂参加 1明胶倾注平板后， 分为四个区，每个区分别划线接种同一个一种被检菌，经2448 小时培育后，于培育基外表注入氯化汞溶液氯化汞 12g，蒸馏水 80ml，浓盐酸 16ml，如细菌液化明胶，则在菌落四周消灭透亮带。方法 2、将被检菌穿刺接种于明胶培育基，于 20培育 7 天，逐日观看明胶液化现象。如室温高，培育基自行溶化前一天，可与冰箱内放置 30
18、 分钟，然后取出观看结果，不须凝固时为阳性。十三、尿素酶试验原理：某些细菌能产生尿素酶。尿素酶可分解尿素，产生大量的氨，使培育基的pH 值上升，反响式为：ONH42CO32NH3+CO2+H2O NH2-C-NH2+2H2O培育基：应用Christenrsen 氏培育基蛋白胨 1g 葡萄糖 1g氯化钠 5g 尿素酶KH2PO4 2g0.2酚红溶液 6ml 琼脂 20g蒸馏水加至 1000ml调整pH 至 6.9。需有生长因子的细菌，可参加酵母浸膏 0.1。121高压灭菌 15 分钟，冷却到 55前一天参加格外之一的 20尿素液经滤过法除菌使尿素含量为 2即每 1000ml 中有 20g， 制成
19、短斜面。接种细菌时，同时作有划线及穿刺，置 37培育 24 小时 后观看，培育基从黄色变红色时为阳性。接种量多，反响快的细菌，数小时即可而使培育基变红。阴性者应连续观看 4 天。可以省去琼脂，将各物包括 20g 尿素溶解后，过滤除菌，无菌分装，培育 2 日，无菌者应用。十四、触酶试验原理：触酶俗称过氧化氢酶，能将过氧化氢分解成为水和氧气：2H2O+O2 2H2O2 培育基：饮食细菌应培育在不含血液的养分琼脂上用，由于红血球含有接触酶。方法：将约 1 ml3的H2O2 倾注于生长物菌落或菌苔上，有气泡O2发生者为阳性。亦可于清洁小试管中参加少量的H2O230，再用清洁无菌的细玻挽或火焰封口的毛细
20、玻管或镍铬丝做成的接种环蘸细菌少许，插入于H2O2 液面下，有气泡产生者为阳性。不行用铂环取细菌，由于铂有时可使H2O2 产生气泡。Daniel，YC法：将细菌在平皿上才划线，培育于 3724 小时。另取一支毛细钻头外径 1mm，长 67mm 左右，将其一端浸于 3的H2O2 液中，使H2O2 上升到毛细玻管内，高度约达 20mm。将这一支带有H2O2 的毛细管下端，轻轻接触菌落，毛细管内马上消灭“沸腾”者为强阳性，观看时间以 10 秒钟为限。十五、氧化酶试验Kovac 试验原理：氧化酶及细胞色素氧化酶。做氧化酶试验时，此酶并不直接与氧化酶试剂起脱氢酶化学反响，而是首先并使细胞色素C 氧化，
21、然后此氧化型细胞激素C 再使对苯二胺氧化，产生颜色反响。 细胞色素1 氧化酶细胞色素2 氧化型细胞色素C 十 H2O 2 复原型细胞色素C+2H+2O2 试剂，1%盐酸四甲基苯二胺水溶液，或 1%盐酸二甲基对苯二胺水溶液，配制后盛于棕色瓶中，置冰箱中可保存 2 周，假设冰冻保存可用46 周。方法 1 如真菌在固体培育基上长出菌落，可将二氯甲烷试剂直接滴在细菌的菌落上，菌落呈玫瑰红色然后到深紫色者为氧化酶亚硝酸钠阳性。方法 2 取白色通透滤纸一角，蘸取试验菌菌落少许，加试剂一滴， 阳性者马上呈粉红色，以前颜色渐渐加深。十六、DNA 酶试验原理：DNA 酶可使DNA 链水解成为由几个单核苷酸组成的
22、寡核苷酸链。长链DNA 可被酸沉淀，而水解后已经形成的寡核苷酸，则可溶于酸，于DNA 琼脂平板上需要进展试验，可在菌落四周形成透亮环的。培育基：DNA 酶试验培育基养分琼脂pH7.2 100ml 脱氧核糖核酸DNA 0.2g 8CaCl2 水溶液 1ml方法：将被检菌接种于 0.2%DNA 琼脂平板上为做点状接种，于3537培育 1824 小时后，用 1N 盐酸倾注平板。于菌落四周消灭透亮环为此病。十七、脂酶试验原理：细菌产生的脂酶可分解脂肪为游离脂肪酸。加在中的维多利亚蓝可与脂肪结合成为无色化合物，假设脂肪被细菌产生的分解脂肪酶溶解，则维多利亚蓝释出，呈现深蓝色。该试验主要包括用于厌氧菌的鉴
23、定。培育基：脂酶培育基蛋白胨 10g酵母浸膏 3g 氯化钠 5g琼脂 20g pH7.8维多利亚蓝1：1500 水溶液 100ml 玉米油 50ml蒸馏水 900ml方法：将被检细菌接种于脂酶培育基上，于 3537培育 24 小时。细菌如有脂酶，则而使培育基变为深蓝色，否则酵母不变色无色或粉红色。十八、氨基酸脱羧酶试验原理：有的细菌具有脱羧酶，能使氨基酸脱羧-COOH，生成胺和CO2，使培育基的pH 上升，最常用的氨基酸有赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸。根底培育基： 蛋白胨 5g葡萄糖 1g0.2%溴麝香草酚黑溶液 12ml 蒸馏水 1000ml调整pH 到 6.8，每 100m1 根底培育基，参加所
24、可能需要测定的氨基酸 0.5g，所加的氨基酸应先溶解于NaOH 溶液内。Ld 赖氨酸 0.5g + 15Na0H 溶液 0.5ml Ld 鸟氨酸 0.5g + 15%NaOH 溶液 0.6ml参加氨基酸后，再调整pH 至 6.8，分装于灭菌小试管内，每管1ml，121高压灭菌 10 分钟。方法：从琼脂斜面上挑取培育物少许接种，上面滴加一层无菌液体石蜡，于 37培育 4 天，每天观看结果。阳性者培育液先变为黄色， 后变为蓝色。阴性者为黄色。十九、苯丙氨酸脱氨酶试验原理：病原能将苯丙氨酸脱氨变成苯丙酮酸，酮酸能使三氯化铁指示剂蔫绿色。科散囊变形杆菌及普罗菲登斯菌有苯丙氨酸脱氨酶的活力。培育基：DL
25、 苯丙氨酸或L 苯丙氨酸 1g 2g 氯化钠 5g酵母浸膏 3g 琼脂 12g Na2HPO4 1g蒸馏水 1000ml分装于小试管内，121高压灭菌 10 分钟，制成长斜面。试验方法：多量接种被检菌， 37孵育 1824 小时，生长好后， 取出注入 0.2 毫升或 45 滴10的FeCl3 水溶液于栽种面上，变绿色者为阳性。二十、氰化钾抑菌试验原理：氰化钾可以抑制某些细菌的呼吸酶系统，细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶，以铁卟啉作为辅基，氰化钾能和铁卟淋结合，促使这些酶失去活性，使细菌生长受到抑制。培育基： 蛋白胨 10gNa2HPO4 5.64gNaCl 5g KH2PO4 0.225g蒸馏水 1000ml此为根底液。调整 pH 至 7.6，15 磅灭菌 15 分钟，冷却，置冰箱。于冷根底液中加以 15ml0.5氰化钾溶液0.5g KCN 溶于 100ml冷却的灭菌蒸馏水中，分装于灭菌小试管，每管约 1ml，马上用凉拌有热石蜡的软木塞生菜塞紧，可于冰箱中保存 2 周。方法：将 2024 小时肉汤培育物，接种一大环到KCN 培育基中， 马上用锡箔纸塞紧，置 37培育，连续观看 2 天，有细菌生长时为阳性反响。留意：KCN 为剧毒药，宜在通气橱内操作。