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1、实验六-细菌的生理生化试验二、原理二、原理由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不相同，也就是说，不同微生物具有不同的酶系相同，也就是说，不同微生物具有不同的酶系统。即使在分子生物学技术和手段不断发展的统。即使在分子生物学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有
2、很大作用。中仍有很大作用。11/6/2022三三、材料材料1菌种菌种大肠埃希氏菌（大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）、产气肠）、产气肠杆菌、沙门氏菌的斜面菌种杆菌、沙门氏菌的斜面菌种。2培养基培养基葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、葡萄糖葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、三糖铁琼蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、三糖铁琼脂斜面等。脂斜面等。11/6/20223试剂试剂5%5%的的-萘酚溶液、萘酚溶液、40KOH溶液、甲基溶液、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚。红试剂、吲哚试剂、乙醚。4器具器具超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试超净工作台、恒温培养箱
3、、高压灭菌锅、试管、移液管、接种环等。管、移液管、接种环等。11/6/2022四、四、流程流程糖类发酵试验糖类发酵试验V-P试验试验M.RM.R试验试验吲哚试验吲哚试验硫化氢试验硫化氢试验三糖铁三糖铁（TSI）琼脂试验）琼脂试验11/6/2022五、五、步骤步骤(一一)糖类发酵试验糖类发酵试验1目的目的了解不同细菌分解利用糖的能力及实了解不同细菌分解利用糖的能力及实验原理，并掌握其操作方法。验原理，并掌握其操作方法。11/6/20222原理原理可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产
4、酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其指示剂，其pH在在5.2以下呈以下呈黄色黄色，pH在在6.8以上呈以上呈紫色紫色），经培养后根据指示剂的颜），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察是否产生气泡来判断。放入倒置杜氏小管观察是否产生气泡来判断。11/6/20223材料材料3.2菌种菌种大肠埃希氏菌（大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）、产气）、产气肠杆菌（肠杆菌（Enterobacteraerogenes）、沙门）、沙门氏菌的斜面菌种
5、氏菌的斜面菌种3.培养基培养基葡萄糖和乳糖发酵培养液试管葡萄糖和乳糖发酵培养液试管11/6/2022流程流程发酵液试管发酵液试管标记标记接种接种培养培养观察观察记录记录11/6/20225步骤步骤5.1试管标记试管标记取分别装有葡萄糖和乳糖发酵培养取分别装有葡萄糖和乳糖发酵培养液试管各液试管各4支，每种糖发酵试管中均分支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏菌和空白对照。菌和空白对照。11/6/20225.2接种接种以无菌操作分别接种少量菌苔至以上以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空各相应试管中，每种糖发酵培养液
6、的空白对照均不接菌。置白对照均不接菌。置37恒温箱中培养，恒温箱中培养，分别在培养分别在培养24h、48h、和、和72h观察结果。观察结果。11/6/202211/6/202211/6/20225.3观察记录观察记录与对照管比较，若接种培养液保持原有颜与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用种糖，记录用“”表示；如培养液呈黄色，表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用记录用“”表示。培养液中的杜氏小管内有表示。培养液中的杜氏小管内有气泡
7、为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用气，记录用“”“”表示；如杜氏小管内没有气泡表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用为阴性反应，记录用“”表示。表示。11/6/2022(二二)、乙酰甲基甲醇试验乙酰甲基甲醇试验(VP试验试验)1.目的目的检测细菌能否利用葡萄糖产生非酸性检测细菌能否利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。或中性末端产物的能力。了解鉴别不同了解鉴别不同肠杆菌科各菌属的乙酰甲基甲醇试验原肠杆菌科各菌属的乙酰甲基甲醇试验原理，并掌握其操作方法。理，并掌握其操作方法。11/6/20222原理原理 葡萄糖葡萄糖 丙酮酸丙酮酸 乙
8、酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇 二乙酰二乙酰 与胍基生成红色化合物与胍基生成红色化合物 某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称红色化合物，称VP（+）反应。）反应。11/6/20223材料材料(1)、菌种菌种大肠埃希氏菌、产气肠杆菌、大肠埃希氏菌、产气肠杆菌、沙门氏菌沙门氏菌的的斜面菌种斜面菌种(2)、培养基培养基葡萄
9、糖蛋白胨水培养基葡萄糖蛋白胨水培养基(3)、试剂试剂V-P指指试剂试剂11/6/2022流程流程培养液试管培养液试管标记标记接种接种培养培养观察观察记录记录11/6/20225步骤步骤（1）、）、标记试管标记试管 取取4支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏菌沙门氏菌和空白对照。和空白对照。11/6/2022（2）、）、接种培养接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔至以上以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置相应试管中，空白对照管不接菌，置37恒温箱中，培养恒温箱中，培养4872
10、h。11/6/2022（3）、）、观察记录观察记录 取出以上试管，先加甲液（取出以上试管，先加甲液（6%6%的的-萘酚萘酚溶液）溶液）0.50.5毫升毫升,再加乙液（再加乙液（40KOH溶液）溶液）0.50.5毫升毫升,充分混匀充分混匀,静置静置15min后，若培养液呈后，若培养液呈红色者，记录为红色者，记录为V.P.试验阳性反应（用试验阳性反应（用“”表示）；若不呈红色，记录为表示）；若不呈红色，记录为V.P.试验阴性反试验阴性反应（用应（用“”表示）。表示）。1 1小时后可出现假阳性。小时后可出现假阳性。11/6/202211/6/2022（三）（三）甲基红试验（甲基红试验（M.R.试验）
11、试验）1、目的目的 检测细菌能否分解葡萄糖产生有机酸检测细菌能否分解葡萄糖产生有机酸的能力。了解鉴别肠杆菌科各菌属的甲的能力。了解鉴别肠杆菌科各菌属的甲基红试验原理，并掌握其操作方法。基红试验原理，并掌握其操作方法。11/6/20222、原理原理 肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基酸性产物，可使培养基PH值下降至值下降至pH4.5以下，使甲基红指示
12、剂变红。以下，使甲基红指示剂变红。11/6/20223、材料、材料（1）、菌种）、菌种大肠埃希氏菌（大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）、产气肠）、产气肠杆菌、杆菌、沙门氏菌沙门氏菌的斜面菌种的斜面菌种（2）、培养基）、培养基葡萄糖蛋白胨水培养基葡萄糖蛋白胨水培养基11/6/20224流程流程培养液试管培养液试管标记标记接种接种培养培养指示剂指示剂观察观察记录记录11/6/2022（1）、）、标记试管标记试管 取取4支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏菌沙门氏菌和空白对照。和空白对照。5、步
13、骤步骤 11/6/2022（2）、）、接种培养接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔至以上以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置相应试管中，空白对照管不接菌，置37恒温箱中，培养恒温箱中，培养4872h。11/6/2022（3）、）、观察记录观察记录 取出以上试管，取出以上试管，各加入各加入56滴甲基滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用反应，分别用“”或或“”表示。表示。注意：甲基红指示
14、剂不能加太多，注意：甲基红指示剂不能加太多，以免出现假阳性。以免出现假阳性。11/6/2022 甲基红（甲基红（MethylRed）试验结果）试验结果11/6/2022阳性阳性阴性阴性对照对照11/6/2022（四）、靛基质（吲哚）试验（四）、靛基质（吲哚）试验1目的目的用来检测细菌能否分解色氨酸产生吲用来检测细菌能否分解色氨酸产生吲哚的能力。掌握吲哚试验哚的能力。掌握吲哚试验(Ehrlich法法)的的原理和方法原理和方法。11/6/20222、原理、原理有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基质靛基质)。吲。吲哚本身没有颜
15、色，不能直接看见，但当哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。11/6/20223、材料材料3.1菌种菌种大肠杆菌、产气肠杆菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏菌沙门氏菌3.2培养基培养基蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基3.3试剂试剂对二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。对二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。11/6/20224流程流程标记试管标记试管接种接种培养培养观察观察记录记录11/6/20225步骤步骤（1）、）、标记试管标记试管 取取4支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试支装有葡萄糖蛋白
16、胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏菌沙门氏菌和空白对照。和空白对照。11/6/2022（2）、）、接种培养接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔至以以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置上相应试管中，空白对照管不接菌，置37恒温箱中，培养恒温箱中，培养4872h。11/6/2022（3）观察记录观察记录在培养液中加入乙醚在培养液中加入乙醚12ml，经充分振荡，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入510滴
17、滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察），如有吲哚存在，防破坏乙醚层影响结果观察），如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用否则为阴性反应，阳性用“”、阴性用、阴性用“”表示。表示。11/6/20226结果结果11/6/2022(五五)硫化氢试验硫化氢试验某些能分解某些能分解某些能分解某些能分解胱氨酸胱氨酸胱氨酸胱氨酸H2SH2S与与与与醋酸铅醋酸铅醋酸铅醋酸铅或或或或硫酸亚铁硫酸亚铁硫酸亚铁硫酸亚铁黑色（硫化铅或硫化铁）黑色（硫化铅或硫化铁）黑色
18、（硫化铅或硫化铁）黑色（硫化铅或硫化铁）沙门氏菌沙门氏菌沙门氏菌沙门氏菌11/6/202211/6/2022（六）、三糖铁（六）、三糖铁（TSI）琼脂试验）琼脂试验 原理原理 本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧
19、状态下，斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。酸类不被氧化，所以仍保持黄色。11/6/20223材料材料(1)、菌种菌种大肠埃希氏菌、产气肠杆菌杆菌、大肠埃希氏菌、产气肠杆菌杆菌、沙门氏菌沙门氏菌的的斜面菌种斜面菌种(2)、培养基培养基三糖铁琼脂斜面培养基三糖铁琼脂斜面培养基11/6/20224流程流程标记试管标记试管接种接种培养培养观察观察记录记录11/6/2022（1）、）、标记试管标记试管 取取4支三糖铁琼脂斜面培养基，分别支三糖铁琼脂斜面培养基，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、标记大肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏菌沙门氏菌和空白对照。和空白对照。11/6/20
20、22（2）、）、接种培养接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔至以以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管先作划线分离培养，然后采上相应试管先作划线分离培养，然后采用穿刺培养方法刺到试管底，空白对照用穿刺培养方法刺到试管底，空白对照管不接菌，置管不接菌，置37恒温箱中，培养恒温箱中，培养2448h。11/6/2022（3）观察记录观察记录本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化
21、，加之细菌生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。酸类不被氧化，所以仍保持黄色。11/6/2022试验结果试验结果11/6/2022沙门氏菌的沙门氏菌的TSI试验试验11/6/202211/6/202211/6/2022实验项目实验项目大肠杆菌大肠杆菌沙门氏菌沙门氏菌产气肠杆菌产气肠杆菌葡萄糖葡萄糖乳糖乳糖 V-P V-P试验试验 M.R试验试验 吲哚试验吲哚试验 醋酸铅醋酸铅 斜面斜面TSITSI试验试验 底层底层产气产气 硫化氢硫化氢实验结果实验结果11/6/2022思考题思考题P2201211/6/2022此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢