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1、预防兽医学实验预防兽医学实验 兽医微生物学和免疫学实验兽医微生物学和免疫学实验 实验四实验四 细菌的生化试验细菌的生化试验 实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 一、实验目的一、实验目的 1、掌握细菌生化试验的、掌握细菌生化试验的基本原理及操作方法基本原理及操作方法。2、了解细菌生化试验在细菌鉴定及诊断中的、了解细菌生化试验在细菌鉴定及诊断中的重要意义重要意义。3、掌握实验的、掌握实验的结果判定及注意事项结果判定及注意事项。实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 二、实验原理二、实验原理 不同种类的细菌，由于其细胞内新陈代谢的酶不同种类的细菌，由于其细胞内新陈代谢的酶系不同，系不
2、同，对营养物质的吸收利用、分解代谢或合对营养物质的吸收利用、分解代谢或合成产物的产生等都有很大的差别。成产物的产生等都有很大的差别。微生物生化反微生物生化反应是用化学反应来测定微生物的代谢产物，应是用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化生化反应常用来反应常用来鉴别鉴别一些在形态和其它方面不易区别一些在形态和其它方面不易区别的的微生物微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。定中的重要依据之一。实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 三、实验准备三、实验准备 1、器材、器材 温箱、高压蒸汽灭菌锅、三角烧瓶、烧杯、平皿、温箱、高压蒸汽灭菌锅
3、、三角烧瓶、烧杯、平皿、试管、酒精灯、接种环、精密试管、酒精灯、接种环、精密pH试纸、挫刀、蜡烛、试纸、挫刀、蜡烛、记号笔等。记号笔等。2、菌种、菌种 大肠杆菌、沙门氏菌大肠杆菌、沙门氏菌和和变形杆菌变形杆菌，分别接种斜面，分别接种斜面或琼脂平板。或琼脂平板。3、培养基及试剂、培养基及试剂 自配或购买细菌生化微量发酵管及相应显色剂自配或购买细菌生化微量发酵管及相应显色剂 实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 四、实验内容及方法四、实验内容及方法（一）（一）糖或醇类发酵（分解）试验糖或醇类发酵（分解）试验（二）（二）VP试验试验（三）甲基红（三）甲基红（MR）试验）试验（四）枸橼酸盐利用
4、试验（四）枸橼酸盐利用试验-碳源与氮源利用试验碳源与氮源利用试验（五）吲哚试验（五）吲哚试验（六）硫化氢试验（六）硫化氢试验（七）尿素酶试验（七）尿素酶试验（八）硝酸盐还原试验（八）硝酸盐还原试验-各种酶类试验各种酶类试验 碳水化合物碳水化合物代谢试验代谢试验 蛋白质、氨基酸和蛋白质、氨基酸和含氮化合物试验含氮化合物试验 实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 四、实验内容及方法四、实验内容及方法 （一）（一）糖或醇类发酵（分解）试验糖或醇类发酵（分解）试验 1、原理原理 细菌含有分解不同糖（醇、苷）类的酶，因而分解各种细菌含有分解不同糖（醇、苷）类的酶，因而分解各种糖（醇、苷）类的能力
5、也不一样。有些细菌分解某些糖（醇、糖（醇、苷）类的能力也不一样。有些细菌分解某些糖（醇、苷）苷）产酸（符号：产酸（符号：+）、产气（符号：）、产气（符号：），培养基由兰变，培养基由兰变黄（指示剂黄（指示剂溴甲酚紫由溴甲酚紫由pH7.0（紫色）（紫色）pH5.4（黄色）（黄色），），并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类（符并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类（符号：），培养基仍为紫色。号：），培养基仍为紫色。实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 2、培养基：培养基：微量发酵管微量发酵管（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖）甘露醇、蔗糖）。3
6、、方法：方法：在在37培养，一般观察培养，一般观察13天，观察时天，观察时用上述符号标记之。用上述符号标记之。4、结果判定结果判定 （1）产酸产气“产酸产气“”，试管颜色由绿变黄或紫变”，试管颜色由绿变黄或紫变黄，小发酵管内有气泡（微量管顶部有空隙）。黄，小发酵管内有气泡（微量管顶部有空隙）。（2）如果产酸不产气“）如果产酸不产气“+”，试管颜色变黄，但发，试管颜色变黄，但发酵管内无气泡（微量管顶部无空隙）。酵管内无气泡（微量管顶部无空隙）。实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 （3）如果不分解糖“”，试管色不变）如果不分解糖“”，试管色不变。5、应用应用 糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴
7、定细菌的生化糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验。反应试验中最主要的试验。不同细菌可发酵不同细菌可发酵 不同不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖，故可利用此试验鉴别细菌。糖，故可利用此试验鉴别细菌。实验二、细菌培养基的制备实验二、细菌培养基的制备 糖或醇类发酵（分解）试验结果糖或醇类发酵（分解）试验结果 产酸产酸 产气产气 不产酸不产酸 实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 （二）（二）VP试验试验 1、原理原理 某些细菌能
8、从葡萄糖某些细菌能从葡萄糖丙酮酸丙酮酸乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇（Acetymethyl carbinol）2，3-丁烯二醇（丁烯二醇（2，3-bytaylene cylycol），在有），在有碱碱存在时氧化成二乙存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用，酰，后者和胨中的胍基化合物起作用，产生粉红色产生粉红色的化合物。的化合物。2、培养基：培养基：培养基与培养基与MR同。同。实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 3、方法：方法：接种后接种后37培养培养27天。天。4、试剂试剂 甲液：甲液：50g/L-萘酚（萘酚（95乙醇溶液）乙醇溶液）乙液：乙液：400g/L KOH溶液溶液 5
9、、结果判定结果判定:加入甲液加入甲液0.6ml，轻轻振摇试管，然后，轻轻振摇试管，然后加乙液加乙液0.2ml，轻轻振摇试管，轻轻振摇试管30s至至1min，然后静置，然后静置（5min）观察结果。红色者为阳性，黄色或类似铜）观察结果。红色者为阳性，黄色或类似铜色为阴性色为阴性。实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 6、VP试验应用试验应用 主要用于主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。的鉴别。本试验本试验常与常与MR试验一起使用试验一起使用，一般情况下，一般情况下，前者为阳性的细菌，后者常为阴性，反之亦然。前者为阳性的细菌，后者常为阴性，反之亦然。肠杆菌科细菌不一
10、定都这样规律，如蜂房哈肠杆菌科细菌不一定都这样规律，如蜂房哈夫尼亚菌和奇异变形杆菌的夫尼亚菌和奇异变形杆菌的VP试验和试验和MR试验试验常同为阳性。常同为阳性。实验二、细菌培养基的制备实验二、细菌培养基的制备 VP试验试验 实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 （三）甲基红（三）甲基红（MR）试验）试验 1、原理原理 某些细菌在糖代谢过程中生成某些细菌在糖代谢过程中生成丙酮酸丙酮酸，有的甚至进一步，有的甚至进一步被分解为甲酸、乙酸、乳酸等，而不是生成被分解为甲酸、乙酸、乳酸等，而不是生成VP试验中的试验中的二二乙酰乙酰，从而使培养基的从而使培养基的pH下降至下降至4.5或以下或以下（V
11、-P试验的培养试验的培养物物pH常在常在4.5以上），故加入甲基红试剂呈红色（以上），故加入甲基红试剂呈红色（甲基红的甲基红的变色范围为变色范围为pH4.4（红色）（红色）pH6.2（黄色）（黄色）。本试验常与）。本试验常与V-P试验一起使用，因为前者呈阳性的细菌，后者通常为阴试验一起使用，因为前者呈阳性的细菌，后者通常为阴性。性。四、实验内容及方法四、实验内容及方法 实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 2、培养基：培养基：葡萄糖磷酸盐胨水微量生化管。葡萄糖磷酸盐胨水微量生化管。3、试剂：试剂：甲基红试剂。甲基红试剂。4、方法：方法：接种后接种后37 27天，天，5、结果判定：结果判
12、定：培养基中加几滴试剂培养基中加几滴试剂呈红色为呈红色为阳性。阳性。（三）甲基红（三）甲基红（MR）试验）试验 实验二、细菌培养基的制备实验二、细菌培养基的制备 甲基红（甲基红（MR）试验）试验 实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 （四）枸橼酸盐利用试验（四）枸橼酸盐利用试验 1、原理原理 某些细菌能利用某些细菌能利用枸橼酸盐枸橼酸盐作为唯一的碳源，作为唯一的碳源，并能以并能以铵盐铵盐 作为唯一氮源，可在枸橼酸盐培养作为唯一氮源，可在枸橼酸盐培养基上生长，基上生长，分解枸橼酸盐，使培养基变碱性。分解枸橼酸盐，使培养基变碱性。2、培养基培养基 枸盐酸盐培养基（微量生化管）枸盐酸盐培养基
13、（微量生化管）四、实验内容及方法四、实验内容及方法 实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 （四）枸橼酸盐利用试验（四）枸橼酸盐利用试验 3、试剂试剂 溴麝香草酚蓝（溴麝香草酚蓝（pH6.0以下呈黄色，以下呈黄色，pH7.6以以上呈蓝色）上呈蓝色）4、结果结果 培养基变蓝为阳性“培养基变蓝为阳性“+”，培养基不变色为阴，培养基不变色为阴性“”。性“”。实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验（实验组颜色变蓝，为阳性反应）（实验组颜色变蓝，为阳性反应）四、实验内容及方法四、实验内容及方法 实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 （五）吲哚试验（五
14、）吲哚试验 1、原理原理 有些细菌含色氨酸酶，能分解色氨酸生成靛基质有些细菌含色氨酸酶，能分解色氨酸生成靛基质（吲哚），靛基质与二甲基氨基苯甲醛作用，（吲哚），靛基质与二甲基氨基苯甲醛作用，生生成玫瑰靛基质，呈红色。成玫瑰靛基质，呈红色。2、培养基培养基 蛋白胨水微量生化管。蛋白胨水微量生化管。3、方法方法 将待检菌接种于上述培养基中，于将待检菌接种于上述培养基中，于35培养培养2448h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。振，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。振摇充分溶解，静置片刻。摇充分溶解，静置片刻。四、实验内容及方法四、实验内容及方法 实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 四、实验内容及方法四
15、、实验内容及方法 4、结果判定结果判定：乙醚层色变红者，为阳性反应。乙醚层色变红者，为阳性反应。5、应用应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。阳性反应阳性反应 阴性反应阴性反应 吲哚（靛基质）试验结果吲哚（靛基质）试验结果 实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 （六）硫化氢试验（六）硫化氢试验 1、原理原理 有些细菌能分解含硫氨基酸产生硫化有些细菌能分解含硫氨基酸产生硫化氢，硫化氢会使培养基中的醋酸铅或氯化铁形成氢，硫化氢会使培养基中的醋酸铅或氯化铁形成黑色的硫化铅或硫化铁。黑色的硫化铅或硫化铁。2、方法及判定方法及判定 用接种针蘸取纯培养物，沿管用接种针蘸取
16、纯培养物，沿管壁作穿刺，孵育于壁作穿刺，孵育于37 12天后观察，必要时可天后观察，必要时可延长延长57天。天。培养基变黑色者为阳性。培养基变黑色者为阳性。四、实验内容及方法四、实验内容及方法 实验二、细菌培养基的制备实验二、细菌培养基的制备 硫化氢硫化氢试验结果试验结果（颜色变黑色，阳性反应）（颜色变黑色，阳性反应）实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 （七）尿素酶试验（七）尿素酶试验 1、原理：原理：某些细菌能产生尿素酶。尿素酶可分解某些细菌能产生尿素酶。尿素酶可分解尿素，产生大量的氨，从而使培养基变碱，尿素，产生大量的氨，从而使培养基变碱，pH值值升高，在升高，在酚红指示剂的作用
17、下呈红色。酚红指示剂的作用下呈红色。反应式为：反应式为：NH2-C-NH2+2H2O（NH4）2CO3 2NH3+CO2+H2O 2、结果判定：结果判定：接种细菌时，同时作划线及穿刺，接种细菌时，同时作划线及穿刺，置置37培养培养24小时后观察，小时后观察，培养基从黄色变红色培养基从黄色变红色时为阳性时为阳性。接种量多，反应快的细菌，数小时即可。接种量多，反应快的细菌，数小时即可使培养基变红。阴性者应继续观察使培养基变红。阴性者应继续观察4天。天。四、实验内容及方法四、实验内容及方法 实验二、细菌培养基的制备实验二、细菌培养基的制备 尿素酶试验结果尿素酶试验结果（颜色变红色，阳性反应）（颜色变
18、红色，阳性反应）实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 （八）硝酸盐还原试验（八）硝酸盐还原试验 1、原理原理 有的细菌能把硝酸盐还原为亚硝酸盐，有的细菌能把硝酸盐还原为亚硝酸盐，而亚硝酸盐能和对氨基苯磺酸作用生成对重氮基而亚硝酸盐能和对氨基苯磺酸作用生成对重氮基苯磺酸，且对重氮基苯磺酸与苯磺酸，且对重氮基苯磺酸与-萘胺作用能萘胺作用能生成生成红色的化合物红色的化合物N-萘胺偶氮苯磺酸。萘胺偶氮苯磺酸。2、方法及判定方法及判定 接种细菌后接种细菌后37培养培养4天，沿管天，沿管壁加入甲液二滴与乙液二滴，当时观察。壁加入甲液二滴与乙液二滴，当时观察。阳性者阳性者立刻呈红色。立刻呈红色。四、
19、实验内容及方法四、实验内容及方法 实验二、细菌培养基的制备实验二、细菌培养基的制备 硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验 实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 五、注意事项五、注意事项 1、实验所用菌种应是、实验所用菌种应是新鲜培养的纯培养物新鲜培养的纯培养物。2、实验过程应注意、实验过程应注意无菌操作无菌操作，避免混入杂菌影响实，避免混入杂菌影响实验结果。验结果。3、细菌在不同的生化实验中所需的培养时间不同，、细菌在不同的生化实验中所需的培养时间不同，因此要因此要把握好观察时间把握好观察时间，避免实验结果的假阳性，避免实验结果的假阳性或假阴性。或假阴性。4、割生化管时，应小心以防玻璃伤到手和
20、眼睛。割生化管时，应小心以防玻璃伤到手和眼睛。实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 六、思考题六、思考题 1、从实验原理上解释、从实验原理上解释MR试验和试验和VP试验的试验的异同点。异同点。2、简述、简述吲哚试验原理吲哚试验原理。3、试述有些生化试验反应后，在培养基中、试述有些生化试验反应后，在培养基中加入加入显色剂的作用显色剂的作用。4、分析细菌生化试验的、分析细菌生化试验的主要用途及意义主要用途及意义？实验四、细菌的生化试验实验四、细菌的生化试验 实验要求实验要求 1、以组为单位，、以组为单位，大肠杆菌、沙门氏菌大肠杆菌、沙门氏菌和和变形变形杆菌杆菌分别接种分别接种12种生化管。种生化管。2、分别、分别写出细菌生化试验的原理，观察并分写出细菌生化试验的原理，观察并分析试验结果。析试验结果。明天下午明天下午4点到实验室观察培养结果。点到实验室观察培养结果。