微生物的生长第5章新.ppt

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1、第第5章章 微生物的生长微生物的生长5.1微生物的生长及其特性微生物的生长及其特性5.2微生物的生存因子微生物的生存因子5.3其他不利环境因子其他不利环境因子 对微生物的影响对微生物的影响15.1.1 生长与繁殖的概念生长与繁殖的概念何谓生长？何谓生长？同化作用大于异化作用时，细同化作用大于异化作用时，细胞质的量增加，表现在细胞体积或重量的胞质的量增加，表现在细胞体积或重量的不断增加，这种现象称生长不断增加，这种现象称生长何谓繁殖？何谓繁殖？生长一定程度后细胞分裂，这生长一定程度后细胞分裂，这就是细菌的繁殖就是细菌的繁殖5.1微生物的生长及其特性微生物的生长及其特性21 1 单细胞微生物单细胞

2、微生物生长生长：细胞物质增加，体积增大：细胞物质增加，体积增大繁殖繁殖：细胞数目的增加：细胞数目的增加生长：细胞物质增加，体积增大，细胞数目增加生长：细胞物质增加，体积增大，细胞数目增加 繁殖：生命个体数目的增加繁殖：生命个体数目的增加5.1.1 生长与繁殖的概念生长与繁殖的概念2 多细胞微生物多细胞微生物3个体的生长和繁殖体现为个体的生长和繁殖体现为群体的生长群体的生长（微生物重量（微生物重量或数目的增加）或数目的增加）群体生长个体生长个体繁殖群体生长个体生长个体繁殖在微生物学中在微生物学中“只有群体的重复只有群体的重复”才更有意义，因才更有意义，因此此“生长生长”一般指一般指群体生长群体生

3、长41 1、间歇培养、间歇培养（Batch cultivation）和生长曲线和生长曲线（growth curve）接种间歇培养：间歇培养：将一定量细菌接种于封闭的、一定量将一定量细菌接种于封闭的、一定量的液体培养基内，在一定条件下培养。的液体培养基内，在一定条件下培养。培养过程培养过程不投加或取出任何东西不投加或取出任何东西。这。这种培养方式也叫分批培养。种培养方式也叫分批培养。生长曲线：生长曲线：细胞量随时间细胞量随时间的变化曲线称生长曲线的变化曲线称生长曲线5.1.2 细菌的生长特性细菌的生长特性5总细胞数总细胞数细菌的典型生长曲线：以细菌的典型生长曲线：以时间为横坐标时间为横坐标，以，

4、以细菌数为纵细菌数为纵坐标坐标，做出一条，做出一条菌数随时间变化的曲线菌数随时间变化的曲线，即为生长曲线，即为生长曲线 活细胞数活细胞数III培养时间培养时间细胞个数细胞个数600时间细菌数细菌数生长速度生长速度缓缓慢慢期期对对数数期期稳定期稳定期衰老期衰老期活菌数活菌数总菌数总菌数细菌生长曲线（按细菌生长曲线（按细菌数目的对数细菌数目的对数绘制）绘制）7时间活细菌重量生长率率上升阶段生长率下降阶段内源呼吸阶段细菌生长曲线细菌生长曲线(按按细菌重量细菌重量绘制绘制)81)1)停滞期、适应期停滞期、适应期（lag phase）影响停滞期长短的因素：影响停滞期长短的因素：接种龄：种子接种龄：种子(

5、inoculum)处于什么生长期处于什么生长期、接种量：即初期微生物浓度与基质浓度的比接种量：即初期微生物浓度与基质浓度的比 培养基成分：培养基成分：总细胞数活细胞数III培养时间细胞个数特点：特点：生长速率常数近于零，生长速率常数近于零，数目变化不大数目变化不大 细胞形态变大细胞形态变大 rRNA rRNA含量增高含量增高 合成代谢较活跃合成代谢较活跃9产生停滞期的原因：产生停滞期的原因：缺乏分解有关基质的酶缺乏分解有关基质的酶 缺乏充足的代谢中间产物缺乏充足的代谢中间产物总细胞数活细胞数III培养时间细胞个数1)1)停滞期、适应期停滞期、适应期（lag phase）102）指数期指数期（e

6、xponential phase）对数期对数期（stationary phase）最短最短总细胞数活细胞数III培养时间细胞个数细胞数细胞数(量量)以指数形式增加的时间段以指数形式增加的时间段 特点：特点：生长速率最大生长速率最大,世代时间世代时间（generation time）倍加时间倍加时间（doubling time）酶系活跃、代谢旺盛酶系活跃、代谢旺盛细胞进行平衡生长，体内各成分最为均匀细胞进行平衡生长，体内各成分最为均匀 教学实验和发酵工业都用对数期教学实验和发酵工业都用对数期 的细胞做实验材料的细胞做实验材料,或或“种子种子”11代时代时(generation time):细胞数

7、目增长细胞数目增长1 1倍所需时间倍所需时间 Nt=2n No No 起始细胞数起始细胞数 Nttt时细胞数时细胞数 n 世代数世代数 lg Nt=lgNo+n lg2 n=(lg Nt-lgNo)/lg2k=n/t k=n/t 平均生长速度：世代数平均生长速度：世代数/小时小时 g=g=t/n 平均代时平均代时(繁殖一代所需时间）繁殖一代所需时间）指数期的数学描述指数期的数学描述12某些微生物的代时某些微生物的代时细细 菌：大菌：大 肠肠 杆杆 菌菌 40C 0.35h 40C 0.35h 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 40C 0.43h 40C 0.43h藻藻 类：蛋白核小球藻类：蛋白核小球藻

8、 25C 7.75h 25C 7.75h原生动物：尾状核草履虫原生动物：尾状核草履虫 26C 10.4h 26C 10.4h真真 菌菌:酿酿 酒酒 酵酵 母母 30C 2h 30C 2h133 3）稳定期）稳定期（stationary phase）：恒定期、最高生长期、生长下降期恒定期、最高生长期、生长下降期特点：特点：净增长速度为零净增长速度为零繁殖与死亡速度相等繁殖与死亡速度相等正生长与负生长相等正生长与负生长相等出现稳定期的原因：出现稳定期的原因：营养物尤其是生长因子耗尽营养物尤其是生长因子耗尽 营养物比例失调营养物比例失调 代谢物的积累代谢物的积累 pHpH、DODO、氧化还原电位的变

9、化氧化还原电位的变化144 4）衰亡期）衰亡期（decline phase,death phase）内源呼吸期（内源呼吸期（endogenous respiration phase）内源呼吸内源呼吸:体内贮藏物质酶等一部分细胞物质的氧化体内贮藏物质酶等一部分细胞物质的氧化特点特点:细胞形态多型化细胞形态多型化细胞会发生自溶现象细胞会发生自溶现象(autolysis)出现死亡期的原因：出现死亡期的原因：营养物不足（代谢产物的积累）营养物不足（代谢产物的积累）外界条件恶化外界条件恶化总细胞数活细胞数III培养时间细胞个数第一节 细菌的生长及其特性155.1.3 生长研究微生物生长的方法生长研究微生

10、物生长的方法1 同步培养同步培养是使群体细胞能处于同一生长阶段，并是使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长方式同时进行分裂的生长方式是将一定量的微生物接种在一个封闭的、盛有是将一定量的微生物接种在一个封闭的、盛有一定量液体培养基的容器中，一定量液体培养基的容器中，不补加新营养物不补加新营养物质质,不排出产物不排出产物,保持一定的温度、保持一定的温度、PHPH和溶解氧，和溶解氧，微生物在其中生长微生物在其中生长,也叫也叫间歇培养间歇培养2 分批培养分批培养165.1.3 生长研究微生物生长的方法生长研究微生物生长的方法3 连续培养连续培养在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生在

11、微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以物能以恒定的比生长速率生长恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的并能持续生长下去的一种培养方法一种培养方法恒化器恒化器：营养物质浓度恒定：营养物质浓度恒定恒浊器恒浊器：光电系统控制培养中菌体浓度恒定：光电系统控制培养中菌体浓度恒定17连连续续培培养养示示意意装装置置图图18连续培养的稀释率连续培养的稀释率例例:20ml/h 20ml/h 的流速连续培养的流速连续培养,培养液体积培养液体积1000ml,1000ml,求稀释率求稀释率:D=20ml/h D=20ml/h 1000ml=0.02/h 1000ml=0.02/h稀释率：稀释率：D=f/v

12、FF培养基流速（培养基流速（ml/hml/h）V V 培养液体积（培养液体积（mlml）19连续培养广泛用于酵母菌的生产(含糖废液)乙醇发酵(糖蜜)乳酸发酵石油脱腊污水处理20 菌种退化、设备要求高、原料菌种退化、设备要求高、原料利用略低、回用问题利用略低、回用问题连续培养优点与缺点连续培养优点与缺点优点优点:简化了装料、灭菌（节省动力）、清洗等简化了装料、灭菌（节省动力）、清洗等（蒸汽、人力）单元操作；（蒸汽、人力）单元操作；减少非生产时间；提高设备利用率；减少非生产时间；提高设备利用率；便于自动控制便于自动控制 产品质量稳定产品质量稳定缺点：缺点：21（活性污泥等的混合微生物群，也有类似的

13、生长曲线（活性污泥等的混合微生物群，也有类似的生长曲线)水处理中如何避免水处理中如何避免延滞期延滞期对数期或代谢旺盛的污泥对数期或代谢旺盛的污泥增加接种量增加接种量污泥驯化（以后详细讲）污泥驯化（以后详细讲）微生物维持到微生物维持到对数期对数期可获得高的处理能力，可获得高的处理能力，即分解速度，但处理效果即分解速度，但处理效果 不一定好不一定好菌活力大，不易凝聚和沉淀菌活力大，不易凝聚和沉淀需要充足的营养物，故得不到好的水质需要充足的营养物，故得不到好的水质第一节 细菌的生长及其特性5.1.4 细菌的生长曲线与废水的生物处理细菌的生长曲线与废水的生物处理22处于处于稳定期稳定期污泥虽然生长速度

14、有所下降，但有一污泥虽然生长速度有所下降，但有一定的代谢活性，絮凝沉降性能好定的代谢活性，絮凝沉降性能好。故传统的活性污泥法常运行在这个范围故传统的活性污泥法常运行在这个范围 衰亡期衰亡期只出现在某些特殊的水处理场合只出现在某些特殊的水处理场合 如延时曝气及污泥消化如延时曝气及污泥消化第一节 细菌的生长及其特性23食料食料/微生物微生物代谢速率代谢速率内源呼内源呼吸阶段吸阶段生长率生长率下降阶段下降阶段生长率上升阶段生长率上升阶段（沉降性能好）（沉降性能好）（沉降性能差）（沉降性能差）大多数活性污泥处大多数活性污泥处理系统运行范围理系统运行范围延时曝气，污泥消化延时曝气，污泥消化注意：注意：各

15、个阶段的各个阶段的食物食物/菌菌量比量比(F/M)发生变化，发生变化，相当于活性污泥系统相当于活性污泥系统的污泥负荷的污泥负荷第一节 细菌的生长及其特性微生物微生物代谢速率代谢速率与与食料食料/微生物微生物的关系的关系24 此法通常用来测定样品中所含细菌、此法通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。计数法又分为计数法又分为直接计数直接计数和和间接计数间接计数两类。两类。1 1、计数法、计数法5.1.5 微生物生长量的测定方法微生物生长量的测定方法25这类方法是利用特定的细菌计数板或血细胞计这类方法是利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显

16、微镜下计算一定容积里样品中微生数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点物的数量。此法的缺点不能区分死菌与活菌不能区分死菌与活菌 直直 接接 计计 数数每毫升原液所含细菌数每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数每小格平均细菌数400l000400l000稀释倍数稀释倍数1 1、计数法、计数法262728此法又称此法又称活菌计数法活菌计数法，其原理是每个活细，其原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落以通过生长形成菌落 间间 接接 计计 数数每毫升原菌液活菌数同一稀释度三个每毫升原菌液活菌数同一稀释度三个以上重复平皿

17、菌落平均数以上重复平皿菌落平均数稀释倍数稀释倍数1 1、计数法、计数法2930 例例:稀释度稀释度 10 10-6-6/ml,/ml,形成形成150150个菌落个菌落,即即1.5 x 101.5 x 108 8/ml/ml细胞凝聚不能有效地分散细胞凝聚不能有效地分散平板计数：稀释样品稀释样品,涂于平板表面涂于平板表面,通过计算菌落数通过计算菌落数即可知道样品中活菌数即可知道样品中活菌数.实验要求稀释度实验要求稀释度:30-300:30-300 个菌落个菌落/皿皿 平板计数得到结果称为菌落形成单位平板计数得到结果称为菌落形成单位CFU (colony forming unit)CFU (colo

18、ny forming unit)下列因素导致计数偏低下列因素导致计数偏低不能保证每个菌落来源于一个细胞不能保证每个菌落来源于一个细胞31 然后再把膜放到具有培养液的然后再把膜放到具有培养液的垫上或培养基上垫上或培养基上滤滤 膜膜 培培 养：养：膜过滤膜过滤,截流细菌截流细菌 培养一定时间计算菌落培养一定时间计算菌落32实 验 过 程0.5 um33滤滤 膜膜 培培 养养v应用特定的培养基应用特定的培养基,可得到选择的微生物可得到选择的微生物粪便大肠杆粪便大肠杆菌培养基菌培养基麦芽汁琼脂麦芽汁琼脂 长长出酵母和霉菌出酵母和霉菌远藤氏琼脂远藤氏琼脂普通培普通培养基养基34 DNADNA含量含量 此

19、法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定 微生物湿重微生物湿重 微生物干重微生物干重 蛋白质总量蛋白质总量2、重量法、重量法35蛋白质总量含氮量蛋白质总量含氮量6.256.25蛋蛋 白白 质质 总总 量量 细胞总量蛋白质总量细胞总量蛋白质总量(50%(50%80%(80%(或或65%)65%)蛋白质总量蛋白质总量1.541.54D N A D N A 含含 量量 核酸核酸DNADNA是微生物的重要遗传物质，每个细是微生物的重要遗传物质，每个细菌的菌的DNADNA含量相当恒定，平均为含量相当恒定，平均为8.410-8.410-5ng.5ng.

20、365.2 微生物的生存因子微生物的生存因子 温度对微生物生长的影响：温度对微生物生长的影响：酶的活性酶的活性；细胞膜细胞膜的流动性的流动性；物质的溶解度物质的溶解度微生物对温度变化很敏感微生物对温度变化很敏感高过极限导致死亡：酶、运输载体被破坏，膜高过极限导致死亡：酶、运输载体被破坏，膜崩解；低温：功能受到影响，但化学组分和结构崩解；低温：功能受到影响，但化学组分和结构不一定全受到影响不一定全受到影响5.2.1 温度温度37 微生物有各自的最低、最适和最高生长温度范围微生物有各自的最低、最适和最高生长温度范围 据微生物对温度的生长需求，将微生物分四大类，据微生物对温度的生长需求，将微生物分四

21、大类，嗜冷菌、嗜中温菌、嗜热菌和嗜超热菌嗜冷菌、嗜中温菌、嗜热菌和嗜超热菌5.2.1 温度温度基本温度基本温度 cardinal temperature：最低温度最低温度最适温度最适温度最高温度最高温度38 一种生活在蚊子消化道内的原生动物，一种生活在蚊子消化道内的原生动物，22-27C22-27C在简单培养基中就可以生长在简单培养基中就可以生长,但但在在33-34C33-34C下下,必须向培养基中加金属、必须向培养基中加金属、氨基酸、维生素才能生长。氨基酸、维生素才能生长。一种微生物三个基本温度并非不变，依赖于一种微生物三个基本温度并非不变，依赖于其他因素：其他因素：5.2.1 温度温度39

22、温度对生长速度影响温度对生长速度影响最适温最适温度靠近度靠近最高温最高温度度,而非而非最低温最低温度度40微生物生长温度范围举例微生物生长温度范围举例微生物微生物 最低温度最低温度 最适温度最适温度 最高温度最高温度嗜冷芽孢杆菌嗜冷芽孢杆菌 -10 23-24 28-30 大肠杆菌大肠杆菌 10 37 44嗜酸热硫化叶菌嗜酸热硫化叶菌 60 80 85卓越聚球蓝细菌卓越聚球蓝细菌 70 79 84假丝酵母假丝酵母 0 4-15 15酿酒酵母酿酒酵母 1-3 28 40犁型四膜虫犁型四膜虫 6-7 20-25 33 41五种类型微生物生长温度和最适温度五种类型微生物生长温度和最适温度42嗜嗜 冷

23、冷 菌菌 psychrophile来源：海洋来源：海洋 近年来在南极洲发现古生菌产近年来在南极洲发现古生菌产甲烷菌甲烷菌基本特征：基本特征：0 0o oC C可生长可生长最适生长温度等于、低于最适生长温度等于、低于15C15C最高生长温度最高生长温度20C20C 细胞膜含有大量的不饱和脂肪酸细胞膜含有大量的不饱和脂肪酸43兼兼 性性 嗜嗜 冷冷 菌菌 pschrotroph 0-7C 0-7C 生长生长最适生长温度最适生长温度 20-30C 20-30C最高生长温度最高生长温度 35C 35C污染冷冻食品污染冷冻食品基本特征：基本特征：44嗜嗜 温温 菌菌 mesophile最低生长温度最低生

24、长温度 15-20C 15-20C 生长生长最适生长温度最适生长温度 20-45C 20-45C最高生长温度最高生长温度 约约45C45C基基 本本 特特 征：征：大多数微生物属于这个范围，人类致病大多数微生物属于这个范围，人类致病菌都是嗜温菌，宿主环境菌都是嗜温菌，宿主环境37C37C45嗜嗜 热热 菌菌 thermophile具有高温下发挥功能的热稳定酶和蛋具有高温下发挥功能的热稳定酶和蛋白质合成系统，细胞膜脂类物质饱和白质合成系统，细胞膜脂类物质饱和度高（相比嗜温菌）度高（相比嗜温菌）基本特征：最低生长温度最低生长温度 约约45C 45C 生长生长最适生长温度最适生长温度 55-65C

25、55-65C最高生长温度最高生长温度 70C 70C堆肥、自我升温的干草堆、热水管道、堆肥、自我升温的干草堆、热水管道、温泉等处生长温泉等处生长46超超 嗜嗜 热热 菌菌 hyperthermophile低于低于55C55C通常不能生长通常不能生长少数能在少数能在90C90C以上温度生长；以上温度生长；80-113C 80-113C下生长的原始生物成为超嗜热菌下生长的原始生物成为超嗜热菌基本特征：基本特征：47100C 100C 以上温度条件下的微生物以上温度条件下的微生物有证据表明，有证据表明，113 C 113 C 下生长繁殖；下生长繁殖；很可能在更高的温很可能在更高的温度下生长繁殖；度下

26、生长繁殖；265p/460C 265p/460C 海水不沸腾海水不沸腾超嗜热菌研究超嗜热菌研究科学和应用价值极大科学和应用价值极大48细细 菌：菌：中性或偏碱性中性或偏碱性 放放 线线 菌：菌：中性偏碱性中性偏碱性酵母菌霉菌：酵母菌霉菌：酸性酸性污水净化处理：污水净化处理：瀑气池瀑气池pH 6.58.5有机固体废物：有机固体废物：pH 58 嗜嗜 酸酸 菌菌 acidophile acidophile pH 0-5.5 嗜中性菌嗜中性菌 neutrophile neutrophile 嗜嗜 碱碱 菌菌 alkalophile alkalophile 每种微生物都有其生长pH 范围和最适pH5.

27、2.2 pH49一般好氧微生物：一般好氧微生物：0.30.40.30.4伏，伏，0.10.1伏伏兼性厌氧：兼性厌氧：0.10.1伏，好氧；伏，好氧；0.10.1伏，厌氧伏，厌氧专性厌氧：专性厌氧：-0.2-0.25-0.2-0.25伏，伏，产甲烷菌：产甲烷菌：-0.3-0.4-0.3-0.4伏伏影响因素：氧分压影响因素：氧分压 环境中的环境中的pHpH 可用一些还原剂控制可用一些还原剂控制5.2.3 氧化还原电位氧化还原电位501 1 专性好氧微生物专性好氧微生物:氧分压为氧分压为0.20.2个大气压个大气压2 2 微量好氧微生物微量好氧微生物:氧分压为氧分压为0.003-0.20.003-0

28、.2个大气压个大气压3 3 耐氧厌氧微生物：耐氧厌氧微生物：4 4 兼性厌氧微生物：兼性厌氧微生物：5 5 厌氧微生物：氧分压小于厌氧微生物：氧分压小于0.0050.005个大气压个大气压5.2.4 溶解氧溶解氧5.2.5 太阳辐射太阳辐射5.2.6 水的活度与渗透压水的活度与渗透压5.2.7 表面张力表面张力515.3 5.3 其它不利因素对微生物影响其它不利因素对微生物影响（2）电离辐射：能使被照射的物质产生电离作用）电离辐射：能使被照射的物质产生电离作用1 紫外辐射和电离辐射紫外辐射和电离辐射（1）紫外辐射）紫外辐射 以以260nm260nm左右紫外线的杀菌力最强左右紫外线的杀菌力最强

29、杀菌机理是作用核酸杀菌机理是作用核酸 穿透力差穿透力差 光复活现象光复活现象辐射机理引起水分子的分解辐射机理引起水分子的分解5.3.1 物理因素物理因素52 极端高度：杀死微生物极端高度：杀死微生物 极端低温：抑制微生物生长极端低温：抑制微生物生长 应应 用：高温杀菌用：高温杀菌2 超声波：频率大于超声波：频率大于20,000赫兹，人耳听不见赫兹，人耳听不见具有强烈的生物学作用，几乎所有具有强烈的生物学作用，几乎所有的细菌都能被超声波破坏的细菌都能被超声波破坏 杀菌机理杀菌机理应用应用3 极端温度极端温度:超高温、超低温超高温、超低温,主指超高温的影响主指超高温的影响4 干干 燥燥531 重金

30、属重金属2 极端极端 pH3 若干有机物若干有机物 醇、醛和表面活性剂醇、醛和表面活性剂4 抗生素对微生物的影响抗生素对微生物的影响5.3.2 化学因素对微生物的影响化学因素对微生物的影响54&微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养(供实验课供实验课)1无菌技术无菌技术2用固体培养基分离纯培养用固体培养基分离纯培养3用液体培养基分离纯培养用液体培养基分离纯培养4单细胞单细胞(单孢子单孢子)分离分离5选择培养分离选择培养分离6二元培养物二元培养物7微生物的保藏技术微生物的保藏技术 55v无菌技术无菌技术微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。因此，在

31、微生物的研究及应且无处不在。因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的的“纯洁纯洁”，防止其他微生物的混入。，防止其他微生物的混入。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为其他微生物污染的技术被称为无菌技术无菌技术(aseptic technique)，它是保证微生物学研它是保证微生物学研究正常进行的关键。究正常进行的关键。56微生物培养的

32、常用器具及其灭菌微生物培养的常用器具及其灭菌试管、玻璃烧瓶、平皿试管、玻璃烧瓶、平皿(culture dish，petri dish)等是最为常用的培养微等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须生物的器具，在使用前必须先行灭菌先行灭菌，使容器中不含任何生物。使容器中不含任何生物。培养微生物的营养物质培养微生物的营养物质 称为称为培养基培养基(culture medium)(culture medium)可以加到器皿中可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。无菌的器具中。57最常用的灭菌方法是最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌，它可

33、以杀灭所有的生物，包括最耐热它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌高温干热灭菌58为了防止杂菌，特别是空气中的杂为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞棉花塞，也可采用各种也可采用各种金属、塑料及硅胶帽金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。其他微生物不能通过。

34、平皿平皿是由正反两平面板互扣而成，是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。的污染而设计的。59接种操作接种操作用接种环或接种针分离微生物，或在无菌用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究一个培养容器进行培养，是微生物学研究中中最常用的基本操作最常用的基本操作。由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此中的其他微生物污染，因此微生物实验的微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行所

35、有操作均应在无菌条件下进行，其要点，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作，或在是在火焰附近进行熟练的无菌操作，或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作60v用固体培养基分离纯培养用固体培养基分离纯培养 不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌，以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养61所谓所谓平板，平板，即即培养平板培养平板(culture(culture plate)plate)的简称，的简称，它是指熔化的固体它是指

36、熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。盛有固体培养基的平皿。固体培养方法可将单个微生物分离固体培养方法可将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。和固定在固体培养基表面或里面。62固体培养基固体培养基(用琼脂或其他凝胶物用琼脂或其他凝胶物质固化的培养基质固化的培养基)，可使每个孤立，可使每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成的活微生物体生长、繁殖形成菌落菌落，形成的菌落便于移植。形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。培养基是琼脂固体培养基平板。KochKoch建立的建

37、立的平板分离微生物纯培养平板分离微生物纯培养的技术的技术简便易行，简便易行，100100多年来一直多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。是各种菌种分离的最常用手段。63v稀释倒平板法稀释倒平板法(pour plate method)v涂布平板法涂布平板法(spread plate method)v平板划线分离法平板划线分离法(streak plate method)v稀释摇管法稀释摇管法(dilution shake culture method)64稀释倒平板法稀释倒平板法待分离的材料用无菌水作一系列的稀释，待分离的材料用无菌水作一系列的稀释，取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至取不同稀释液少

38、许，与已熔化并冷却至5050左右的琼脂培养基混合，摇匀后，左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间，可能出现在平板表面或琼脂培定时间，可能出现在平板表面或琼脂培养基中的养基中的单个菌落单个菌落，这个菌落可能就是，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便该单个菌落，或重复以上操作数次，便可可得到纯培养得到纯培养。65涂布平板法涂布平板法 在微生物学研究中更常用的纯种在微生物学研究中更常

39、用的纯种分离方法是涂布平板法。分离方法是涂布平板法。其做法其做法是是先将已熔化的培养基倒人无菌平皿，先将已熔化的培养基倒人无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。培养后挑取单个菌落。666768v平板划线分离法平板划线分离法 用接种环以无菌操作沾取少许待用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式

40、的平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。板表面得到单菌落。6970717273v稀释摇管法稀释摇管法 对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培稀释摇管培养法养法进行。进行。将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后，冷却并保持

41、在使琼脂熔化后，冷却并保持在5050左右，左右，用这些试管进行梯度稀释待分离材料，用这些试管进行梯度稀释待分离材料，试管均匀，冷凝，倾注一层灭菌液体石试管均匀，冷凝，倾注一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的培养后，菌落形成在琼脂柱的中间，挑取和移植单菌落。中间，挑取和移植单菌落。7475v用液体培养基分离纯培养用液体培养基分离纯培养 接种物在液体培养基中依序稀释，以接种物在液体培养基中依序稀释，以达高度稀释的效果，使一支试管中分配达高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。如果稀释后的多数试不到一个微

42、生物。如果稀释后的多数试管中没有微生物生长，则有微生物生长管中没有微生物生长，则有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。的试管得到的培养物可能就是纯培养物。采用稀释法进行液体分离，必须在同一采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数个稀释度的许多平行试管中，大多数(一般应超过一般应超过95%)95%)表现为不生长。表现为不生长。76v单细胞单细胞(单孢子单孢子)分离分离 采取显微分离法从混杂群体中直接分离采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为培养，称为单细胞单细胞(单孢子单孢子)分离法分离

43、法。单细胞分离法的单细胞分离法的难度难度与细胞或个体的大与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。动物较容易，个体很小的细菌则较难。单细胞分离法对操作技术有比较高的要单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，求，多限于多限于高度专业化的科学研究中采高度专业化的科学研究中采用。用。77v选择培养分离选择培养分离如果某种微生物的生长需要是已知的，也如果某种微生物的生长需要是已知的，也可以设计一套特定环境使之特别适合这种可以设计一套特定环境使之特别适合这种微生物的生长，因而能够从自然界混杂的微生物的生长，因而能够从自然界混杂的微

44、生物群体中把这种微生物选择培养出来，微生物群体中把这种微生物选择培养出来，即使在混杂的微生物群体中这种微生物可即使在混杂的微生物群体中这种微生物可能只占少数。这种通过选择培养进行微生能只占少数。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为物纯培养分离的技术称为选择培养分离选择培养分离。可利用选择培养基进行可利用选择培养基进行直接分离直接分离或或富集培富集培养养。78利用选择培养基进行直接分离利用选择培养基进行直接分离主要根据待分离主要根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件微生物的特点选择不同的培养条件,得到纯培养得到纯培养物。物。富集培养富集培养主要是指利用不同微生物间生命活动主要是指利用

45、不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。界中分离到所需的特定微生物。富集条件富集条件可据可据分离的微生物的特点从物理、化学、生物及综分离的微生物的特点从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择，如温度、合多个方面进行选择，如温度、pHpH、紫外线、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等许多方面。高压、光照、氧气、营养等等许多方面。79v二元培养物二元培养物

46、 只有一种微生物的培养物称为只有一种微生物的培养物称为纯培养纯培养物物，含有二种以上微生物的培养物称，含有二种以上微生物的培养物称为为混合培养物混合培养物，而如果培养物中只含，而如果培养物中只含有二种微生物，而且是有意识地保持有二种微生物，而且是有意识地保持二者之间的特定关系的培养物称为二者之间的特定关系的培养物称为二二元培养物元培养物。例如二元培养物是保存病。例如二元培养物是保存病毒的最有效途径。对于这些生物，二毒的最有效途径。对于这些生物，二元培养物是在实验室控制条件下可能元培养物是在实验室控制条件下可能达到的最接近于纯培养的培养方法。达到的最接近于纯培养的培养方法。80v微生物的保藏技术

47、微生物的保藏技术传代培养保藏传代培养保藏冷冻保藏冷冻保藏干燥保藏法干燥保藏法81通过分离纯化得到的微生物纯培养通过分离纯化得到的微生物纯培养物，必须通过各种保藏技术使其在物，必须通过各种保藏技术使其在一定时间内一定时间内不死亡不死亡，不会被其他微不会被其他微生物污染，不会因发生变异而丢失生物污染，不会因发生变异而丢失重要的生物学性状，重要的生物学性状，否则就无法真否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺正保证微生物研究和应用工作的顺利进行。利进行。菌种或培养物保藏菌种或培养物保藏是一项最重要的是一项最重要的微生物学基础工作，微生物菌种是微生物学基础工作，微生物菌种是珍贵的自然资源，具有重要意

48、义。珍贵的自然资源，具有重要意义。82菌种保藏菌种保藏就是根据菌种特性及保就是根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延特定的条件，使其存活而得以延续。续。菌种保藏机构：菌种保藏机构：中国微生物菌种中国微生物菌种保藏委员会保藏委员会(CCCCM)，中国典型中国典型培养物保藏中心培养物保藏中心(CCTCC)，美国美国典型菌种保藏中心典型菌种保藏中心(ATCC)，世界世界菌种保藏联合会菌种保藏联合会(WFGC)。83v传代培养保藏传代培养保藏常用的有常用的有琼脂斜面琼脂斜面、半固体琼脂柱半固体琼脂柱及及液体培养液体培养等。等。选择使用选择使

49、用适宜的培养基适宜的培养基，并在，并在规定规定的时间内进行移种的时间内进行移种。传代培养十分繁琐，容易传代培养十分繁琐，容易污染污染，特，特别是会由于菌株的别是会由于菌株的自发突变自发突变而导致而导致菌种衰退菌种衰退，使菌株的形态、生理特使菌株的形态、生理特性、代谢物的产量等发生变化性、代谢物的产量等发生变化 84v冷冻保藏冷冻保藏使微生物处于冷冻状态，使微生物处于冷冻状态，代谢作用代谢作用停止停止以达到保藏的目的。以达到保藏的目的。微生物细胞对微生物细胞对低温敏感低温敏感，可用速冻、，可用速冻、快速升温和添加各种保护剂等手段。快速升温和添加各种保护剂等手段。液氮保藏或液氮保藏或-70-70低

50、温保藏。低温保藏。用用普通冰箱普通冰箱冷冻保存菌种的效果往冷冻保存菌种的效果往往远低于低温冰箱，应注意往远低于低温冰箱，应注意经常检经常检查保藏物的存活情况，随时转种查保藏物的存活情况，随时转种 85v干燥保藏法干燥保藏法水分对各种生化反应和一切生命水分对各种生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥，尤活动至关重要，因此，干燥，尤其是深度干燥是微生物保藏技术其是深度干燥是微生物保藏技术中另一项经常采用的手段。中另一项经常采用的手段。沙土管保存沙土管保存和和冷冻真空干燥保藏冷冻真空干燥保藏是最常用的二项微生物干燥保藏是最常用的二项微生物干燥保藏技术。技术。86u沙土管保存沙土管保存主要适用于产