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1、解磷细菌 K_3的 GFP标记与在土壤中定殖及对玉米生长效 应研究 李晓婷 学位授予单位：南京农业大学；学科专业：植物营养 摘 要 本文采用 GFP标记解磷细菌 K3获得了标记菌株 K3GFP,通过液体摇瓶试验、根盒试验和盆栽试验，研 究了其在 NBRIP培养液中解磷效果、根际土壤中的定殖状况及对玉米生长的影响。主要获得了如下结果： (1) 将构建的含有假单胞菌属自身启动子及绿色荧光蛋白 (GFP)基因的质粒 pTRGFP电转至解磷细菌 K3中 ,获得了发光稳定的标记菌株 K3GFP。 激光共聚焦显微镜观测和质粒检测显示菌株 K3GFP具有较强的 荧光。 (2) 在 LB液体培养基中的生长曲线
2、表明 ,K3GFP进入对数期的时间比出发菌株 K3稍慢； 7d液体摇瓶 试验表明，菌株 K3GFP对 Ca3(P04)2的解磷量在第 4d达到最高 774 u g / mL,而菌株 K3在第 3d就达到了最 大含量 780 u g / mL,两个试验均证明 pTRGFP质粒的转入对 K3菌株解磷能力稍有影响。标记菌株 K3GFP 施入自然土壤，其数量在 l d后为 5.47X 106 2.40X 106CFU / g 土左右，在 40d后保持在 5.0X 103 CFU / g 土左右 ,说明解磷细菌 K3GFP可以在自然土壤中定殖。 (3) 玉米苗期根盒试验结果表明，菌株 K3GFP在根际土
3、的定殖数量比非根际土多 ,但根际土和非根际土 中的定殖数量随着时间延长而下降 ,30d后根际土中标记菌株 K3GFP的数量维持在 104 CFU / g 土左右。通 过激光共聚焦扫描显微镜检测玉米根表中菌株 K3GFP的定殖情况发现，接种处理表现出明显的强荧光。标 记菌株 K3GFP促进了苗期玉米的生长，玉米的株高、鲜重、干重分别比对照增加 4.58%、 6.61%、 7.89%,植 株吸磷量增加了 29.74%,说明接种解磷细菌促 进了玉米生长及其对磷的吸收。 (4) 盆栽试验结果表明：土壤中 K3GFP菌株的数量随玉米的生长呈下降趋势，苗期与大喇叭口期基本维 持在 104 105CFU/g
4、 土。 M+K3与 M+K3G处理增加了土壤中细菌与放线菌的数量，抑制了真菌的生长。 DGGE图谱及群落相似性指数分析显示 ,M+K3以及 M+K3G处理与对照微生物多样性差异较大，解磷细菌可 能导致土壤微生物群落发生较大变化。在玉米各个生育期 ,M+K3与 M+K3G处理的植株株高、生物量、全 磷含量以及土壤有效磷含量与对照差异显著 ,M+K3与 M+K3G处理与有机肥处理差异显著 ,M+K3与 M+K3G处理间在有的时期差异显著，说明在盆栽试验中，质粒 pTRGFP的导入对出发菌株的解磷效果有些影 响，标记菌株 K3GFP的解磷效果比出发菌株 K3的解磷效果较弱 ,同时也说明解磷细菌提高了
5、土壤中有效磷 含量，增加了玉米植株磷累积量，促进了玉米生长。 关键词 ：解磷细菌 ;GFP;玉米 ;定殖 中图分类号： S144.9;S513 Abstract Strain K3GFP was obtained through tagging the phosphate-solubilizing bacteria K3 (PSB) with green fluorescent protein (GFP). Liquid fermentation culture and pot experiment were carried out in this paper to study the beh
6、avior of labelled strain K3GFP in NBRIP medium and soil, furthermore, to inspect its effect on dissolving phosphate and promoting the growth of corn. The main conclusion can be summed up as followed: (1) The plasmid pTRGFP was constructed by introducing a gene code green fluorescent protein (GFP) 导师
7、 :徐阳春 ; 导师单位 :南京农业大学 segment behind a promoter of Pseudomonas and was transformed into K3 by electroporation method. The conjugant strain K3GFP with steady fluorescence was acquired. Both fluorescent microscope and plasmid analysis testified the success of the electroporation. (2) Comparison of the
8、determined growth curves between the gfp-labelled strain K3GFP and the wild type strain K3 showed that K3GFP strain sustained a little longer duration in the lag phase. Meantime, available P concentration was tested by 7-day liquid fermentation culture, the P content reached the peak at the 4th day
9、for the labeling strain K3GFP with 770|ig/ml while the wild strain achieve its most at the 3rd day with 780|ig/ml. Both results demonstrated that phosphate-solubilizing ability of the wild type strain was affected little after lagging. The total population of K3GFP strain was 5.47X 106 CFU/g 2.40X 1
10、06 CFU/g soil from 10 to 28 days， and decreased to about 5.00 X 103 CFU/g soil after 40 days in natural soil. The result indicated the K3GFP had strong colonization ability in soil. (3) Over 4-week rhizobox experiment of corn seedlings showed the population of K3GFP strain was decreasing in rhizosph
11、ere and bulk soil with time going, and the population in rhizosphere was higher than that in bulk soil. After four weeks of growth, the K3GFP inoculated in the rhizosphere colonized at a density of 104 CFU/g soil. Detecting K3GFP strain with the laser scanning confocal microscopy (LSCM), there has s
12、trong fluorescence in corn rhizosphere indicating the presence of recombinant bacteria. The growth of com with inoculated bacteria was significantly improved. Compared with un-inoculated control, inoculated treatment with K3GFP increased the plant height, fresh weight, dry weight and P uptake of you
13、ng seedlings by 4.58%,6.61%,7.89% and 29.74% respectively. This suggested that phosphate solubilizing bacteria may have played an important role in promoting plant growth and stimulating P dissolving. (4) In the pot experiment, the density of marked strain K3GFP was decreasing from seedling stage to
14、 mature stage in both rhizosphere and bulk soil. The density of K3GFP in the seedling stage and big trumpet stage sustained about 104 105 CFU/g soil and was little in the spinning stage and mature stage. Organic fertilizer and PSB (M+K3 and M+K3G) treatments could promote tiie growth of actinomyces
15、and bacteria and restrain tiie growth of fungi in soil. The result showed that the application of PSB can improve soil fertility. Analyzed through DGGE systems and similarity coefficient of soil microbial populations, M+K3 and M+K3G treatments were more plentiful than control treatment. It indicated
16、 that the PSB have remarkable effect on the bacterial community in soil. Pot experiments were taken to evaluate the effect of K3 and K3GFP on corn growth. Compared with the control, all the other treatments showed significant difference in plant height, dry weight, P accumulation and soil available
17、P content. M+K3 and M+K3G treatments had significant difference compared with manure treatment. The results demonstrated that PSB (K3 and K3G) increase the soil available P content, promote P uptake and the growth of corn. There were also remarkable differences between M+K3 and M+K3G treatments in s
18、ome stages. The result indicated the plasmid pTRGFP have influence on the phosphate-solubilizing ability of K3 Key Words： phosphate-solubilizing bacteria (PSB); green fluorescent protein (GFP); corn; colonization 目录 第一章文献综述 6 1研究意义 6 2溶磷微生物与植物生长 6 2.1溶磷微生物 6 2.1.1解磷微生物的种类与生态分布 7 2.1.2解磷微生物的解磷机理 7 2.
19、1.3解磷微生物的解磷能力研究 8 2.2根际 -解磷微生物 8 2.3根际 -解磷微生物系统中解磷菌对植物的生长影响 9 2.3.1固定氮素，释放难溶性矿质中的营养元素 ,提高植物生长 9 2.3.2提高植物的抗逆性，提供了物理屏障，减少病原菌侵害，减少毒性 10 2.3.3产生植物激素 10 3溶磷微生物的根际定殖 10 3.1影响溶磷微生物定殖的因素 10 3.2溶磷微生物根际定殖的检测 11 4植物根际 -微生物系统中绿色荧光蛋白的应用 12 4.1 绿色劳光蛋白 (green fluorescent protein GFP)的性质 13 4.2绿色荧光蛋白的优缺点 14 4.3绿色荧
20、光蛋白的标记方式 15 4.3.1表达质粒标记 15 4.3.2染色体同源重组 16 4.3.3转座重组标记 16 4.4绿色荧光蛋白标记菌株的检测方法 16 4.4.1荧光显微镜 17 4.4.2激光共聚焦扫描显微镜 17 4.5绿色荧光蛋白的应用 18 4.5.1 GFP标记微生物后对微生物生理生化的影口向 19 4.5.2 GFP标记微生物在作物根际定殖研究 20 5技术路线 22 第二章解磷细菌 K_3的 GFP标记菌株的构建及其解磷能力比较 24 1材料与方法 24 1.1供试材料 24 1.2方法 25 2结果与分析 27 2.1标记菌株 K_3GFP的构建与荧光检测 27 2.2
21、标记菌株 K_3GFP的质粒检测 28 2.3标记菌株 K_3GFP的稳定性 28 2.4菌株 K_3与 K_3GFP的生长动态的比较 29 2.5菌株 K 3与 K 3GFP的解磷效果比较 29 2.6标 记 菌 在 土 壤 中 的 存 活 31 3讨论 32 4小结 33 第三章标记菌株在玉米苗期根际定殖的研究 34 1材料与方法 34 1.1试验材料 34 1.2试验方法 35 1.2.1玉米的根盒栽培 35 1.2.2采样时间与采样方法 35 1.2.3测定项目及方法 35 2结果与分析 36 2.1接种标记菌株 K_3GFP对玉米生长的影响 36 2.2接种标记菌株 K_3GFP对土
22、壤有效磷与玉米全磷含量的影响 37 2.3玉米苗期标记菌株 K_3GFP在土壤中的变化 . 37 2.4玉米苗期标记菌株 K_3GFP在根际土中的定殖情况 38 3讨论 39 4小结 40 第四章标记菌株在玉米生育期的动态变化及对玉米生长的影响 42 1材料与方法 42 1.1试验材料 42 1.2试验方法 42 1.2.1盆栽试验方案 42 1.2.2采样时间及方法 43 1.2.3测定项目与方法 43 1.2.3.1植株地上高度测定与干重测定 43 1.2.3.2植株磷含量测定与土壤有效磷含量测定 43 1.2.3.3 土壤中解磷细菌的分布 43 1.2.3.4 土壤中标记解磷细菌的分布
23、43 1.2.3.5 土壤中微生物群落测定 43 1.3数据处理方法 45 2结果与分析 45 2.1标记菌株 K3GFP在玉米不同生育期根际土与非根际土中的变化 45 2.2解磷细菌在玉米根际的分布 45 2.3不同处理在苗期与成熟期对可培养微生物区系的影响 46 2.4米苗期各处理对微生物群落相似性的影响 47 2.4.1苗期土壤微生物群落 DGGE图谱分析 48 2.4.2苗期根际土与非根际士的微生物群落相似性分析 49 2.5不同处理对株高的影响 51 2.6不同处理对玉米地上部与地下部的生物量 51 2.7不同处理对土壤有效磷含量的影响 53 2.8不同处理对玉米植株磷累积量的影响
24、53 3讨论 55 4小结 57 全文总结 58 参考文献 60 第一章文献综述 1研究意义 磷是作物生长发育的必需的重要的营养元素之一，植物体内几乎许多重要的有机 化合物都含有磷。但是目前我国约 75%的土壤缺磷 (张磊等， 2005)，土壤中磷主要以 难溶的矿物态存在。可溶性磷肥施入土壤后大部分也很快发生专性吸附或化学沉淀固 定，转变成为植物难以吸收利用的无效态磷。近年来伴随着作物产量的提高，磷肥的 使用量越来越大，而作物对磷肥的当季利用率一般只有 5%10%，加上作物的后效， 也不超过 25% (鲁如坤， 2003)。因此释放这些被固定在土壤中的磷，对于降低磷肥 的用量以及提高土壤中磷的
25、有效性具有重要的 意义。 土壤微生物的活动对于土壤磷的转化和有效性有很大的影响 （ Hilda and FragaJ999)。 研究表明土壤中存在大量的解磷菌或溶磷菌 （ Katznelson et al， 1962; Raghuetal， 1993),它们能够将被土壤固定的矿物态磷释放出来促进植物生长。目前 解磷微生物的研究主要集中在解磷微生物的分离与筛选 （ Heekyungetal,2005)，解磷 微生物的溶磷能力 （ Chen et al， 2006; Son et al， 2006)，解磷菌制剂的使用效果 （ Ghulam， 2007;周鑫斌 ,2003;郜春花， 2006)等方面
26、。问题是这些溶磷能力很强的微生物回接 到土壤中能否在土壤中定殖？其生活特征如何？对土壤中的土著微生物是否有影 响？所以必须对施入土壤中微生物进行跟踪实验。但是用常规方法如显微技术、平板 培养技术等很难准确地进行跟踪实验。目前分子标记技术提供了一个有效的研究手 段，利用发光基因标记，跟踪人工释放的微生物的生物活性，可以检测解磷微生物在 土壤、植物根部以及楦物内部的定殖动态。本文利用於 P基因标记解磷细菌 K3,对其 在植物根际微区域的定殖情况进行研究，为解磷微生物的应用技术提 供一个理论基 础。 2溶磷微生物与植物生长 2.1溶磷微生物 磷是植物生长发育必需的矿质元素之一，尽管土壤中全磷含量很高
27、，但可以提供 给植物生长发育的有效磷含量可能很低。影响土壤中磷利用率的因素很多，其中土壤 微生物的活动对土壤中磷的转化与有效性有很大的影响。国内外大量的研究证明土壤 中存在许多微生物，能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态，具有这 种能力的微生物叫做解憐菌或溶磷菌 （ phosphate-solubilizing microorganisms)(王光华， 2003)。 2.1.1解磷微生物的种类与生态分布 土壤是微生物生长与繁殖的良好环境场所。土壤中解磷微生物种类丰富，数量较 多，主要包括细菌、真菌和放线菌等。有人根据解磷微生物分解底物不同将它们划分 为能够溶解有机磷的有机磷微生物与
28、能够溶解无机磷的无机磷微生物，实际上很难准 确将它们区分开来。目前报道的具有解磷作用的细菌有芽孢杆菌属、假单 胞菌属（ /1/办 /0似）、土壤杆菌属（乂 7*65C)、过酸 （ pH102?11 仏土， 184时检测不到标记菌株。土壤中 0 2(： 11 土、 2 4(： 111土 中含有标记菌株，可能是由于标记菌株 K3GFP随着玉米根系的延伸而向下散布，说明 标记菌株 K3GFP可能是从种子向根尖方向扩散的。韦兵 （ 2006)等研究表明标记菌株 还是集中在 10 cm根段以内， 10 cm以下根段检测不到标记菌株 JK45-L， 而且标记菌株 的定殖密度顺着根向下呈现出逐渐降低的趋势，
29、即标记菌株在离小麦种子越近的根段 定殖密度越高，在小麦根尖部位都未检测到发光菌。说明了小麦种子对标记菌株具有 较高的亲和性，从而使接种菌株在靠近小麦种子的部位形成优势菌群，具有较高的定 殖密度。 表 3-3玉米苗期标记菌株 K3GFP在土壤中的变化 （ CFU/g土） Table 3-3 K3GFPs numbers in the soil of com seeding (CFU/g soil) 采样时间 Sampling time 根际土 Rhizosphere soil 0 2cm 土 0 2cm soil 2 4cm 土 2 4cm soil 6d 3.65xl 7 3.83xl 3 2
30、xl 2 12d 1.46xl 7 3.97xl03 2xl 2 18d 1.07xl 6 l.lxl 3 0 24d 9.2x1 5 0 0 30d 3.77x1 4 0 0 2.4玉米苗期标记菌株 K3GFP在根际土中的定殖情况 玉米苗在 6 d后检测，经过接种处理的玉米根际的数量为 3.65xl 7CFU/g 土。图 3-2是玉米根系上部根段制作标本样片，采用激光共聚焦扫描显微镜检测 K3GFP在玉 米根表标定殖情况的照片。由图可见，接种处理表现出明显的强荧光，而对照并没有 图 3-2玉米苗期标记菌株 K3GFP在根表土中的定殖图 （ A:对照； B:处理） Fig 3-2 The ph
31、otos of K3GFP on the rhizosphere of com seedling (A: CK; B: Treatment) 绿色荧光，只有较弱的自发荧光。许多研究表明菌株多聚集于细胞之间的缝隙或表皮 的凹陷部位，还有待于 实验的 进一步验证。 3讨论 玉米苗期根盒实验分析，接种标记菌株 K3GFP促进了苗期玉米的生长，增加了玉 米的株高、鲜重、干重以及提高了玉米植株吸磷量。接种标记菌种处理的玉米的株高、 鲜重与干重比对照分别增加了 4.58%、 6.61%、 7.89%,玉米吸磷量增加了 29.74%。接 种标记菌株处理同样增加了土壤中有效磷含量。说明接种解磷细菌后，表现出较
32、好的 溶磷效果，且增加了玉米对磷的吸收。 接种微生物施入土壤要发挥其作用效果的一个前提条件就是要能够进行有效地 定殖，但影响外来菌株根际定殖的因素很多。首先是土壤或根系分泌的营养物质对接 种微生物的影响。当室内分离培养微生物释放土壤中后，营养条件发生巨大的变化， 一方面土壤中能被微生物利用的营养物质很少 （ Habte， 1975; Miller， 1990; Nybroe， 1995)，而且土壤中许多的有机碳不能被直接利用或被分解利用。根不同部位渗出的 分泌物如细菌可利用简单的营养物质也可利用复杂的糖或有机酸，研究证明，专化的 识别作用促进了一些假单胞菌对菜豆根圈的定殖。其次土壤中土著微生物
33、对接种微生 物的影响也是比较大的，可能是未灭菌土壤中土著微生物与标记菌株在定殖空间及养 分上竞争，影响标记菌株的定殖密度。韦兵 （ 2006)等研究灭菌土壤中JK45-L的数 量下降的速度明显要比不灭菌土壤中慢，接种菌株的定殖水平也较未灭菌土壤的定殖 水平高，王平 （ 2000)等的研究也表明荧光假单胞菌的发光酶基因标记菌株 X16L2在 灭菌土壤中的存活量要比不灭菌土壤中高得多。植物种类、土壤质地、酸碱度、土壤 含水量、温度等土壤条件 （ Rattmy， 1993)也可能会影响接种微生物的定殖水平。邱 珊莲 （ 2005)等研究表明 DLLBR-45在较为肥沃的菜园土中的定殖水平要远远高于在
34、 茶场土中的定殖水平。接种菌株在植物根系不同部位其定殖密度是不一样的 （ 王平等 2000)。接种菌株在根表的定殖密度要比根际定殖密度 33高，且在小麦上部根段的定 殖密度比下部根段的定殖密度高。接种的微 生物在植物根际的定殖是一个非常复杂的 动态过程，受到诸多因素的影响，因而有必要进行更深入的研究，以揭示影响标记菌 株在植物根际定殖的关键因子。本实验结果表明，标记菌株 K3GFP在土壤中或根系中 随着天数增长菌株定殖数量下降，可能是由于在贫瘠的土壤环境条件下，导致数量持 续下降。非根际土比根际土的营养物质更贫瘠，因此定殖的数量更少。 利用荧光显微镜监测 GFP标记菌株施入土壤后的定殖、分布及
35、 存活状态等，荧光 显微镜的监测会受到楦物和土壤自身荧光的干扰和物镜焦距的限制。目前激光共聚焦 显微镜出现为研究工作者提供 了有效地研究工具，它对 GFP标记菌株在土壤与植物的 分布观察有明显的优势。土壤土著菌因没有荧光而观察不到，所以土著菌不会千扰检 测。张磊 （ 2005)等研究利用激光共聚焦扫描显微镜在波长 448nm光激发下 ， GFP 标记菌青霉菌产生了较强的绿色荧光，菌体的形态清晰可。利用 GFP标记能够有效 地区分接种的标记菌株和土壤与植物中存在的土著菌，有利于实时、原位的观测目标 菌的存活状态与直接估算菌群的数量。王平 （ 2000)等研究小麦根系的细菌多定殖于 聚集于细胞之间
36、的缝隙、表皮的凹陷部位和次生根毛的基部及伤口处，可能因为这些 部位能分泌更多的营养物质，有利于细菌的定殖 。Normander (1999)等研究 GFP标 记的荧光假单胞菌 DR54-BN14施入土壤 14d后在大麦根际的定殖情况，在短距离 （ 30 pm)内可以观察到大量的活性菌株 DR54-BN14聚集，虽然观察到的许多细胞是小 的粒状的。 DR54-BN14菌株的细胞多出现在上皮细胞的裂缝处，并且这些绿色荧光 细胞多成簇状聚集在一起，他们还以土著细菌联系结合在一起。标记菌株与土著细菌 多聚集在一起 可能是由于化合物扩散信号的影响，标记菌株聚集在裂缝处可能是由于 裂缝处分泌营养物质或是化
37、学物质。 4小结 接种解磷细菌 K3GFP增加苗期玉米的株高与生物量，提高土壤中可溶性磷含量以 及增加植株的吸磷量。通过苗期 30 d的取样测定玉米根围的标记菌株的数量，标记 菌株 K3GFP的数量呈下降的趋势，且根际土的数量高于非根际土数量。激光共聚焦扫 描显微镜观察玉米根表的解磷细菌 K3GFP的定殖情况，标记菌株表现出亮的绿色荧光， 解磷细菌在根表多聚集在一起定殖。 第 S1期 李晓婷：解磷细菌 K 3的 GFP标记与在土壤中定殖及对玉米生长效应研究 D043-13-41 第四章标记菌株在玉米生育期的动态变化 及对玉米生长的影响 微生物有机肥料是利用功能微生物和有机物质及无机元素复合制成
38、的一种复合 性肥料（李元芳， 2001)，是一种以微生物活动使农作物得到特定肥料效应的制剂。 微生物有机肥不仅能提高土壤中植物营养元素的供应水平，而且通过其所含微生物的 生命活动产生的代谢物如酸类物质促进土壤中难溶性物质的溶解或者产生的代谢物 质如激素类物质与碳水化合物等促进植物对营养元素的吸收利用，提高土壤肥力，提 高植物的产量以及减轻植物 “ 的病虫危害 （ 葛诚， 1996; Dhaliwal， 1992)。微生物肥 料作为生物技术发展和农业生产的一类重要肥源，以其对农作物生长的多种功能作用 的特点，目前已成为国内外研究的热点。随着微生物有机肥研究的深入，解磷菌作为 功能微生物与有机肥吸
39、附制成的微生物有机肥料应用于大田，鲁杰 （ 2009)等研究表 明生物有机肥提高水稻的千粒重以及籽粒中铁、钙和镁的含量。本文主要是利用牛粪 与氨基酸 （ 1:1)有机肥吸附解磷 细菌制成的微生物有机肥料，通过研究菌株在根际与 非根际土的数量，研究解磷细菌与有机肥结合是否有利于菌株的生存，以及在玉米根 际定殖情况和这种微生物肥料对玉米生长和植株磷的累积量的影响。 1 材 料 与 方 法 1.1试验材料 供试土壤为采自江苏淮安的石灰性土壤， pH值为 8.36，速效磷 6 mg/kg， 全磷 767 mg/kg，晒干过筛后备用。作物为玉米，品种神玉 2号，表面用 1%的次氯酸钠溶液浸 5 min,
40、再用无菌水冲洗 5次催芽。供试菌株为出发菌株 K3于 LB培养基中过夜培养，标 记菌株 K3GFP于加入抗生素 （ 四环素 （ Tet)为 50 pg/mL， 氨苄青霉素 (Amp)为 50 pg/mL ) LB培养基中 28C过夜培养。有机肥为牛粪与氨基酸肥料由江苏宜兴新天地 公司提供，其中牛粪与氨基酸分别为全氮 2.675%与 6.7%，全磷 （ P205) 1.552%与 1%， 全钾 (K2O)0.975% 与 3.1%。 1.2试验方法 1.2.1 盆栽试验方案 盆栽试验设对照 CK (3.26 g/盆 N+2.38 g/盆 KC1)、 化肥 CF(3.26 g/盆 N+0.96 g
41、/盆 KH2P04+1.85 g/盆KC1)、 有机肥 M( 1.66 g/盆 N+1.90 g/盆 KC1)、 有机肥加解磷细菌 M+K3 (1.66 g/盆 N+1.90 g/盆 KC1)、有机肥加标记解磷细菌 M+K3G (1.66 g/盆 N+1.90 g/盆 KC1)等五个处理，每盆装土 10 Kg， 每个处理重复 15次。以牛粪与氨基酸肥料 （ 1 : 1) 作为载体，将过夜培养的菌液（解磷细菌 K3与标记解磷细菌 K3GFP)按照 30%接种于 载体，二次发酵4d后备用。将化肥与有机肥等按照处理用量与土壤混匀，发酵后的微 生物有机肥料按照 2%。施入土壤混匀。各处理所需材料和盆钵
42、中的土壤混合均匀后， 按田间持水量使盆中土壤完全湿润，种植玉米，以后每天浇水管理。 1.2.2采样时间及方法 在作物的不同生育期（苗期，大喇叭口期，抽雄期，吐丝期，成熟期）毁灭性釆 样，每次釆集每个处理重复 3次，研究解磷菌在玉米根际的定殖及分布，测定地上部 和地下部的生物量与磷素累积量等。 1.2.3测定项目与方法 1.2.3.1植株地上高度测定与干重测定 将盆钵内玉米植株沿土壤表面剪下，平铺在桌面上，用带刻度直尺直接测量其长 度。植株鲜样分为地上部与地下部后，在 105 C下杀青 30 min， 75 C烘干至恒重后称 其干重。 1.2.3.2植株磷含量测定与土壤有效磷含量测定 植株磷含量
43、与土壤有效磷含量测定按鲍士旦 （ 2000)的方法进行。 1.2.3.3 土壤中解磷细菌的分布 釆用抖根法获得根际和非根际土，用改良后的 PVK培养基（见第二章 PVK培养 基）作为分离培养基，分别测定解磷细菌在玉米根际和非根际土中的数量。 1.2.3.4 土壤中标记解磷细菌的分布 同样釆用抖根法获得根际和非根际土，用加入四环素 (Tet) 50 pg/mL以及氨苄青 霉素 (Amp) 50 |ig/mL的 LB培养基分别测定标记解磷细菌的数量。 1.2.3.5 土壤中微生物群落测定 (1)平板稀释涂布法 三大类群微生物细菌、真菌、放线菌釆用平板稀释涂布法。细菌培养釆用牛肉蛋 白胨培养基，取
44、UT5、 10 1(T7稀释度涂布，于 28 C倒置培养 2d，计算平板中细菌总 数；真菌培养用马丁氏培养基，取 10 HT2、 10_3稀释度涂布，于 28C倒置培养 3d， 计算平板中真菌总数。放线菌培养用高氏 1号培养基，取 10 10_5、 1(T6稀释度涂布， 于 28 C倒置培养 3 d， 计算平板中放线菌总数。 (2)变性梯度凝胶电泳 （ Denaturing gradient gel electrophoresis) -DGGE分析 a 土壤中总 DNA提取 称取 5g土壤样品于 50mL离心管中，加入 13.5mLDNA提取缓冲液 （ 100mmol/L EDTANa混合，1
45、00mmol/LNa3P04， 1.5mol/LNaCl， 1%CTAB混合后调节 pH8_0)， 再加入 100心蛋白酶反（ 1 111以 11止），于 37摇床上振荡 3 111111 (2251*/1111);加入 1.512008/1 8,65。 7嫌 211，其间每隔 15-2011轻轻颠倒混匀 ； 迅速置于 -70 C 冰冻 30 min,取出后于 65 C 水浴融化，如此反复 2-3次裂解细胞；室温离心 （ 12000 rpm) 10 min， 收集上清液，转移到 50 mL离心管中，土壤沉淀再加入 4.5 mL提取液 和 0.5mL200g/L 的 SDS， 涡旋 10s， 6
46、5C 水浴 lOmin， 室温离心 （ 12000rpm) 10min， 收集上清液并与前次上清液合并。上清液用等体积的氯仿 -异戊醇 （ V : V=24 : 1)抽 提，离心后吸取水相转移至另一 50 mL离心管中，以 0.6 V异丙醇室温沉淀 lh， 室温 离心 （ 12000 rpm) 20 min,收集核酸沉淀，用冷的 700 mL/L乙醇洗涤沉淀，吹干， 溶解于灭菌的超纯水中，最终体积为 200 pL (张瑞福， 2003;黄婷婷， 2004)。 b PCR扩增 PCR扩增反应体系： l x缓冲液 2.5此， dNTP(25 mmol/L)2 iL， 引物 1 (25 pmol/i
47、L )1 xL， 引物 2 (25 pmol/iL) 1 piL， Mg2+ (25 mmol/L ) 2_5 pL， 模板 (适当稀释的 土壤 DNA)2pL， TDNA聚合酶 2.5U， ddH20 13.5pL， 总体积 25(aL。 反应条件： 94 预变性 7 min， 94 C变性 30 s, 55 C退火 30 s， 72 C延伸 30 s， 72C保持 7min， 共循环 35 次， 4C保温 （ Cindy， 2000;蒋小芳， 2008)。 引物 1: PRBA338F Bacteria V3 region (338-358) 5-AC TCC TAC GGG AGG CA
48、G CAG-3 引物 2: PRUN518R Universal V3 region (534-518) 5-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3 GC clamp added to the 5-end of the primer 1 ： 5-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G -3. c DGGE及 DGGE凝胶的分析 土壤 DNA经过 PCR扩增后，采用 D-Code突变检测系统 (Bio-Rad)对样品进行 DGGE 分析 .所用的聚丙烯酰胺凝胶浓度为 8%，变性梯度为 40% 60%， 80 V、恒温 60 C、 lxTAE中电泳 16h，银染后扫描。 ， 在图像处理过程中，对于在 DGGE电泳图上是肉眼可见、但被软件忽略掉的一些 小条带进行了手动处理，条带的密度由该软件自动算出。 1.3数据处理方法 数据处理