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1、蛋白质浓度测定方法四种古老的经典方法四种古老的经典方法：定氮法双缩尿法（Biuret法）Folin酚试剂法（Lowry法）紫外吸收法新的测定法新的测定法：考马斯亮蓝法（Bradford法）更新的测定方法：更新的测定方法：BCA法补充知识型可见分光光度计紫外分光光度计紫外分光光度计微量凯氏（微量凯氏（Kjeldahl）定氮法）定氮法原理样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。以甘氨酸为例，其反应式如下：NH2CH2COOH+3H2SO4=2CO2+3SO2+4H2O+
2、NH3(1)2NH3+H2SO4=(NH4)2SO4(2)(NH4)2SO4+2NaOH=2H2O+Na2SO4+2NH3(3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。器材1.100ml凯氏烧瓶2.改进型凯氏定氮仪3.50ml容量瓶4.分析天平（电子天平）5.烘箱6.电炉7.酒精灯8.小玻璃珠9.滴定管10.洗瓶11.锥形瓶12.铁架台试剂1.消化液：30%H2O2浓H2SO4H2O=3212.30%NaOH溶液3.2%H3BO3溶液4.混合催化剂（粉末K2SO4-
3、CuSO4混合物）K2SO4与CuSO4以31比例充分研细混匀。5.0.01mol/L标准盐酸溶液6.混合指示剂（田氏指氏剂）取0.1%甲烯蓝-无水乙醇溶液50ml、0.1%甲基红-无水乙醇溶液200ml，混合，贮于棕色瓶中备用。该指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色，变色范围很窄（pH5.25.6）且很灵敏。7.蒸馏水若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则样品中蛋白质含量（%）=总氮量6.25若样品中除有蛋白质外，尚含有其他含氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。蛋白氮=总氮
4、-非蛋白氮蛋白质含量（g%）=蛋白氮6.25双缩脲法N 端端C 端端双缩脲双缩脲加热NH322H1800双缩脲22222双缩脲反应:碱性环境H2OO=CC=OHNNHR-CHCH-RO=CCuC=OHNNHR-CHCH-RH2O紫色络合物原原 理理双缩脲法是利用蛋白质的双缩脲反应而测定蛋白质含量的方法。因蛋白质含有两个以上的肽键，所以有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。在一定的实验条件下，未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540560nm测定，即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质
5、浓度。试剂试剂一一 试剂试剂1标准酪蛋白溶液（标准酪蛋白溶液（5mg/ml）用0.05mol/LNaOH溶液配制：5g酪蛋白加0.05mol/LNaOH溶液至1000ml。2双缩脲试剂双缩脲试剂溶解1.5g硫酸铜（CuSO45H2O）和6.0g酒石酸钾钠（NaKC4H4O64H2O）于500ml蒸馏水中。在搅拌下加入10%NaOH溶液300ml，用蒸馏水稀释到1升，贮存在内壁涂有石蜡的瓶中，可长期保存。3未知蛋白质溶液未知蛋白质溶液球蛋白溶液。Folin酚试剂法（Lowry法）蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件
6、下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。该化合物在750nm有最大吸收峰。试剂：一：1，4%碳酸钠；2，0.2N氢氧化钠；3，1%硫酸铜；4,2%酒石酸钾钠。1和2等体积混合，3和4等体积混合，然后将两液以50：1混合(甲)。当天使用。二：1NFolin-酚试剂(乙)。方法：标准曲线；试管中加0、0.2、0.40、0.60、1.00毫升酪蛋白溶液（500微克/毫升），加水补足1毫升，平行做两份。按序各加5毫升试剂（甲），摇匀，室温置放10分钟，再依次加入1N（0.5毫升）Folin-酚试剂（乙），摇匀，30摄氏度保温30分钟。然后在分光光度机上比色测定（A75
7、0）。考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。CoomassieDye-Based蛋白质定量PROTEIN+Amax=595nmBLUEAcidCoomassie G-250Protein-DyeComplexO CH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+总蛋白定量分析总蛋白定量分析BCA（Bicinchoninic acid，二
8、辛可宁酸、二羧基二喹啉）二辛可宁酸、二羧基二喹啉）准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是202000g/ml；MicroBCA试剂测定范围是0.5-20g/ml快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量不受样品中离子型和非离子型去污剂影响检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝基本原理：基本原理：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使
9、蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。紫外吸收法测蛋白质含量紫外吸收法测蛋白质含量三、操作步骤1.取15支试管，按下表编号、加试剂管号0123456样品牛血清白蛋白(mg)00.61.22.43.64.86.02mg/mL牛血清白蛋白体积(mL)00.30.61.21.82.43.0待测液体积(mL)3.0*蒸馏水(mL)3.02.72.41.81.20.600OD5402.各管混匀混匀后，加入双缩
10、脲试剂3.0mL,37oC反应30min。3.以0号管调零，测定各管540nm光吸收值。四、结果处理1.绘制标准曲线以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制标准曲线。2.样品的计算根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量（mg），再根据样品的体积计算出样品的浓度。五、注意事项1.须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。2.*样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。3.比色杯的使用测量后的计算方法测量后的计算方法使用一实验结果实验结果求出待测蛋白质溶液的光密度后，从标准曲线上查出其蛋白质浓度，按稀释倍数求出每毫升蛋白质溶液的蛋白质含量。讨论每种方法的适用范围每种方法的影响因素还有无其他方法此此课件下件下载可自行可自行编辑修改，修改，仅供参考！供参考！感感谢您的支持，我您的支持，我们努力做得更好！努力做得更好！谢谢!