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1、1、0.1g 细胞细胞 2ml epp，混匀。，混匀。2、700l bufferA，65，10m，中间混匀一次，中间混匀一次3、苯酚、苯酚350l，氯仿，氯仿(l fn)350l，混匀，混匀3m，12000rpm，5m4、上清、上清500l 至至1.5ml epp，500l等体积氯仿，混匀等体积氯仿，混匀3m，12000rpm，10m5、上清、上清400l到到1.5ml epp，异丙醇，异丙醇400l0.7-1，12000rpm，2m，掏出，掏出DNA，毛细管，毛细管6、沉淀用、沉淀用70%乙醇洗乙醇洗2次，每次次，每次3m7、自然凉干、自然凉干10m，30lTE，充分溶解，充分溶解8、琼脂糖
2、凝胶电泳鉴定、琼脂糖凝胶电泳鉴定第一页，共十五页。蛋白质浓度蛋白质浓度(nngd)测定方法测定方法比较比较 第二页，共十五页。一、一、实验实验(shyn)目的目的学习学习(xux)三种蛋白质浓度的测定方法，三种蛋白质浓度的测定方法，并比较优缺点。并比较优缺点。第三页，共十五页。二、二、实验实验(shyn)(shyn)原理与步骤原理与步骤OHOH 磷磷钼钼酸、磷酸、磷钨钨酸酸Pr+CuSO4 Pr-CuPr+CuSO4 Pr-Cu络络合物紫合物紫红红色色蓝蓝色化合物色化合物蛋白质测定的范围：蛋白质测定的范围：25250g/mL标准蛋白标准蛋白(dnbi)BSA 250g/mL测定波长：测定波长：
3、660nm1、Lowry法法Foling-酚法酚法反响反响(fnyng)原理：原理：第四页，共十五页。测测定步定步骤骤(bzhu)(bzhu)：标标准蛋白准蛋白BSA 250g/mLBSA 250g/mL 1 1依次向依次向试试管中参加管中参加试剂试剂：2 2A660PrA660Pr作作图图，求待，求待测测蛋白蛋白(dnbi)(dnbi)浓浓度度管号管号1 12 23 34 45 56 6待待测测1 1待待测测1 1，BSA(mL)BSA(mL)0 00.20.20.40.40.60.60.80.81.01.01.01.01.01.0D.W(mL)D.W(mL)1.01.00.80.80.60
4、.60.40.40.20.20 00 00 0Pr(g/mL)Pr(g/mL)试剂试剂甲（甲（mLmL）5.0 5.0 室温反室温反应应1010分分钟钟（双（双缩脲缩脲反反应应）试剂试剂乙（乙（mLmL）0.5 0.5 立即振立即振摇摇，3030水浴水浴2020分分钟钟A660A660第五页，共十五页。原理：蛋白原理：蛋白质质分子中分子中Tyr,Try,PheTyr,Try,Phe的苯的苯环环含有共含有共轭轭双双键键，因此蛋白，因此蛋白质质具有具有UVUV吸收吸收(xshu)(xshu)的的性性质质，吸收，吸收(xshu)(xshu)顶顶峰在峰在280nm280nm处处。测测定范定范围围：0.
5、10.11mg/mLpr1mg/mLpr测测定波定波长长：280nm280nm标标准蛋白准蛋白BSABSA：1mg/mL 1mg/mL测测定步定步骤骤：1 1向各向各试试管中依次参加各种管中依次参加各种试剂试剂：2 2以以A280nm-PrA280nm-Pr作作标标准曲准曲线线，求待，求待测测蛋白蛋白(dnbi)(dnbi)浓浓度度管号管号1 12 23 34 45 56 6待待测测1 1待待测测1 1，BSABSA（mLmL）0 00.50.51.01.02.02.03.03.04.04.04.04.04.04.0D.W(mL)D.W(mL)4.04.03.53.53.03.02.02.01
6、.01.00 00 00 0Pr(mg/mL)Pr(mg/mL)A280nmA280nm2、紫外线、紫外线UV吸收吸收(xshu)法：法：第六页，共十五页。3、考、考马马斯亮斯亮蓝显蓝显色色(xin s)法法Bradford法法 实验实验原理：原理：PrCBBG-250-PrPrCBBG-250-Pr复合物复合物 A595 A595 标标准蛋白准蛋白(dnbi)BSA(dnbi)BSA：250g/mL 250g/mL 操作步操作步骤骤：1 1依次向各依次向各试试管中参加各种管中参加各种试剂试剂：2 2以以A595nm-PrA595nm-Pr作作标标准曲准曲线线，求待，求待测测蛋白蛋白(dnbi
7、)(dnbi)浓浓度度管号管号1 12 23 34 45 56 6待待测测1 1待待测测1 1，BSABSA（mLmL）0 00.20.20.40.40.60.60.80.81.01.01.01.01.01.0D.W(mL)D.W(mL)1.01.00.80.80.60.60.40.40.20.20 00 00 0Pr(g/mL)Pr(g/mL)CBBG-250CBBG-250（mLmL）5.05.0A595nmA595nm第七页，共十五页。蔗糖蔗糖(zhtng)酶酶km值的测定值的测定 第八页，共十五页。一、实验目的：一、实验目的：掌握掌握sucrose酶的酶的km测定的实验方法。测定的实验
8、方法。二、实验原理：二、实验原理：蔗糖酶是一种水解酶，催化反响：蔗糖蔗糖酶是一种水解酶，催化反响：蔗糖+水水G+F 每水解每水解1molS，生成，生成2mol复原复原(hun yun)糖，因此可用比色皿测定糖，因此可用比色皿测定复原复原(hun yun)糖量，即可知底物的水解速度。复原糖量，即可知底物的水解速度。复原(hun yun)糖可糖可复原复原(hun yun)3，5-二硝基水杨酸二硝基水杨酸DNS生成红棕色的氨基化合物，生成红棕色的氨基化合物，即即3-氨基氨基-5-硝基水杨酸。硝基水杨酸。第九页，共十五页。三、实验三、实验(shyn)步骤步骤 管号管号蔗糖蔗糖（ml）H2O（ml）12
9、3456780.50.7511.522.5344.54.2543.532.521每管加酶液每管加酶液0.5 ml37准确作用准确作用(zuyng)5 minNaOH 0.5 ml每管取每管取0.5mlDNS 0.5ml沸水浴沸水浴3min冷却冷却DW 4mlA520取取8只试管，按下表分别参加如下只试管，按下表分别参加如下(rxi)试剂：试剂：以以1/A5201/S作图，求作图，求Km第十页，共十五页。四、四、Km测定的意义测定的意义:1、酶的特征性常数，进行酶学研究必须测定的一个参数；、酶的特征性常数，进行酶学研究必须测定的一个参数；2、代谢研究特别、代谢研究特别(tbi)是分支代谢途径的调
10、节，是分支代谢途径的调节，Km代表代表E争争夺夺S的能力，对反响速度代谢的计算非常重要。的能力，对反响速度代谢的计算非常重要。五、本卷须知：五、本卷须知：1、底物浓度应选择在、底物浓度应选择在Km值附近；值附近；2、反响时间应尽可能短，以保证反响初速度；、反响时间应尽可能短，以保证反响初速度；3、酶活力不能太高，否那么不易控制；、酶活力不能太高，否那么不易控制；4、加样应为一个人操作，保证各管间隔一致。、加样应为一个人操作，保证各管间隔一致。第十一页，共十五页。DNS-aa的聚酰胺薄膜层析的聚酰胺薄膜层析(cn x)第十二页，共十五页。一、实验原理：一、实验原理：荧光试剂二甲氨基萘磺酰氨荧光试
11、剂二甲氨基萘磺酰氨DNS-Cl,能与氨基酸的能与氨基酸的N末端结末端结合生成荧光物质合生成荧光物质(wzh)DNS-aa，DNS-Cl也可与多肽或蛋白质的也可与多肽或蛋白质的游离氨基结合，生成游离氨基结合，生成DNA-Pr或或DNS-肽，经酸水解后释放出肽，经酸水解后释放出DNS-aa，各种，各种DNS-aa在聚酰胺薄膜的分配系数不一样，在聚酰胺薄膜的分配系数不一样，DNS-aa在在360或或280nm紫外光下发黄色荧光。紫外光下发黄色荧光。二、实验二、实验(shyn)步骤：步骤：1、取聚酰胺薄膜、取聚酰胺薄膜1张一人一张，铅笔做上样点标记张一人一张，铅笔做上样点标记2、上样，毛细管上样直径、
12、上样，毛细管上样直径2mm，屡次上样，屡次上样3、展层通风橱内、展层通风橱内4、检测，用吹风机吹干，紫外光检测、检测，用吹风机吹干，紫外光检测第十三页，共十五页。实验错开做，以防止仪器和试剂使用拥挤！实验错开做，以防止仪器和试剂使用拥挤！DNADNA提取实验放在第一或第二个做提取实验放在第一或第二个做分光光度计和水浴锅已调好，请不要分光光度计和水浴锅已调好，请不要(byo)(byo)调动调动波长和温度，比色皿专用，请勿混用。波长和温度，比色皿专用，请勿混用。实验报告实验报告第十四页，共十五页。内容(nirng)总结1、0.1g 细胞 2ml epp，混匀。1、0.1g 细胞 2ml epp，混匀。7、自然凉干10m，30lTE，充分溶解。标准蛋白BSA 250g/mL。测定步骤：标准蛋白BSA 250g/mL。2A660Pr作图，求待测蛋白浓度。5.0 室温反响10分钟双缩脲反响。3、考马斯亮蓝显色法Bradford法。掌握(zhngw)sucrose酶的km测定的实验方法。NaOH 0.5 ml第十五页，共十五页。