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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流蛋白质浓度的紫外测定.精品文档.蛋白质浓度的紫外测定1 实验目的（1）了解蛋白中20个常见氨基酸的结构（2）掌握紫外分光光度法测定蛋白质的原理及应用2 实验原理蛋白质分子中所含酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸的芳香环结构对紫外光有吸收作用。色氨酸的吸收最强，但由于一般蛋白质中酪氨酸的含量比色氨酸高许多，因此这一吸收可认为主要是由酪氨酸提供的。其最大值在280nm附近，不同的蛋白质吸收波长略有差别。在无其他干扰物质存在的条件下，280nm的吸光度即可作蛋白质的测定用，但不同种的蛋白质对280nm波长的光吸收强度因芳香性氨基酸残基含量的不同而有差异。1
2、mg/ml浓度的不同蛋白质的吸光度值在0.52.5之间，因此测定未知浓度蛋白需用同种蛋白质对照结果才可靠。测量方法和计算公式：a) 对于不含核酸污染的蛋白溶液（如果样品光吸收值大于2.0，应将样品稀释至光吸收值小于2.0）：选择蛋白缓冲液作为空白对照，测定280 nm波长处的光吸收值，蛋白浓度与吸光度值成正比关系。b) 对于存在核酸污染（A280/A2600.6）蛋白溶液：选择蛋白缓冲液作为空白对照，测定280 nm和260 nm波长处的光吸收值，或280 nm和205 nm波长处光吸收值，按照以下经验公式计算： 蛋白浓度（mg/ml）= （1.55 A280） （0.76 A260） （1）
3、 蛋白浓度（mg/ml）= A205 (27 A280/A205) （2）将280nm的吸光度与260nm的吸光度各乘以系数相减求得接近的蛋白质浓度。A280与A260分别代表光径为1cm时样品在280nm和260nm的吸光度值。本实验中使用的牛血清白蛋白样品纯度高，可忽略核酸等其他生物样品对紫外吸收的影响，可直接做吸光度值与蛋白浓度的标准工作曲线。紫外线吸收适用于蛋白质浓度为0.20.5mg/ml 的样品的测定。由于玻璃器皿会吸收紫外线，实验中需用石英池做容器。3 仪器和试剂（1）仪器石英比色池一个，移液器（配枪头），紫外/可见分光光度计Varian 50 Probe UV-Visible
4、Spectrophotometer（2）药品牛血清白蛋白（biotech Grade）溶液以0.9%NaCl 作溶剂配制，浓度为1mg/ml，0.9% NaCl溶液。4 实验步骤（1）在一组干的样品管中，将1mg/mL浓度的牛血清白蛋白用0.9%NaCl分别稀释为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL。体积均为4mL。（2）用紫外可见分光光度计分别测定每一浓度的白蛋白溶液的A280值，以0.9%NaCl作为空白调基线，记录所得读数，做标准工作曲线，并检查计算所得结果是否与实际浓度相符。（3）取未知浓度待测蛋白溶液，测定A280值，根据标准工作曲线计算待测液浓度。5 实验数据记录及处理
5、（1）根据实验记录的数据做出各浓度样品的吸收曲线如下：图一 各浓度样品的吸收曲线（2）标准工作曲线根据记录的数据，发现各个吸收都是在波长277.94772nm处有最大吸光度，记录各浓度溶液该处吸光度，做出标准工作曲线如图2：Linear Regression for DATA1_B:Y = A + B * XParameterValueError-A-0.011310.00153B0.669540.00462-RSDNP-0.999930.0014650.0001图2 标准工作曲线（左）及其线性拟合数据（右）（3）待测溶液浓度测定根据待测溶液吸光度读取数据A277=0.15931，代入图2的拟
6、合关系中，可以得到待测液的浓度： c=0.25 mg/mL6 结果分析从标准工作曲线的拟合度来看，达到了0.9993说明实际浓度与所得结果较为符合，实验较为准确。实验中还需要注意以下事项：（1）空白溶液与供试品溶液必须澄清，不得有浑浊。如有浑浊，应预先过滤，并弃去初滤液。（2）测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同瓶溶剂为空白对照，采用1cm的石英吸收池。（3）在规定的吸收峰波长2nm以内测试几个点的吸收度，以核对供试品的吸收峰波长位置是否正确，除另有规定外，吸收峰波长应在该品种项下规定的波长2nm以内；否则应考虑该试样的真伪、纯度以及仪器波长的准确度，并以吸收度最大的波长作为测定波长。
7、（4）由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供试品的吸收度后应减去空白读数，再计算含量。7实验讨论（1）紫外吸收法测定蛋白质浓度有何优缺点？受哪些因素影响和限制？答：优点缺点限制因素灵敏度高廉价测定快速便捷测定干扰物质少易产生干扰（如核酸）测定浓度不能过大标准曲线仍有偏差对蛋白质纯度要求较高温度浓度酸碱性人为操作因素（2）紫外吸收法还可以用来做蛋白质哪些方面的研究？答：在质量监督方面可以用来检测肉类中蛋白质含量是否达标，文献信息如下：文献名称紫外吸收光谱法测定猪肉中蛋白质的含量作者张墨英; 程瑞庆; 摘要用紫外吸收光谱测定法测定了猪肉中蛋白质的含量，与凯氏定氨法对照，二者无显著性差异，前者准确度较高，重现性好，简单方便。