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1、蛋白质浓度测定方法比较现在学习的是第1页，共15页1、0.1g 细胞细胞 2ml epp，混匀。，混匀。2、700l bufferA，65，10m，中间混匀一次，中间混匀一次3、苯酚、苯酚350l，氯仿，氯仿350l，混匀，混匀3m，12000rpm，5m4、上清、上清500l 至至1.5ml epp，500l（等体积）氯仿，混匀（等体积）氯仿，混匀3m，12000rpm，10m5、上清、上清400l到到1.5ml epp，异丙醇，异丙醇400l（0.7-1），），12000rpm，2m，（掏出，（掏出DNA，毛细管），毛细管）6、沉淀用、沉淀用70%乙醇洗乙醇洗2次，每次次，每次3m7、自然
2、凉干（、自然凉干（10m），），30lTE，充分溶解，充分溶解8、琼脂糖凝胶电泳鉴定、琼脂糖凝胶电泳鉴定现在学习的是第2页，共15页蛋白质浓度测定方法比较蛋白质浓度测定方法比较 现在学习的是第3页，共15页一、一、实验目的实验目的学习三种蛋白质浓度的测定方法，并比较优学习三种蛋白质浓度的测定方法，并比较优缺点。缺点。现在学习的是第4页，共15页二、二、实验原理与步骤实验原理与步骤OHOH 磷磷钼钼酸、磷酸、磷钨钨酸酸Pr+CuSOPr+CuSO4 4 Pr-Cu Pr-Cu络络合物（紫合物（紫红红色）色）蓝蓝色化合物色化合物蛋白质测定的范围：蛋白质测定的范围：25250g/mL标准蛋白标准蛋白
3、BSA 250g/mL测定波长：测定波长：660nm1、Lowry法（法（Foling-酚法）酚法）反应原理：反应原理：现在学习的是第5页，共15页 测测定步定步骤骤：标准蛋白标准蛋白BSA 250g/mL （1 1）依次向）依次向试试管中加入管中加入试剂试剂：（2 2）A660A660Pr作图，求待测蛋白浓度作图，求待测蛋白浓度管号管号1 12 23 34 45 56 6待待测测1 1待待测测1 1，BSA(mL)BSA(mL)0 00.20.20.40.40.60.60.80.81.01.01.01.01.01.0D.W(mL)D.W(mL)1.01.00.80.80.60.60.40.4
4、0.20.20 00 00 0Pr(g/mLPr(g/mL)试剂试剂甲甲（mLmL）5.0 5.0 室温反室温反应应1010分分钟钟（双（双缩脲缩脲反反应应）试剂试剂乙乙（mLmL）0.5 0.5 立即振立即振摇摇，3030水浴水浴2020分分钟钟A660A660现在学习的是第6页，共15页原理：蛋白原理：蛋白质质分子中分子中Tyr,Try,PheTyr,Try,Phe的苯的苯环环含有共含有共轭轭双双键键，因此蛋白，因此蛋白质质具有具有UVUV吸收的性吸收的性质质，吸收高峰在，吸收高峰在280nm280nm处处。测测定范定范围围：0.10.11mg/mLpr1mg/mLpr测测定波定波长长：2
5、80nm280nm标标准蛋白准蛋白BSABSA：1mg/mL1mg/mL测测定步定步骤骤：（1 1）向各）向各试试管中依次加入各种管中依次加入各种试剂试剂：（2 2）以）以A280nm-PrA280nm-Pr作作标标准曲准曲线线，求待测蛋白浓度求待测蛋白浓度管号管号1 12 23 34 45 56 6待待测测1 1待待测测1 1，BSABSA（mLmL）0 00.50.51.01.02.02.03.03.04.04.04.04.04.04.0D.W(mL)D.W(mL)4.04.03.53.53.03.02.02.01.01.00 00 00 0Pr(mg/mLPr(mg/mL)A280nmA
6、280nm2、紫外线（、紫外线（UV）吸收法：）吸收法：现在学习的是第7页，共15页3、考、考马马斯亮斯亮蓝显蓝显色法（色法（Bradford法）法）实验实验原理：原理：PrCBBG-250-PrPrCBBG-250-Pr复合物复合物 A A595595 标标准蛋白准蛋白BSABSA：250g/mL250g/mL 操作步操作步骤骤：（1 1）依次向各）依次向各试试管中加入各种管中加入各种试剂试剂：（2 2）以）以A595nm-PrA595nm-Pr作作标标准曲准曲线线，求待测蛋白浓度求待测蛋白浓度管号管号1 12 23 34 45 56 6待待测测1 1待待测测1 1，BSABSA（mLmL）
7、0 00.20.20.40.40.60.60.80.81.01.01.01.01.01.0D.W(mL)D.W(mL)1.01.00.80.80.60.60.40.40.20.20 00 00 0Pr(g/mL)Pr(g/mL)CBBG-250CBBG-250（mLmL）5.05.0A595nmA595nm现在学习的是第8页，共15页 蔗糖酶蔗糖酶km值的测定值的测定 现在学习的是第9页，共15页一、实验目的：一、实验目的：掌握掌握sucrose酶的酶的km测定的实验方法。测定的实验方法。二、实验原理：二、实验原理：蔗糖酶是一种水解酶，催化反应：蔗糖蔗糖酶是一种水解酶，催化反应：蔗糖+水水G+
8、F 每水解每水解1molS，生成，生成2mol还原糖，因此可用比色皿测定还原糖量，即还原糖，因此可用比色皿测定还原糖量，即可知底物的水解速度。还原糖可还原可知底物的水解速度。还原糖可还原3，5-二硝基水杨酸（二硝基水杨酸（DNS）生成红）生成红棕色的氨基化合物，即棕色的氨基化合物，即3-氨基氨基-5-硝基水杨酸。硝基水杨酸。现在学习的是第10页，共15页三、实验步骤三、实验步骤 管号管号蔗糖蔗糖（ml）H2O（ml）123456780.50.7511.522.5344.54.2543.532.521每管加酶液每管加酶液0.5 ml37准确作用准确作用5 minNaOH 0.5 ml每管取每管取
9、0.5mlDNS 0.5ml沸水浴沸水浴3min冷却冷却DW 4mlA520取取8只试管，按下表分别加入如下试剂：只试管，按下表分别加入如下试剂：以以1/A5201/S作图，求作图，求Km现在学习的是第11页，共15页四、四、Km测定的意义测定的意义:1、酶的特征性常数，进行酶学研究必须测定的一个参数；、酶的特征性常数，进行酶学研究必须测定的一个参数；2、代谢研究（特别是分支代谢途径的调节），、代谢研究（特别是分支代谢途径的调节），Km代表代表E争夺争夺S的能力，对反应速度（代谢）的计算非常重要。的能力，对反应速度（代谢）的计算非常重要。五、注意事项：五、注意事项：1、底物浓度应选择在、底物浓
10、度应选择在Km值附近；值附近；2、反应时间应尽可能短，以保证反应初速度；、反应时间应尽可能短，以保证反应初速度；3、酶活力不能太高，否则不易控制；、酶活力不能太高，否则不易控制；4、加样应为一个人操作，保证各管间隔一致。、加样应为一个人操作，保证各管间隔一致。现在学习的是第12页，共15页 DNS-aa的聚酰胺薄膜层析的聚酰胺薄膜层析 现在学习的是第13页，共15页一、实验原理：一、实验原理：荧光试剂二甲氨基萘磺酰氨（荧光试剂二甲氨基萘磺酰氨（DNS-Cl）,能与氨基酸的能与氨基酸的N末端结合末端结合生成荧光物质生成荧光物质DNS-aa，DNS-Cl也可与多肽或蛋白质的游离氨也可与多肽或蛋白质
11、的游离氨基结合，生成基结合，生成DNA-Pr或或DNS-肽，经酸水解后释放出肽，经酸水解后释放出DNS-aa，各，各种种DNS-aa在聚酰胺薄膜的分配系数不一样，在聚酰胺薄膜的分配系数不一样，DNS-aa在在360或或280nm紫外光下发黄色荧光。紫外光下发黄色荧光。二、实验步骤：二、实验步骤：1、取聚酰胺薄膜、取聚酰胺薄膜1张（一人一张），铅笔做上样点标记张（一人一张），铅笔做上样点标记2、上样，毛细管上样直径、上样，毛细管上样直径2mm，多次上样，多次上样3、展层（通风橱内）、展层（通风橱内）4、检测，用吹风机吹干，紫外光检测、检测，用吹风机吹干，紫外光检测现在学习的是第14页，共15页实验错开做，以避免仪器和试剂使用拥挤！实验错开做，以避免仪器和试剂使用拥挤！DNADNA提取实验放在第一或第二个做提取实验放在第一或第二个做分光光度计和水浴锅已调好，请不要调动波长和分光光度计和水浴锅已调好，请不要调动波长和温度，比色皿专用，请勿混用。温度，比色皿专用，请勿混用。实验报告实验报告现在学习的是第15页，共15页