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1、实验七实验七 培养基的制备和灭菌培养基的制备和灭菌 一、目的要求一、目的要求了解培养基的配制原理和方法，掌握其了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。配制过程。了解高压蒸汽灭菌的基本原理，学习其了解高压蒸汽灭菌的基本原理，学习其操作方法操作方法。二、基本原理二、基本原理培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、用人工方法配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、生长因子以及水分等。微生物在培养基上生长繁无机盐、生长因子以及水分等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适酸碱度范围内才能
2、表现它们最大生命力，殖还必须在最适酸碱度范围内才能表现它们最大生命力，因此不同种类的微生物应将培养基调到一定因此不同种类的微生物应将培养基调到一定pHpH值范围。培值范围。培养基种类很多，不同的微生物所需培养基不同。按其组成养基种类很多，不同的微生物所需培养基不同。按其组成可分天然培养基、合成培养基、半可分天然培养基、合成培养基、半合成培养基合成培养基。按其物理。按其物理状态可分固体培养基、液体培养基和半固体培养基。按其状态可分固体培养基、液体培养基和半固体培养基。按其用途可分加富培养基、选择培养基、鉴别培养基。用途可分加富培养基、选择培养基、鉴别培养基。培养基配制后还必须进行灭菌。培养基配制
3、后还必须进行灭菌。高压蒸汽灭菌法是在密高压蒸汽灭菌法是在密闭的加压容器内进行，加热使器内的水产生蒸汽，由于密闭的加压容器内进行，加热使器内的水产生蒸汽，由于密闭，增加了器内的压力，使水的沸点升高，从而获得高于闭，增加了器内的压力，使水的沸点升高，从而获得高于100100度的蒸汽温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌度的蒸汽温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。的目的。三、实验分组与任务三、实验分组与任务每一排（每一排（6 6人）为一组，全班共分人）为一组，全班共分6 6个组个组第第1-21-2组组：每组配制200ml淀粉培养基，分装两个三角瓶，2组共包扎14副平皿第第3-43-4组：组
4、：每组配制100ml明胶培养基，分装成12支试管，每支试管装液量为试管高度的三分之一第第5 5组组：配制200ml葡萄糖发酵培养基，分装成2020支试管，每支试管装液量为试管高度的四分之一第第6 6组组：配制200ml乳糖发酵培养基，分装成2020支试管，每支试管装液量为试管高度的四分之一第第7-87-8组：组：每组配制250ml牛肉膏蛋白胨培养基,分装三角瓶1 1、淀粉培养基配方（见实验课本、淀粉培养基配方（见实验课本243243页页）2 2、明胶培养基配方（见实验课本明胶培养基配方（见实验课本243243页页）3 3、葡萄糖发酵培养基配方（见实验课本葡萄糖发酵培养基配方（见实验课本2442
5、44页页）4 4、乳糖发酵、乳糖发酵培养基配方（见实验课本培养基配方（见实验课本244244页页）5 5、牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨培养基配方（见实验课本培养基配方（见实验课本241241页页）各培养基的配方各培养基的配方四、实验内容四、实验内容（一）培养基的配制（一）培养基的配制 将试管、三角瓶贴好标签，注明培养基名称、日期，标签粘贴位置在离管口1/3管身处。注意：标签最好用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹注意：标签最好用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹 操作图示：操作图示：注意事项：u在配制培养基时一定要注意调溶液的pH。u称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取一种药品后
6、，洗净，擦干，再取另一种药品。瓶盖也不要盖错。u在烧杯融化琼脂的过程中，人要在电炉旁看着，以免培养基因沸腾而溢出烧杯。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。注意带上棉纱手套防止烫伤。u分装过程中，注意不要使培养基沾在管口上，以免沾污棉塞而引起污染。u培养基配方是配制1000ml的量，要根据实际配制的量按比例增减。u调好pH后，再加入指示剂（如溴甲酚紫）。（二）培养基灭菌（二）培养基灭菌 培养基分装好后，塞上棉塞，外面再包一牛皮纸，便可灭菌。灭菌的时间和温度按各培养基规定进行，以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分。培养基经灭菌后，可放在37恒温箱培养24小时，无菌者方可使用。在实验室里用得最多的
7、加热灭菌法是高压蒸汽灭菌和干热灭菌。一般培养基和水等用高压蒸汽灭菌，而玻璃器皿常用干热灭菌。蒸汽灭菌为105-121，15-20分钟，干热灭菌为160-170，1-2小时。目的都是使细菌体内蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固，同时湿热穿透力强，而且当蒸汽与被灭菌物体接触凝成水分时，又可放出热量，使温度迅速增高，从而增加灭菌效力。高压蒸汽灭菌步骤如下：高压蒸汽灭菌步骤如下：1.1.灭菌器内加入一定量的水，将包扎好的物品放入其中。灭菌器内加入一定量的水，将包扎好的物品放入其中。2.2.接通电源，进行加热接通电源，进行
8、加热3.3.排除高压锅内的空气，可将排气阀打开，待排出大气后排除高压锅内的空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm20.5kg/cm2时再时再打开排气阀，待压力回复到打开排气阀，待压力回复到0 0时再关闭排气阀。时再关闭排气阀。4.4.当压力达当压力达1.05kg/cm21.05kg/cm2时，此时灭菌器内的温度为时，此时灭菌器内的温度为121121，维持维持20min20min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。物时，应适当降低压力，延长时间。5.5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品注意：将注意：将糖发酵糖发酵培养基放在一起灭菌，其他培养基放在一起灭菌。培养基放在一起灭菌，其他培养基放在一起灭菌。五、实验报告思考题：u 培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的?