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1、实验七培养基的配制和高压蒸汽灭菌第1页，本讲稿共15页一、目的与要求 了解培养基的配制原理。了解培养基的配制原理。了解培养基的配制原理。了解培养基的配制原理。掌握配制培养基的一般方法和步骤。掌握配制培养基的一般方法和步骤。掌握配制培养基的一般方法和步骤。掌握配制培养基的一般方法和步骤。了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。学习高压蒸汽灭菌的操作方法。学习高压蒸汽灭菌的操作方法。学习高压蒸汽灭菌的操作方法。学习高压蒸汽灭菌的操作方法。第2页，本讲稿共15页二、基本原理基本原理1 1、
2、培养基的配制培养基的配制培养基的配制培养基的配制 培培培培养养养养基基基基是是是是人人人人工工工工配配配配制制制制的的的的适适适适合合合合微微微微生生生生物物物物生生生生长长长长繁繁繁繁殖殖殖殖或或或或积积积积累累累累代代代代谢谢谢谢产产产产物物物物的的的的营营营营养养养养基基基基质质质质。用用用用以以以以培培培培养养养养、分分分分离离离离、鉴鉴鉴鉴定定定定、保保保保存存存存各各各各微微微微生生生生物物物物或或或或积积积积累累累累代代代代谢谢谢谢产产产产物物物物。培培培培养养养养基基基基包包包包括括括括有有有有：碳碳碳碳源源源源物物物物质质质质、氮氮氮氮源源源源物物物物质质质质、无无无无机机机
3、机盐盐盐盐类类类类、水水水水等等等等，由由由由于于于于培培培培养养养养的的的的微微微微生生生生物物物物种种种种类类类类不不不不同同同同，培培培培养的目的不同，因此，培养基的组成也就不同。养的目的不同，因此，培养基的组成也就不同。养的目的不同，因此，培养基的组成也就不同。养的目的不同，因此，培养基的组成也就不同。第3页，本讲稿共15页二、基本原理基本原理2 2 2 2、高压蒸汽灭菌、高压蒸汽灭菌、高压蒸汽灭菌、高压蒸汽灭菌 高高高高压压压压蒸蒸蒸蒸汽汽汽汽灭灭灭灭菌菌菌菌是是是是将将将将待待待待灭灭灭灭菌菌菌菌的的的的物物物物品品品品放放放放在在在在一一一一个个个个密密密密闭闭闭闭的的的的加加加
4、加压压压压灭灭灭灭菌菌菌菌锅锅锅锅内内内内，通通通通过过过过加加加加热热热热，使使使使灭灭灭灭菌菌菌菌锅锅锅锅隔隔隔隔套套套套间间间间的的的的水水水水沸沸沸沸腾腾腾腾而而而而产产产产生生生生蒸蒸蒸蒸汽汽汽汽。待待待待水水水水蒸蒸蒸蒸汽汽汽汽急急急急剧剧剧剧地地地地将将将将锅锅锅锅内内内内的的的的冷冷冷冷空空空空气气气气从从从从排排排排气气气气阀阀阀阀中中中中驱驱驱驱尽尽尽尽，然然然然后后后后关关关关闭闭闭闭排排排排气气气气阀阀阀阀，继继继继续续续续加加加加热热热热，此此此此时时时时由由由由于于于于蒸蒸蒸蒸汽汽汽汽不不不不能能能能溢溢溢溢出出出出，而而而而增增增增加加加加了了了了灭灭灭灭菌菌菌菌
5、器器器器内内内内的的的的压压压压力力力力，从从从从而而而而使使使使沸沸沸沸点点点点增增增增高高高高，得得得得到到到到高高高高于于于于1001000 0C C的温度，的温度，的温度，的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。第4页，本讲稿共15页三、实验器材1 1、试剂或溶液、试剂或溶液、试剂或溶液、试剂或溶液用于配制培养基所需的各种化学试剂，用于配制培养基所需的各种化学试剂，用于配制培养基所需的各种化学试剂，用于配制培养基所需的各种化学试剂，1mol/L NaOH 1mol/
6、L NaOH、1mol/L HCl1mol/L HCl等。等。等。等。2 2、仪仪仪仪器器器器其其其其他他他他用用用用具具具具试试试试管管管管、500ml500ml三三三三角角角角瓶瓶瓶瓶、烧烧烧烧杯杯杯杯、培培培培养养养养皿皿皿皿、杜杜杜杜氏氏氏氏小小小小倒倒倒倒管管管管、量量量量筒筒筒筒、玻玻玻玻棒棒棒棒、天天天天平平平平、称称称称量量量量纸纸纸纸、牛牛牛牛角角角角匙匙匙匙、电电电电炉炉炉炉、pHpH试试试试纸纸纸纸（pH5.5-9.0pH5.5-9.0）、试试试试管管管管塞塞塞塞、三三三三角角角角瓶瓶瓶瓶塞塞塞塞、牛牛牛牛皮皮皮皮纸纸纸纸、记记记记号号号号笔、橡胶筋等。笔、橡胶筋等。笔、
7、橡胶筋等。笔、橡胶筋等。第5页，本讲稿共15页四、操作步骤1 1、培养基的配制、培养基的配制1 1 1 1）牛肉膏蛋白胨培养基）牛肉膏蛋白胨培养基）牛肉膏蛋白胨培养基）牛肉膏蛋白胨培养基称称称称量量量量加加加加热热热热溶溶溶溶化化化化调调调调pHpHpHpH至至至至7.0-7.27.0-7.27.0-7.27.0-7.2分分分分装装装装在在在在500ml500ml500ml500ml三三三三角角角角瓶瓶瓶瓶内内内内加加加加塞塞塞塞包扎包扎包扎包扎1211211211210 0 0 0C C C C灭菌灭菌灭菌灭菌20min20min20min20min2 2 2 2）淀粉培养基的配制淀粉培养基
8、的配制淀粉培养基的配制淀粉培养基的配制称称称称量量量量 加加加加热热热热溶溶溶溶化化化化 分分分分装装装装在在在在250ml250ml250ml250ml三三三三角角角角瓶瓶瓶瓶内内内内加加加加塞塞塞塞 包包包包扎扎扎扎 1211211211210 0 0 0C C C C灭菌灭菌灭菌灭菌20min20min20min20min第6页，本讲稿共15页3 3 3 3）明胶培养基的配制）明胶培养基的配制）明胶培养基的配制）明胶培养基的配制称称称称量量量量加加加加热热热热溶溶溶溶化化化化 调调调调pHpHpHpH至至至至7.2-7.4 7.2-7.4 7.2-7.4 7.2-7.4 分分分分装装装装
9、在在在在试试试试管管管管内内内内，装装装装量量量量为为为为试试试试管管管管高高高高度度度度的的的的1/31/31/31/3为宜为宜为宜为宜 加塞加塞加塞加塞 包扎包扎包扎包扎1211211211210 0 0 0C C C C灭菌灭菌灭菌灭菌30min 30min 30min 30min 取出取出取出取出直立直立直立直立4 4 4 4）乳糖乳糖乳糖乳糖蛋白胨培养基的配制蛋白胨培养基的配制蛋白胨培养基的配制蛋白胨培养基的配制称称称称量量量量 加加加加热热热热溶溶溶溶化化化化调调调调pHpHpHpH至至至至7.2-7.4 7.2-7.4 7.2-7.4 7.2-7.4 加加加加入入入入1.6%1.
10、6%1.6%1.6%溴溴溴溴甲甲甲甲酚酚酚酚紫紫紫紫乙乙乙乙醇醇醇醇液液液液指指指指示示示示剂剂剂剂 混匀混匀混匀混匀分装在放有小倒管的试管中分装在放有小倒管的试管中分装在放有小倒管的试管中分装在放有小倒管的试管中1151151151150 0 0 0C C C C灭菌灭菌灭菌灭菌20min20min20min20min5 5 5 5）葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖蛋白胨培养基的配制蛋白胨培养基的配制蛋白胨培养基的配制蛋白胨培养基的配制称量（将乳糖改为葡萄糖）称量（将乳糖改为葡萄糖）称量（将乳糖改为葡萄糖）称量（将乳糖改为葡萄糖）加热溶化加热溶化加热溶化加热溶化 调调调调pHpHpHpH至至至至7.
11、2-7.4 7.2-7.4 7.2-7.4 7.2-7.4 加入加入加入加入1.6%1.6%1.6%1.6%溴甲酚紫乙醇液指示剂溴甲酚紫乙醇液指示剂溴甲酚紫乙醇液指示剂溴甲酚紫乙醇液指示剂 混匀混匀混匀混匀 分装在放有小倒管的试管分装在放有小倒管的试管分装在放有小倒管的试管分装在放有小倒管的试管中中中中 1151151151150 0 0 0C C C C灭菌灭菌灭菌灭菌20min20min20min20min第7页，本讲稿共15页注意事项：注意事项：u称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再取另一种药品。试剂
12、瓶取一种药品后，洗净，擦干，再取另一种药品。试剂瓶盖不要盖错。盖不要盖错。u在配制好培养基后一定要注意调培养基溶液的在配制好培养基后一定要注意调培养基溶液的pHpH。u在烧杯融化琼脂和明胶的过程中，人要在电炉旁看着，在烧杯融化琼脂和明胶的过程中，人要在电炉旁看着，以免培养基因沸腾而溢出烧杯。同时，需不断搅拌，以免培养基因沸腾而溢出烧杯。同时，需不断搅拌，以防琼脂和明胶糊底烧焦。以防琼脂和明胶糊底烧焦。u分装过程中，注意不要使培养基沾在管口上，以免沾污试分装过程中，注意不要使培养基沾在管口上，以免沾污试管塞而引起污染。管塞而引起污染。第8页，本讲稿共15页 培养基配制实验分组与任务 一排为一组，
13、一排为一组，6 6人人/每组每组第第1-21-2组组：各配制200ml淀粉培养基，装入250ml三角瓶内。各装一筒培养皿，以备灭菌后用。第第3-43-4组：组：各配制250ml明胶培养基，分装25支试管，每支试管装液量为试管高度的三分之一，灭菌后直立摆放。第第5 5组：组：配制300ml葡萄糖发酵培养基，分装成40支试管，每支试管装液量以浸没小倒管为宜。第第6 6组组：配制300ml乳糖发酵培养基，分装成40支试管，每支试管装液量以浸没小倒管为宜。第7组：配制400ml牛肉膏蛋白胨培养基,装入一个500ml三角瓶内。第8组：配制200ml牛肉膏蛋白胨培养基,分装成20支试管，每支试管装液量为试
14、管高度的四分之一，灭菌后摆成斜面第9页，本讲稿共15页四、操作步骤2 2、高压蒸汽灭菌、高压蒸汽灭菌检检检检查查查查高高高高压压压压锅锅锅锅水水水水位位位位 将将将将待待待待灭灭灭灭菌菌菌菌物物物物品品品品放放放放在在在在提提提提篮篮篮篮里里里里 盖盖盖盖上上上上锅锅锅锅盖盖盖盖，旋旋旋旋紧紧紧紧螺螺螺螺丝丝丝丝 加加加加热热热热，打打打打开开开开放放放放汽汽汽汽阀阀阀阀，排排排排出出出出冷冷冷冷空空空空气气气气 直直直直至至至至冒冒冒冒出出出出白白白白色色色色蒸蒸蒸蒸汽汽汽汽为为为为止止止止 关关关关闭闭闭闭放放放放汽汽汽汽阀阀阀阀 上上上上磅磅磅磅至至至至所所所所需需需需压压压压力力力力
15、维维维维持持持持至至至至所所所所需需需需时时时时间间间间 切切切切断断断断电电电电源源源源 待待待待压压压压力力力力降降降降至至至至零零零零打打打打开开开开锅锅锅锅盖盖盖盖，取取取取出出出出灭灭灭灭菌菌菌菌物物物物品品品品 摆摆摆摆成成成成斜斜斜斜面面面面或或或或直直直直立立立立 冷冷冷冷凝凝凝凝后后后后置置置置37370 0C C培培培培养养养养箱箱箱箱内内内内培培培培养养养养24h24h，检查灭菌是否彻底，检查灭菌是否彻底，检查灭菌是否彻底，检查灭菌是否彻底第10页，本讲稿共15页压压压压 力力力力 数数数数全部空全部空全部空全部空气排出气排出气排出气排出时的温时的温时的温时的温度度度度/
16、0 0C C2/32/3空气空气空气空气排出时排出时排出时排出时的温度的温度的温度的温度/0 0C C1/21/2空气空气空气空气排出时排出时排出时排出时的温度的温度的温度的温度/0 0C C1/31/3空气空气空气空气排出时排出时排出时排出时的温度的温度的温度的温度/0 0C C空气全空气全空气全空气全不排出不排出不排出不排出时的温时的温时的温时的温度度度度/0 0C CMPaMPaKg/cmKg/cm2 2Ib/inIb/in2 20.030.030.070.070.100.100.140.140.170.170.210.210.350.350.700.701.051.051.401.40
17、1.751.752.102.105 510101515202025253030108.8108.8115.6115.6121.3121.3126.2126.2130.0130.0134.6134.61001001091091151151211211261261301309494105105112112118118124124128128909010010010910911511512112112612672729090100100109109115115121121 灭菌锅留有不同分量空气时灭菌锅留有不同分量空气时,压力与温度的关系压力与温度的关系第11页，本讲稿共15页注意事项：注意事项：u
18、 u要检查高压锅的水位，以免高压灭菌锅被损坏；要检查高压锅的水位，以免高压灭菌锅被损坏；要检查高压锅的水位，以免高压灭菌锅被损坏；要检查高压锅的水位，以免高压灭菌锅被损坏；u 要排尽高压锅内的冷空气，以免造成假压，达不到压要排尽高压锅内的冷空气，以免造成假压，达不到压力表所指示的相应温度。力表所指示的相应温度。u待压力表降为待压力表降为“0 0”时，放可打开高压锅锅盖，以免烫时，放可打开高压锅锅盖，以免烫伤；伤；第12页，本讲稿共15页五、实验数据及处理结果五、实验数据及处理结果 记录你配制的培养基的组成和各成分的实际用量，记录你配制的培养基的组成和各成分的实际用量，记录你配制的培养基的组成和
19、各成分的实际用量，记录你配制的培养基的组成和各成分的实际用量，以及采用的灭菌温度及维持时间。以及采用的灭菌温度及维持时间。以及采用的灭菌温度及维持时间。以及采用的灭菌温度及维持时间。第13页，本讲稿共15页六、思考与讨论思考与讨论1 1、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的培养基是无菌的培养基是无菌的培养基是无菌的。2 2 2 2、高高高高压压压压蒸蒸蒸蒸汽汽汽汽灭灭灭灭菌菌菌菌锅锅锅锅开开开开始始始始灭灭灭灭菌
20、菌菌菌之之之之前前前前，为为为为什什什什么么么么要要要要将将将将锅锅锅锅内内内内冷冷冷冷空空空空气气气气排排排排尽尽尽尽？灭灭灭灭菌菌菌菌完完完完毕毕毕毕后后后后，为为为为什什什什么么么么要要要要待待待待压压压压力力力力降降降降为为为为“0 0 0 0”时时时时才才才才能能能能打打打打开开开开排排排排气阀，开盖取物气阀，开盖取物气阀，开盖取物气阀，开盖取物。3 3、灭菌在微生物实验操作中有何重要意义？、灭菌在微生物实验操作中有何重要意义？、灭菌在微生物实验操作中有何重要意义？、灭菌在微生物实验操作中有何重要意义？下次实验项目：大分子物质的水解和糖发酵试验下次实验项目：大分子物质的水解和糖发酵试
21、验下次实验项目：大分子物质的水解和糖发酵试验下次实验项目：大分子物质的水解和糖发酵试验第14页，本讲稿共15页1 1 1 1）牛肉膏蛋白胨培养基）牛肉膏蛋白胨培养基）牛肉膏蛋白胨培养基）牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏牛肉膏牛肉膏牛肉膏 3g 3g 3g 3g；蛋白胨；蛋白胨；蛋白胨；蛋白胨 10g 10g 10g 10g；NaCl 5gNaCl 5gNaCl 5gNaCl 5g；琼脂；琼脂；琼脂；琼脂15-20g15-20g15-20g15-20g；水；水；水；水1000ml1000ml1000ml1000mlpH 7.0-7.2pH 7.0-7.2pH 7.0-7.2pH 7.0-7.2；1211
22、211211210 0 0 0C C C C灭菌灭菌灭菌灭菌20min20min20min20min。2 2 2 2）淀粉培养基的配制淀粉培养基的配制淀粉培养基的配制淀粉培养基的配制蛋白胨蛋白胨蛋白胨蛋白胨 10g 10g 10g 10g；NaCl 5g NaCl 5g NaCl 5g NaCl 5g；牛肉膏；牛肉膏；牛肉膏；牛肉膏 5g 5g 5g 5g；可溶性淀粉；可溶性淀粉；可溶性淀粉；可溶性淀粉 2g 2g 2g 2g；琼脂；琼脂；琼脂；琼脂15-15-15-15-20g20g20g20g；水；水；水；水1000ml1000ml1000ml1000ml；1211211211210 0
23、0 0C C C C灭菌灭菌灭菌灭菌20min20min20min20min。3 3 3 3）明胶培养基的配制）明胶培养基的配制）明胶培养基的配制）明胶培养基的配制牛肉膏蛋白胨液牛肉膏蛋白胨液牛肉膏蛋白胨液牛肉膏蛋白胨液 100ml 100ml 100ml 100ml 明胶明胶明胶明胶12-18g12-18g12-18g12-18g；pH 7.2-7.4pH 7.2-7.4pH 7.2-7.4pH 7.2-7.4；1211211211210 0 0 0C C C C灭菌灭菌灭菌灭菌30min30min30min30min。4 4）乳糖（或葡萄糖）乳糖（或葡萄糖）乳糖（或葡萄糖）乳糖（或葡萄糖）
24、蛋白胨培养基的配制蛋白胨培养基的配制蛋白胨培养基的配制蛋白胨培养基的配制蛋白胨蛋白胨蛋白胨蛋白胨 10g 10g 10g 10g；牛肉膏；牛肉膏；牛肉膏；牛肉膏 3g 3g 3g 3g；乳糖（或葡萄糖）乳糖（或葡萄糖）乳糖（或葡萄糖）乳糖（或葡萄糖）5g5g5g5g；NaCl 5g NaCl 5g NaCl 5g NaCl 5g；1.6%1.6%1.6%1.6%溴甲溴甲溴甲溴甲酚紫乙醇溶液酚紫乙醇溶液酚紫乙醇溶液酚紫乙醇溶液 1ml 1ml 1ml 1ml；水；水；水；水1000ml1000ml1000ml1000ml；pH 7.2-7.4 pH 7.2-7.4 pH 7.2-7.4 pH 7.2-7.4；1151151151150 0 0 0C C C C灭菌灭菌灭菌灭菌20min20min20min20min。第15页，本讲稿共15页