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1、实 验培养基的制备和灭菌培养基的制备和灭菌 主讲：廖鹏飞主讲：廖鹏飞E-mail:lfp_南昌大学生物基础实验中心南昌大学生物基础实验中心一、目的要求了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。程。了解几种灭菌方法，重点掌握高压蒸汽灭菌法了解几种灭菌方法，重点掌握高压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法的原理及其使用方法。二、基本原理培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、生长因子以及水分等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适酸碱度范围内才能表现它们最大生命力，因此不同种类的微生物应将培养基调到
2、一定pH值范围。培养基种类很多，不同的微生物所需培养基不同。按其组成可分合成培养基和天然培养基。按其物理状态可分固体培养基，液体培养基和半固体培养基。按其特殊用途可分加富培养基，选择培养基、鉴别培养基。培养基配制后还必须进行灭菌。灭菌和消毒是二个不同含义的名词。消毒是指消灭病原菌或有害微生物，而灭菌则是杀死或消灭一定环境中的所有微生物。消毒与灭菌的方法很多，但总的可分为物理法与化学法两大类。物理法包括加热灭菌（干热灭菌与湿热灭菌），过滤灭菌、紫外线灭菌等。化学方法主要是利用有机或无机的化学药品对实验室用具和其它物体表面进行灭菌与消毒。三、实验分组与任务整个班分整个班分1010个组，一排为一组，
3、每组六人个组，一排为一组，每组六人第第1-21-2组组：配制200ml牛肉膏蛋白胨培养基,分装成15支试管，每支试管装液量为试管高度的四分之一第第3-43-4组：组：配制200ml葡萄糖发酵培养基，分装成15支试管，每支试管装液量为试管高度的四分之一第第5-65-6组组：配制200ml乳糖发酵培养基，分装成15支试管，每支试管装液量为试管高度的四分之一第7-8组：配制150ml明胶培养基，分装成15支试管，每支试管装液量为试管高度的四分之一第9-10组：配制300ml淀粉培养基。用两个三角瓶装好1 1、牛肉膏蛋白胨培养基配方（见实验课本、牛肉膏蛋白胨培养基配方（见实验课本214214页页）2
4、2、葡萄糖发酵培养基配方（见实验课本葡萄糖发酵培养基配方（见实验课本217217页页）3 3、乳糖发酵、乳糖发酵培养基配方（见实验课本培养基配方（见实验课本217217页页）4 4、明胶明胶培养基配方（见实验课本培养基配方（见实验课本217217页页）5 5、淀粉培养基淀粉培养基配方（见实验课本配方（见实验课本217217页页）四、各培养基的配方四、实验内容（一）、培养基的配制：同学们先将试管贴好标签。注明培养基名称，日期。标签粘贴位置在离管口1/3管身处。注意：标签用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹注意：标签用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹 操作图示：操作图示：3注意事项：u在配制
5、培养基时一定要注意调溶液的pH。u 称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再取另一种药品。瓶盖也不要盖错。u 在烧杯融化琼脂的过程中，人要在电炉旁看着，以免培养基因沸腾而溢出烧杯。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。注意带上棉纱手套防止烫伤。u 分装过程中，注意不要使培养基沾在管口上，以免沾污棉塞而引起污染。四、实验内容（二）培养基灭菌 培养基分装好后，塞上棉塞，外面再包一牛皮纸，便可灭菌。灭菌的时间和温度按各培养基规定进行，以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分。培养基经灭菌后，可放在37恒温箱培养24小时，无菌者方可使用。在实验室里用得最多的加热灭菌法是
6、高压蒸汽灭菌和干热灭菌。一般培养基和灭菌水等用高压蒸汽灭菌，而玻璃器皿常用干热灭菌。蒸汽灭菌为105-121，15-20分钟，干热灭菌为160-170，1-2小时。目的都是使细菌体内蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固，同时湿热穿透力强，而且当蒸汽与被灭菌物体接触凝成水分时，又可放出热量，使温度迅速增高，从而增加灭菌效力。四、实验内容四、实验内容 高压蒸汽灭菌法其步骤如下：高压蒸汽灭菌法其步骤如下：高压蒸汽灭菌法其步骤如下：高压蒸汽灭菌法其步骤如下：1.1.1.1.灭菌器内加入一定量的水，将包扎好的物品放入其中。灭
7、菌器内加入一定量的水，将包扎好的物品放入其中。灭菌器内加入一定量的水，将包扎好的物品放入其中。灭菌器内加入一定量的水，将包扎好的物品放入其中。2.2.2.2.接通电源，进行加热接通电源，进行加热接通电源，进行加热接通电源，进行加热3.3.3.3.排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0
8、.5kg/cm20.5kg/cm20.5kg/cm20.5kg/cm2时时时时再打开排气阀，待压力回复到再打开排气阀，待压力回复到再打开排气阀，待压力回复到再打开排气阀，待压力回复到0 0 0 0时再关闭排气阀。时再关闭排气阀。时再关闭排气阀。时再关闭排气阀。4.4.4.4.当压力达当压力达当压力达当压力达1.05kg/cm21.05kg/cm21.05kg/cm21.05kg/cm2时，此时灭菌器内的温度为时，此时灭菌器内的温度为时，此时灭菌器内的温度为时，此时灭菌器内的温度为121121121121，维持维持维持维持30min30min30min30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、
9、氨基酸等。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。物时，应适当降低压力，延长时间。物时，应适当降低压力，延长时间。物时，应适当降低压力，延长时间。5.5.5.5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品排气阀，然后打开灭菌器盖，取
10、出物品五、实验报告思考题：u 培养基应具备哪些条件?u 在培养基配制操作过程中应注意什么问题?为什么?u 培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养 基是无菌的?u 高压蒸汽灭菌前为什么要将灭菌锅内的冷空气排尽?u 玻璃器皿为什么在灭菌前要先行干燥?u 加热蒸汽灭菌为什么比干热灭菌所要求的温度低、时间短？实 验大分子物质的水解实验及糖发酵实验一、实验目的1.1.证明不同的微生物对各种有机大分子的水解能证明不同的微生物对各种有机大分子的水解能力的不同，从而说明不同微生物有着不同的酶力的不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。系统。2.2.掌握进行微生物大分子水解实验的原理和方法掌握
11、进行微生物大分子水解实验的原理和方法3.3.了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用作用4.4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法二、实验原理微生物代谢与其他生物代谢有着许多相似之处，也有不同之处。微生物代谢重要特征之一，就是代谢类型的多样性，因此使得微生物在自然界的物质循环中起着重要的作用，同时也为人类开发利用微生物资源提供更多的机会与途径。人们在微生物的分类鉴定工作中，常利用其生理生化反应作用作为重要依据。本实验分别安排微生物对生物大分子的分解利用（淀粉水解实验水解试验、明胶液化试验），对含碳化合物的分解利用（糖
12、发酵试验）让同学们对微生物的代谢类型多样性有一个初步和感性的了解，同时学习利用微生物形态、结构以及生化反应的特征对某些细菌进行初步的分类。本实验学习平板接种法、穿刺接种法、液体接种法。三、实验材料 1培养基：培养基：淀粉水解培养基：2皿 明胶液化培养基：2支 葡萄糖发酵培养基：3支 乳糖发酵培养基：3支2.接种用具：接种环（针、钩），酒精灯，镊子，消毒棉球，打火机，标签贴纸，废物杯，纸巾，油性笔。3.实验菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌四、实验内容试验名称试验名称培养基名称培养基名称接种菌名称接种菌名称接种菌名称接种菌名称 接种方式接种方式接种方式接种方式 每组个数每组个数每组个数每
13、组个数淀粉水解淀粉培养基淀粉培养基枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌/大肠杆菌大肠杆菌 平板平板2 2明胶水解明胶培养基明胶培养基枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌/大肠杆菌大肠杆菌穿刺穿刺2 2葡萄糖发葡萄糖发酵酵葡萄糖发酵培葡萄糖发酵培养基养基大肠杆菌和变大肠杆菌和变形杆菌形杆菌液体液体3 3乳糖发酵乳糖发酵乳糖发酵培养乳糖发酵培养基基大肠杆菌和变大肠杆菌和变形杆菌形杆菌液体液体3 3四、实验内容（1）将固体淀粉培养基溶化后冷却至50，无菌操作制成平板（2）用记号笔在平皿背面划成两部分。（3）将枯草芽孢杆菌，大肠杆菌分别在不同的部分划线接种，并在平板的反面分别记下两部分的菌名。（3）将接完种的平板倒置于37恒
14、温培养箱，培养24h。（4）观察结果时，可打开皿盖，滴加少量的碘液于平板上，轻轻 旋转，是碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明 圈，则说明淀粉已被水解，为阳性。透明圈的大小，说明该 菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外酶活力的高低。（以 “+”、“”表示有无透明圈）操作步骤：操作步骤：1.1.淀粉水解试验：（淀粉水解试验：（2 2皿）皿）四、实验内容（1）取两支明胶培养基试管，用记号笔标明各管欲接种菌的菌名。（2）用接种针分别以穿刺接种法接种枯草芽孢杆菌和大肠杆菌于对应的明胶培养基中。（2）接种后置于20恒温培养箱，培养2-5d。（3）观察结果时，注意培养基有无液化现象。（以“+”、“”表
15、示有无液化现象）注意：如果细菌在20时不能生长，则必须培养在所需的最适温度下，观察结果时需将试管从恒温箱里取出，置于冰浴中，才能观察液化程度。2.明胶液化试验：明胶液化试验：四、实验内容（1）用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。（2）取葡萄糖发酵培养基试管3支，以液体接种的方式分别接种变形杆菌和大肠杆菌，第三支不接种，作为对照。另取乳糖发酵培养基试管3支，同样分别接入变形杆菌和大肠杆菌，第三支不接种，作为对照。接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小试管进入气泡。（3）将接种过和作为对照的6支试管置于37恒温培养箱，培养24h。（4）观察结果时，看各管颜色变化及杜氏小管有无气泡。3.3.糖类发酵试验：糖类发酵试验：图 糖类发酵试验 五、实验报告菌名菌名淀粉水解试验淀粉水解试验明胶液化试验明胶液化试验枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌大肠杆菌大肠杆菌1、结果（1）大分子物质水解实验结果将结果填入下表。“”表示阳性，“”表示阴性（2）糖发酵实验结果 将结果填入下表。“”表示产酸或产气，“”表示不产酸或不产气。糖类发酵大肠杆菌变形杆菌对照产酸产气产酸产气产酸产气葡萄糖发酵葡萄糖发酵乳糖发酵乳糖发酵