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1、关于高效液相色谱法简介1第一页，讲稿共四十三页哦2 液液相相色色谱谱分分析析是是在在经经典典的的液液体体柱柱色色谱谱基基础础上上，引引入入了了气气相相色色谱谱的的理理论论；在在技技术术上上采采用用了了高高压压泵泵、高高效效固固定定相相和和高高灵灵敏敏度度检检测测器器，实实现现了了分分析析速速度度快快、分分离离效效率率高高和和操操作作自自动动化化，这这种种柱柱色色谱谱技技术术被被称称做做高高效效液液相相色色谱法。谱法。第二页，讲稿共四十三页哦3慢慢中等中等快快色谱分离色谱分离Temporal course淋洗液淋洗液第三页，讲稿共四十三页哦4 叶绿素的柱色谱叶绿素的柱色谱第四页，讲稿共四十三页哦
2、5三组分混合物的分离三组分混合物的分离第五页，讲稿共四十三页哦6在在C18C18柱中，三组分混合物流出色谱柱中，三组分混合物流出色谱柱的顺序为：萘，联二苯、蒽。柱的顺序为：萘，联二苯、蒽。当试样混合物进入色谱柱后，就在固定相和流动相当试样混合物进入色谱柱后，就在固定相和流动相之间不断地进行分配平衡。不同的化合物，分子结构不之间不断地进行分配平衡。不同的化合物，分子结构不同，存在理化性质的差异，所以在两相中存在的浓度也同，存在理化性质的差异，所以在两相中存在的浓度也各不相同。固定相中存在量多的化合物，冲洗出柱子的各不相同。固定相中存在量多的化合物，冲洗出柱子的时间就长，反之则短。这与分配系数有关
3、：时间就长，反之则短。这与分配系数有关：K K=化合物在固定相中的浓度化合物在固定相中的浓度C C固固 化合物在流动相中的浓度化合物在流动相中的浓度C C流流 K K值小，先流出柱子，值小，先流出柱子，K K值大的，保留作用强，后流出值大的，保留作用强，后流出柱子。柱子。第六页，讲稿共四十三页哦7第七页，讲稿共四十三页哦8 键合相键合相-反相色谱反相色谱第八页，讲稿共四十三页哦91.概 述色谱法：色谱法：(chromatography)(chromatography)：以试样组分在固定相和流动相间的溶解、吸附、以试样组分在固定相和流动相间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据而
4、建分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法称色谱法。立起来的各种分离分析方法称色谱法。几个概念几个概念色谱柱：进行色谱分离用的细长管。色谱柱：进行色谱分离用的细长管。固定相：管内保持固定相：管内保持固定、起分离固定、起分离作用的填充物。作用的填充物。流动相：流经固定相的空隙或表面的冲洗剂。流动相：流经固定相的空隙或表面的冲洗剂。第九页，讲稿共四十三页哦101-4 1-4 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点一一 高压高压 液液相相色色谱谱以以液液体体作作为为流流动动相相（称称为为载载液液），液液体体流流经经色色谱谱柱柱时时，受受到到的的阻阻力力较较大大，为为了了
5、能能迅迅速速地地通通过过色色谱谱柱柱，必必须须对对载载液液施施加加高高压压。在在现现代代液液体体色色谱谱中中供供液液压压力力和和进进样样压压力力都都很很高高，一一般般可可达到达到150300kgcm2，甚至可达，甚至可达700kcm2以上。以上。第十页，讲稿共四十三页哦11二二 高速高速 高效液相色谱所需的分析时间较之经典液高效液相色谱所需的分析时间较之经典液体色谱快得多，一般可达体色谱快得多，一般可达l10mLmin，个别可高达个别可高达100mLmin以上，这已近似于气以上，这已近似于气相色谱的流速。相色谱的流速。三三 高效高效 气相色谱的分离效能很高，高效液相色谱气相色谱的分离效能很高，
6、高效液相色谱的柱效则更高，一般约可达的柱效则更高，一般约可达 60000理论塔板理论塔板米米；第十一页，讲稿共四十三页哦12四四 高灵敏度高灵敏度 紫紫外外检检测测器器的的最最小小检检测测量量可可达达毫毫微微克克数数量量级级(10-9 g)；荧荧光光检检测测器器的的灵灵敏敏度度可可达达10-11g。高高效效液液相相色色谱谱的的高高灵灵敏敏度度还还表表现现在在所所需需试试样样很很少少；微升数量级的样品就足以进行全分析。微升数量级的样品就足以进行全分析。第十二页，讲稿共四十三页哦131-5 1-5 高效液相色谱流程和设备高效液相色谱流程和设备 高效液相色谱仪一般可分为高效液相色谱仪一般可分为5 5
7、个主要部分：个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有此外还配有辅助装置辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及：如梯度淋洗，自动进样及数据处理数据处理等。其工作过程如下：等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪
8、将检测器送出的信号记录序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。下来，由此得到液相色谱图。第十三页，讲稿共四十三页哦14第十四页，讲稿共四十三页哦15样品吸收度测定吸收池示图第十五页，讲稿共四十三页哦16紫外检测器工作原理紫外检测器工作原理第十六页，讲稿共四十三页哦17第十七页，讲稿共四十三页哦18 开始分析开始分析开始分析开始分析 废废液液样样品品 淋洗液淋洗液 至分离柱至分离柱进样阀进样阀 样样品品 装装装装样样样样 废废液液 淋洗液淋洗液至分离柱至分离柱 定量定量环进样环进样（）（）（）（）样样品品环环第十八页，讲稿共四十三页哦19液相色谱动画演示液相色谱动画演
9、示第十九页，讲稿共四十三页哦20二、色谱图二、色谱图（chromatogramchromatogramchromatogramchromatogram）试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经过检试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化转变为相应测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化转变为相应的电信号，由记录仪所记录下的信号的电信号，由记录仪所记录下的信号时间曲线或信号时间曲线或信号流动相体积曲线，称为色谱流出曲线，或色谱流动相体积曲线，称为色谱流出曲线，或色谱图。如图图。如图12-212-2常用术语：常用术语：1.1.基线基线 :在操作条件下，仅
10、有在操作条件下，仅有纯流动相纯流动相进入检测进入检测器时的流出曲线。器时的流出曲线。第二十页，讲稿共四十三页哦212.2.色谱峰色谱峰:当组分随流动相进入检测器时，当组分随流动相进入检测器时，其响应信号大小随时间变化所形成的峰形曲线。其响应信号大小随时间变化所形成的峰形曲线。正常的色谱峰呈正态分布正常的色谱峰呈正态分布。3 3 3 3.峰高与峰面积峰高与峰面积峰高：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离峰高：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高称为峰高(peak height)(peak height)。用。用h h表示。表示。峰面积：峰与峰底之间的面积称为峰面积峰面积：峰与峰底之间的面积称为峰面积
11、(peak area)(peak area)，用，用A A表示。表示。第二十一页，讲稿共四十三页哦2221 保保 留留 值值 一、保留时间（一、保留时间（tR）从从进进样样开开始始到到柱柱后后出出现现样样品品的的浓浓度度极极大大值值所需的时间为保留时间，用所需的时间为保留时间，用tR表示。表示。第二十二页，讲稿共四十三页哦232-2 2-2 色谱柱的分离效率及柱效能的评价色谱柱的分离效率及柱效能的评价 一、塔板理论一、塔板理论 塔板理论认为，一根柱子可以分为塔板理论认为，一根柱子可以分为n段，在段，在每段内组分在两相间很快达到平衡，把每一段称为每段内组分在两相间很快达到平衡，把每一段称为一块理
12、论塔板。设柱长为一块理论塔板。设柱长为L，理论塔板高度为，理论塔板高度为H，则，则 H=L/n式中式中n为理论塔板数。为理论塔板数。第二十三页，讲稿共四十三页哦24 色色谱谱柱柱的的分分离离效效率率（简简称称柱柱效效），可可定量地用理论塔板数定量地用理论塔板数N来表示。来表示。理论塔板数一理论塔板数一N还与柱长有关，当比还与柱长有关，当比较两不同长度的色谱柱的柱效时，应当较两不同长度的色谱柱的柱效时，应当比较它们在相同柱长下的比较它们在相同柱长下的V值。值。第二十四页，讲稿共四十三页哦25 可可用用半半峰峰高高处处的的峰峰宽宽(半半峰峰宽宽）和和保保留留时时间间的的关关系来表示理论塔板数系来表
13、示理论塔板数N，这时关系式为：，这时关系式为：N554(tR/Wt1/2)2 2式中式中：Wt1/2 -半峰宽半峰宽例例如如，从从图图2-3，测测得得tR=105mm、Wt1/2=4mm，求求得得N=3789，若若此此柱柱长长为为250mm,折折成成每每米米的的理理论论塔塔板板数数约约为为15200.第二十五页，讲稿共四十三页哦262-3 分离度及影响因素分离度及影响因素一一 分离度（分辨率分离度（分辨率)研究色谱中有关分离问题时，首先就是要研究色谱中有关分离问题时，首先就是要能定量地确定相邻两峰的分离程度。能定量地确定相邻两峰的分离程度。从从图图8-3可可以以看看出出，为为了了获获得得较较好
14、好的的分分离离，就就必必须须使使最最大大峰峰值值之之间间的的距距离离增增加加，峰峰宽宽减减小。小。第二十六页，讲稿共四十三页哦27第二十七页，讲稿共四十三页哦28 一一般般用用Rs来来定定量量表表达达相相邻邻两两峰峰的的分分离离程程度度，所所以以Rs是是色色谱谱中中两两个个组组分分分分离离好好坏坏程程度度的的标志。要求标志。要求RS1.5 tR1 tR2 Rs=1/2(W1+W2)式中式中 tR1、tR2 分别为两组分的保留时间，分别为两组分的保留时间，W1、W2为色谱峰的峰底宽度为色谱峰的峰底宽度.第二十八页，讲稿共四十三页哦295 5 高效液相色谱的定性和定量分析高效液相色谱的定性和定量分
15、析 5-1 5-1 定性分析定性分析 在液相色谱中保留值定性的方法主要是用直接在液相色谱中保留值定性的方法主要是用直接与已知标准物对照的方法。当未知峰的保留值（与已知标准物对照的方法。当未知峰的保留值（t t RR或或V R V R ）与某一已知标准物完全相同时，）与某一已知标准物完全相同时，则未知峰可能与此已知标准物是同一物质，特则未知峰可能与此已知标准物是同一物质，特别是在改变色谱柱或改变洗脱液的组成时，未别是在改变色谱柱或改变洗脱液的组成时，未知峰的保留值与已知标准物的保留值仍能完全知峰的保留值与已知标准物的保留值仍能完全相同，则可以基本上认定未知峰与标准物是同相同，则可以基本上认定未知
16、峰与标准物是同一物质。一物质。第二十九页，讲稿共四十三页哦305-2 5-2 定量分析定量分析 HPLC色谱定量的基本方法有色谱定量的基本方法有内标法、内标法、外标法等。外标法等。外标法外标法标准曲线法标准曲线法 是是一一种种简简便便、快快速速的的绝绝对对定定量量方方法法（归归一一化化法法则则是是相相对对定定量量方方法法）。首首先先用用欲欲测测组组分分的的标标准准样样品品绘绘制制标标准准工工作作曲线曲线。第三十页，讲稿共四十三页哦31具体作法是具体作法是：用用标标准准样样品品配配制制成成不不同同浓浓度度的的标标准准系系列列，在在与与欲欲测测组组分分相相同同的的色色谱谱条条件件下下，等等体体积积
17、准准确确量量进进样样，测测量量各各峰峰的的峰峰面面积积或或峰峰高高，用用峰峰面面积积或或峰峰高高对对样样品品浓浓度度绘绘制制标标准准工工作作曲曲线线，此此标标准准工工作作曲曲线线应应是是通通过过原原点点的的直直线线。若若标标准准工工作作曲曲线线不不通通过过原原点点，说说明明测测定定方方法法存存在在系系统统误误差差。标标准准工工作作曲曲线线的的斜斜率率即即为为绝绝对对校校正正因子。因子。第三十一页，讲稿共四十三页哦32 目前已普及于几乎所有重要的分析学科领域和目前已普及于几乎所有重要的分析学科领域和许多科研生产部门，高效液相色谱能较理想地分离许多科研生产部门，高效液相色谱能较理想地分离和分析与生
18、物医学有关的大分子和离子型物质，易和分析与生物医学有关的大分子和离子型物质，易变质的天然产物，各种高分子化合物和不稳定化合变质的天然产物，各种高分子化合物和不稳定化合物。物。例如例如：蛋白质、核酸、氨基酸、多糖、颜料蛋白质、核酸、氨基酸、多糖、颜料极性类脂肪化合物、药物、染料、表面活性极性类脂肪化合物、药物、染料、表面活性剂、农药、甾族化合物、多环芳烃、合成聚剂、农药、甾族化合物、多环芳烃、合成聚合物、瞟吟、维生素、除锈剂、防老剂等等。合物、瞟吟、维生素、除锈剂、防老剂等等。第三十二页，讲稿共四十三页哦33 高高效效液液相相色色谱谱，特特别别适适用用于于分分离离沸沸点点高高和和热热稳稳定定性性差差的的物物质质，目目前前已已广广泛泛用用于于化化工工、食食品品、医医药药、生生化化、卫卫生生、环环境境保保护护和和高高能能化化合合物物等等生生产产和和科科研研工作中工作中。第三十三页，讲稿共四十三页哦34 第三十四页，讲稿共四十三页哦35第三十五页，讲稿共四十三页哦36第三十六页，讲稿共四十三页哦37第三十七页，讲稿共四十三页哦38第三十八页，讲稿共四十三页哦39紫杉醇的分析紫杉醇的分析第三十九页，讲稿共四十三页哦40第四十页，讲稿共四十三页哦41农药的分析农药的分析第四十一页，讲稿共四十三页哦42第四十二页，讲稿共四十三页哦感谢大家观看第四十三页，讲稿共四十三页哦