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1、关于高效液相色谱法(8)第一页，讲稿共三十四页哦2一、一、概述概述高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法与经典液相色谱法经典液相柱色经典液相柱色谱装置谱装置高效液相色谱仪高效液相色谱仪经典液相色谱HPLC固定相粒径流动相驱动方式流动相流速150-200 m重力或低压泵很慢3-10 m高压泵快(1-10mL/min)例：分离例：分离20种氨基酸种氨基酸柱长：柱长：170 cm柱径：柱径：0.9 cmF：30 mL/ht分离分离:20 h经典柱色谱HPLCt分离分离：1 h第二页，讲稿共三十四页哦3二、二、基本理论基本理论1 1、色谱柱柱效的基本关系式、色谱柱柱效的基本关系式2 2、分离度、
2、分离度第三页，讲稿共三十四页哦43 3、速率方程速率方程溶质在液相流动相中溶质在液相流动相中的扩散系数，约为气的扩散系数，约为气相中扩散系数的万分相中扩散系数的万分之一之一第四页，讲稿共三十四页哦5流动相流速对板高的影响流动相流速对板高的影响1)小颗粒填料，填充均匀；小颗粒填料，填充均匀；2)选择较低的流动相流速；选择较低的流动相流速；3)选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。修正的速率方程：修正的速率方程：提高柱效途径第五页，讲稿共三十四页哦6三、三、高效液相色谱分离方法高效液相色谱分离方法1 1、吸附色谱法、吸附色谱法 分离原理分离原理Kad值越大，保留时
3、间越长。值越大，保留时间越长。第六页，讲稿共三十四页哦7固定相固定相硅胶强极性硅胶强极性氧化铝弱极性氧化铝弱极性活性炭非极性活性炭非极性分子筛分子筛强极性强极性高分子多孔微球高分子多孔微球(GDX)固体吸附剂固体吸附剂第七页，讲稿共三十四页哦82 2、离子交换色谱法离子交换色谱法阳离子交换树脂阳离子交换树脂阳离子交换阳离子交换阴离子交换阴离子交换分离原理分离原理第八页，讲稿共三十四页哦9 固定相固定相阳离子阳离子：SO3H(强强)CO2H(弱弱)阴离子：阴离子：N+R3(强强)NH2(弱弱)基质合成树脂合成树脂纤维素纤维素硅胶硅胶离子交换剂第九页，讲稿共三十四页哦10 流动相流动相水相水相缓冲
4、液缓冲液+有机改性剂有机改性剂调节选择性的主要参数盐种类及浓度盐种类及浓度pH值值各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快第十页，讲稿共三十四页哦11 应用：应用：离子及可离解的化合物离子及可离解的化合物如氨基酸、核酸、蛋白质等如氨基酸、核酸、蛋白质等第十一页，讲稿共三十四页哦123、化学键合相色谱化学键合相色谱采用化学键合相的液相色谱固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它将各种极性的官能团键合到载体表面，因此
5、它适用于种类繁多样品的分离。适用于种类繁多样品的分离。特点特点第十二页，讲稿共三十四页哦13键合固定相制备键合固定相制备ODS(C18)键合相键合相硅胶硅胶十八烷基十八烷基氯硅烷氯硅烷非极性非极性硅烷化反应硅烷化反应使用使用pH范围：范围：2-8第十三页，讲稿共三十四页哦14键合固定相类型疏水基团疏水基团烷烃（烷烃（C8和和C18）、苯基等）、苯基等极性基团极性基团丙氨基丙氨基氰乙基氰乙基醚和醇等醚和醇等离子交换基团离子交换基团胺基、季铵盐胺基、季铵盐磺酸、羧酸磺酸、羧酸第十四页，讲稿共三十四页哦15键合相色谱法分类键合相色谱法分类反相键合相色谱反相键合相色谱:常用固定相：常用固定相：C18分
6、离对象分离对象:非极性非极性中等极性化合物中等极性化合物常用流动相常用流动相甲醇甲醇-水水乙睛乙睛-水水反相键合相色谱反相键合相色谱疏溶剂分离机制疏溶剂分离机制固定相极性固定相极性 流动相极性流动相极性离子性键合相色谱离子性键合相色谱将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质表面上，将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质表面上，就形成了离子性键合相色谱的固定相。其分离原就形成了离子性键合相色谱的固定相。其分离原理与离子交换色谱类同。理与离子交换色谱类同。第十六页，讲稿共三十四页哦17例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇-水水出峰顺序：苯酚，甲苯出峰顺序：苯酚，甲苯出峰顺
7、序：甲苯，苯酚出峰顺序：甲苯，苯酚十八烷基键合相二醇基键合相第十七页，讲稿共三十四页哦18保留时间：保留时间：例：以例：以ODS键合色谱柱、甲醇键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离以下水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。两种苯甲酸，试判断出峰次序。没食子酸没食子酸3,4-二羟基苯甲酸二羟基苯甲酸固定相固定相:非极性非极性;流动相流动相:极性极性组分极性组分极性:3,4-二羟基苯甲酸二羟基苯甲酸没食子酸没食子酸第十八页，讲稿共三十四页哦194 4、尺寸排阻尺寸排阻(凝胶凝胶)色谱法色谱法排阻色谱分离示意图排阻色谱分离示意图相对分子质量差别相对分子质量差别大于大于10的化合物的化合物才可以分
8、离才可以分离分离原理分离原理第十九页，讲稿共三十四页哦20四、四、高效液相色谱仪高效液相色谱仪第二十页，讲稿共三十四页哦21高压泵高压泵流动相溶流动相溶剂剂废液废液色谱柱色谱柱进样口进样口检测器检测器第二十一页，讲稿共三十四页哦221 1、高压输液系统高压输液系统高压泵高压泵要求要求输出压力高输出压力高平稳、脉冲小平稳、脉冲小流量稳定可调流量稳定可调耐腐蚀耐腐蚀第二十二页，讲稿共三十四页哦23梯度洗脱装置梯度洗脱装置 低压梯度低压梯度 高压梯度高压梯度 通过改变流动相的组成来调整组通过改变流动相的组成来调整组分的分的k k值，改变分离因子值，改变分离因子值，以值，以达到最短时间内得到最佳分离的
9、目的。达到最短时间内得到最佳分离的目的。梯度洗脱第二十三页，讲稿共三十四页哦24等度洗脱与梯度洗脱等度洗脱与梯度洗脱第二十四页，讲稿共三十四页哦25贮液瓶及流动相贮液瓶及流动相1)对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。2)适用于所选择的检测器。适用于所选择的检测器。3)化学惰性好，以免破坏固定相。化学惰性好，以免破坏固定相。4)低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。5)纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。对流动相溶剂的一般要求第二十五页，讲稿共三十四页哦262
10、、进样系统进样系统 准备状态准备状态 进样状态进样状态六通阀进样六通阀进样 装置装置自动进样器自动进样器 第二十六页，讲稿共三十四页哦273、色谱柱色谱柱内径：内径：16 mm，柱长：柱长：530 cm；柱填料粒径：柱填料粒径：15 m 分离柱分离柱第二十七页，讲稿共三十四页哦284、检测系统检测系统紫外吸收检测器紫外吸收检测器(a)可变波长紫外检测器可变波长紫外检测器(b)二极管阵列检测器二极管阵列检测器氘灯氘灯光栅光栅流流通通池池测测量量光光电电二二极极管管参比光电二极管参比光电二极管二极管阵列检测器二极管阵列检测器第二十八页，讲稿共三十四页哦29两种检测器的色谱图两种检测器的色谱图(a)
11、：可变波长紫外检测器；可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器二极管阵列检测器(b)(a)第二十九页，讲稿共三十四页哦30紫外检测器紫外检测器灵敏度高，灵敏度高，精密度及线性范围较好精密度及线性范围较好 ，可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。流动相选择有限制。流动相选择有限制。一些常用溶剂的紫外截止波长一些常用溶剂的紫外截止波长溶剂CS2氯仿四氢呋喃苯乙睛甲醇水紫外截止波长（nm）380245212210190205187第三十页，讲稿共三十四页哦31荧光检测器荧光检测器灵敏度高，选择性灵敏度高，选择性好，可用于梯度洗好，可用于梯度洗脱。脱。第三十一页，讲稿共三十四页哦32示差折光检测器示差折光检测器利用组分与流动相利用组分与流动相的折射率之差进行的折射率之差进行检测。检测。通用性好，灵敏度通用性好，灵敏度较低，较低，不适用于梯度不适用于梯度洗脱。洗脱。第三十二页，讲稿共三十四页哦33化学发光检测器化学发光检测器第三十三页，讲稿共三十四页哦27.09.2022感感谢谢大大家家观观看看第三十四页，讲稿共三十四页哦