《高效液相色谱法 (9)精选PPT讲稿.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高效液相色谱法 (9)精选PPT讲稿.ppt（43页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、关于高效液相色谱法(9)第一页，讲稿共四十三页哦2022/10/1一、一、高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 feature of HPLC 特点：高效、高压、高灵敏度、快速、应用广泛特点：高效、高压、高灵敏度、快速、应用广泛 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。第二页，讲稿共四十三页哦2022/10/1（一）固定相（一）固定相高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体刚性固体和和硬胶硬胶两大类。两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受刚性固体以二氧化硅为基质，可承受
2、7.0108109Pa的高压，可的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。第三页，讲稿共四十三页哦2022/10/1由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：离
3、度。对流动相溶剂的要求是：（二）流动相（二）流动相（1）溶剂必须具有合适的极性和良好的选择性；）溶剂必须具有合适的极性和良好的选择性；能溶解样品能溶解样品但不与样品发生反应或聚合。但不与样品发生反应或聚合。（2）选用的选用的溶剂与检测器匹配。溶剂与检测器匹配。第四页，讲稿共四十三页哦2022/10/1（3）高纯度。由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂）高纯度。由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰伪峰”；（4）低粘度（粘度适中）低粘度（粘度适中）；若使用高粘度溶剂，势必增高若使用高粘度溶剂，
4、势必增高压力，不利于分离。压力，不利于分离。第五页，讲稿共四十三页哦2022/10/1液相色谱仪液相色谱仪第六页，讲稿共四十三页哦2022/10/1二、高效液相色谱的流程及主要部件二、高效液相色谱的流程及主要部件 process and main assembly of HPLC1.1.流程图流程图第七页，讲稿共四十三页哦2022/10/12.2.主要部件主要部件高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统处理系统；此外还有一些附属设备，如梯度洗脱、自动；此外还有一些附属设备，如梯度洗脱、自动进样装置。进样装置。(1)(1)高压输液系
5、统高压输液系统（a）高压输液泵：）高压输液泵：主要部件之一，压力：150350105 Pa。第八页，讲稿共四十三页哦2022/10/1(b)b)梯度洗脱装置（梯度淋洗）梯度洗脱装置（梯度淋洗）所谓梯度洗脱就是流动相含有两种或两种以上不所谓梯度洗脱就是流动相含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续改改变流动相的配比和极性变流动相的配比和极性，以此来改变被分离组分，以此来改变被分离组分的的容量因子容量因子 k 和选择性因子和选择性因子，达到缩短分析时间，达到缩短分析时间和提高分离效果的目的。和提高分离效果的目的。第九页，讲稿共四十三页哦2
6、022/10/1第十页，讲稿共四十三页哦2022/10/1(2)2)进样系统进样系统通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：第十一页，讲稿共四十三页哦2022/10/1(3)3)分离系统分离系统 柱柱体体为为直直型型不不锈锈钢钢管管，内内径径26 mm，柱柱长长1030 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。第十二页，讲稿共四十三页哦2022/10/1 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化
7、学特性有，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，比如紫外、荧光等检测器。另一类是响应，比如紫外、荧光等检测器。另一类是总体型检总体型检测器测器，它对试样和流动相总的物理或化学性质有响应，它对试样和流动相总的物理或化学性质有响应，比如示差折光，电导检测器等。比如示差折光，电导检测器等。(4)4)检测系统检测系统第十三页，讲稿共四十三页哦2022/10/1应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。灵敏度高，10-6 g/L；流通池可做的很小（1mm 10mm，容积 8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；可用于梯度洗脱。a.紫外检测器紫外检测器 ultraviole
8、t photometric detector第十四页，讲稿共四十三页哦2022/10/1b.光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 photodiode array detector紫紫外外检检测测器器的的重重要要发发展展；由由1024个个二二极极管管组组成成，各各检检测测特特定定波波长长，计计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。第十五页，讲稿共四十三页哦2022/10/1光电二极管阵列检测器获得的色谱图光电二极管阵列检测器获得的色谱图第十六页，讲稿共四十三页哦2022/10/1c.荧光检测器荧光检测器 fluorescence detector高灵敏
9、度、高选择性；高灵敏度、高选择性；对对多多环环芳芳烃烃，维维生生素素B、黄黄曲曲霉霉素素、卟卟啉啉类类化化合合物物、农农药药、氨基酸类化合物等有响应。氨基酸类化合物等有响应。激光诱导荧光(LIF)Laser Induced Fluorescence体积小，适合毛细管柱第十七页，讲稿共四十三页哦2022/10/1d.示差折光检测器示差折光检测器 differential refractive index detector除除紫紫外外检检测测器器之之外外应应用用最最多多的的检检测测器器；通通用用型型检检测测器器（每每种种物物质质具具有有不不同同的的折折光光指指数数）；可可连连续续检检测测参参比比池
10、池和和样样品品池池中中流流动动相相的的折折光光指数差值，差值与浓度呈正比。指数差值，差值与浓度呈正比。灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式两种类型偏转式、反射式两种类型第十八页，讲稿共四十三页哦2022/10/1请选择内容请选择内容第一节第一节 高效液相色谱的特点与仪器高效液相色谱的特点与仪器feature and instrument of HPLC第二节第二节 主要的分离类型和原理主要的分离类型和原理main separating types and principle第三节第三节 影响分离的因素与操作条件选择影响分离的因素与操作条
11、件选择factors influenced separation and choice of operation condition第十九页，讲稿共四十三页哦2022/10/1第九章第九章高效液相色谱法高效液相色谱法一、液一、液-固吸附色谱固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatography二、液二、液-液分配色谱液分配色谱liquid-liquid partition chromatography三、离子对色谱三、离子对色谱Ion pair chromatography四、离子交换色谱四、离子交换色谱ion exchange chromatography五、
12、体积排阻色谱五、体积排阻色谱size-exclusion chromatography六、亲和色谱六、亲和色谱Affinity chromatography第二节第二节主要分离类型和原理主要分离类型和原理high performance liquid chromatography(HPLC)main separation types and principle第二十页，讲稿共四十三页哦2022/10/1一、一、液固吸附色谱液固吸附色谱liquid-solid absorption chromatography1分离原理分离原理利用吸附剂作为固定相，根据利用吸附剂作为固定相，根据吸附剂吸附剂对样
13、品中不同组对样品中不同组分产生分产生不同的吸附能力不同的吸附能力以及以及流动相流动相对吸附在固定相上对吸附在固定相上的样品组分具有的样品组分具有不同的洗脱能力不同的洗脱能力进行分离的方法。进行分离的方法。第二十一页，讲稿共四十三页哦2022/10/1当流动相流过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性当流动相流过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子（中心就要吸附流动相分子（Mad）。当待测组分（）。当待测组分（Xm）被流动相带入柱内，就要取代数目相当的已被吸附的被流动相带入柱内，就要取代数目相当的已被吸附的流动相分子，于是，在固定相表面发生交换（竞争）流动相分子，于是，在固定
14、相表面发生交换（竞争）吸附吸附:Xm n Mad Xad n Mm第二十二页，讲稿共四十三页哦2022/10/1其中其中Kad为吸附平衡常数，为吸附平衡常数，Kad值大表示组分在吸附剂值大表示组分在吸附剂上保留时间长，难于洗脱。上保留时间长，难于洗脱。Kad值小，则保留时间短，值小，则保留时间短，易于洗脱，试样中各组分据此得以分离。易于洗脱，试样中各组分据此得以分离。吸附达平衡时，有吸附达平衡时，有 第二十三页，讲稿共四十三页哦2022/10/12固定相固定相 极极性性：由由于于硅硅胶胶的的优优点点较较多多，如如线线性性容容量量高高，机机械械性性能能好好，不不溶溶胀胀，与与大大多多数数试试样样
15、不不发发生生化化学学反反应应等等，因因此，以硅胶用得最多。此，以硅胶用得最多。非极性：非极性：活性炭。活性炭。第二十四页，讲稿共四十三页哦2022/10/13.流动相流动相 一一般般把把吸吸附附色色谱谱中中流流动动相相称称作作洗洗脱脱剂剂。在在吸吸附附色色谱谱中中对对极极性性大大的的试试样样往往往往采采用用极极性性强强的的洗洗脱脱剂剂；对对极极性性弱弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗洗脱脱剂剂的的极极性性强强弱弱可可用用溶溶剂剂强强度度参参数数（0）来来衡衡量量。0 越大，表示洗脱剂的极性越强。越大，表示洗脱剂的极性越强。第二十五页，讲稿共四十三页哦2022/10/1二、
16、二、液液分配色谱液液分配色谱liquid-liquid partition chromatography固定相与流动相均为液体（互不相溶）。固定相与流动相均为液体（互不相溶）。1.基本原理：基本原理：利用组分在利用组分在互不相溶的互不相溶的两相间的分配系数两相间的分配系数K的不同，的不同，造成各组分的差速迁移而进行分离。造成各组分的差速迁移而进行分离。第二十六页，讲稿共四十三页哦2022/10/1涂渍固定相涂渍固定相：早期涂渍固定液，固定液易流失，现在：早期涂渍固定液，固定液易流失，现在较少采用；较少采用；化学键合固定相化学键合固定相：将不同基团通过化学反应键合到硅胶：将不同基团通过化学反应键
17、合到硅胶（载体）表面的游离硅羟基上。（载体）表面的游离硅羟基上。1.疏水基团：如烷烃疏水基团：如烷烃C8、C18和苯基等和苯基等2.亲水基团：如氨基、氰基等亲水基团：如氨基、氰基等2.固定相和流动相固定相和流动相第二十七页，讲稿共四十三页哦2022/10/1 流流动动相相：对对于于亲亲水水性性固固定定液液，通通常常采采用用疏疏水水性性流流动动相相，即即固固定定相相的的极极性性大大于于流流动动相相的的极极性性，称称为为正正相相色色谱谱；反反之之，固固定定相相的的极极性性小小于于流流动动相相的的极极性性的的称称为为反反相相色谱色谱。正正相相色色谱谱适适用用于于极极性性化化合合物物的的分分离离。其其
18、流流出出顺顺序序是是极极性性小小的先流出，极性大的后流出。的先流出，极性大的后流出。反反相相色色谱谱适适用用于于非非极极性性化化合合物物的的分分离离，其其流流出出顺顺序序与与正相色谱恰好相反。正相色谱恰好相反。第二十八页，讲稿共四十三页哦2022/10/1键合相色谱的优点：通过改变流动相的组成和种类，可有效地分离各种类型化合物（非极性、极性和离子型）。此外，由于键合到载体上的基团不易流失，特别适用于梯度淋洗。最大缺点：不能用于酸度、碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相的体系。总结：总结：第二十九页，讲稿共四十三页哦2022/10/1将一种或多种与溶质离子电荷相反的离子加入到流动相或固定相中，
19、使其与溶质离子结合形成疏水性的离子对化合物，从而控制溶质的保留行为的一种色谱分离方法。离子对色谱对一些生化试样，如核酸、核苷、儿茶酚胺类物质具有良好的分离效果。尤其是可以借助离子对的生成引入紫外吸收或荧光基团。三、三、离子对色谱离子对色谱 法法 ion pair chromatography第三十页，讲稿共四十三页哦2022/10/11分离原理分离原理固固定定相相为为非非极极性性键键合合相相，流流动动相相为为水水溶溶液液，于于流流动动相中加入与待测离子相中加入与待测离子X+相反电荷的离子相反电荷的离子Y-：第三十一页，讲稿共四十三页哦2022/10/1由于离子对由于离子对X+Y-具有疏水性，因
20、而被非极性固定相提具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待测离子取。其它待测离子X1，X2，X3.因与因与Y-离子间的成离子间的成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得各待测对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目的。物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目的。第三十二页，讲稿共四十三页哦2022/10/1烷基铵盐离子对试剂，用于阴离子的分离；烷基磺酸盐离子对试剂，用于阳离子的分离。固定相：正相键合固定相；反相键合固定相。流动相：一般含有适当有机反离子的溶剂。2固定相和流动相固定相和流动相第三十三页，讲稿共四十三页哦2022/10/1四、四、离
21、子交换色谱离子交换色谱ion-exchange chromatography固定相固定相：阴离子交换树脂或阳离子交换树脂；阴离子交换树脂或阳离子交换树脂；流动相流动相：盐类缓冲溶液（一定盐类缓冲溶液（一定pH和离子强度）。和离子强度）。1固定相和流动相固定相和流动相第三十四页，讲稿共四十三页哦2022/10/1基本原理：基本原理：组分在固定相上发生离子交换反应；组分组分在固定相上发生离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷多少等有关。亲和力大，保留时间长。多少等有关。亲和力大，保留时间长。阳离子交换反应：阳离子交换反应：R-SO
22、3-Na+M+R-SO3-M+Na+阴离子交换反应：阴离子交换反应：R-NR3+Cl-X-R-NR3+X-Cl-2分离原理分离原理第三十五页，讲稿共四十三页哦2022/10/1在在离离子子交交换换色色谱谱中中，常常通通过过改改变变流流动动相相的的pH、离离子子强强度度等等条条件件来来控控制制分分配配比比k，改改变变离离子子交交换换剂剂的的选选择择性性，进而影响待测物的分离。进而影响待测物的分离。第三十六页，讲稿共四十三页哦2022/10/1五、体积（尺寸）排阻色谱五、体积（尺寸）排阻色谱size-exclusion chromatography原原理理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙
23、，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快。第三十七页，讲稿共四十三页哦2022/10/1尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子物质相对分子量的分布。它具有其他液相色谱所没有的特点：（1）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息；（2）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长；（3）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于10才能得以分离。第三十八页，讲稿共四十三页哦2022/10/1凝胶（具有一定大小孔隙分布）；指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状
24、结构的多聚体。排阻色谱固定相种类很多，按照耐压的大小一般可分为软质、半硬质和硬质凝胶三类。1固定相第三十九页，讲稿共四十三页哦2022/10/1 排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品，而且与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。另外，溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果。2流动相第四十页，讲稿共四十三页哦2022/10/1六、六、亲和色谱法亲和色谱法 affinity chromatography原原理理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。第四十一页，讲稿共四十三页哦2022/10/1生物大分子中具有这种亲和力，例如酶与底物、抗原与生物大分子中具有这种亲和力，例如酶与底物、抗原与抗体、抗体、RNA与与DNA等。等。先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂（环氧、联胺等），再连接上配基（酶、抗原等），这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。第四十二页，讲稿共四十三页哦2022/10/1感感谢谢大大家家观观看看第四十三页，讲稿共四十三页哦