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1、关于高效液相色谱法 PPT第一页，讲稿共三十四页哦216-1 16-1 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点1.特点：高压、高效、高速、自动化特点：高压、高效、高速、自动化 与气相色谱比较：与气相色谱比较：n适合于分子量大、高沸点、热不稳定有机及生化试样，适合于分子量大、高沸点、热不稳定有机及生化试样，离子型化合物和高聚物的分离分析。离子型化合物和高聚物的分离分析。n液体流动相参与分离过程，选择性高。液体流动相参与分离过程，选择性高。n固定相类型多，分析选择余地大。固定相类型多，分析选择余地大。n较低的柱温，有利于色谱分离。较低的柱温，有利于色谱分离。n液体扩散性小，纵向扩散可忽略。液体扩
2、散性小，纵向扩散可忽略。n试样易于制备及回收。试样易于制备及回收。n仪器复杂昂贵。仪器复杂昂贵。第二页，讲稿共三十四页哦n液相色谱高柱效的原因液相色谱高柱效的原因:以特殊方法用小粒径的填料（以特殊方法用小粒径的填料（3 35um5um球形）制备色谱柱球形）制备色谱柱nH=He+Hd+Hm+Hs+Hsm =A+B/u+Cmu+Csu+Csmu 由于溶质分子在溶剂中的扩散系数很小，纵向扩散可由于溶质分子在溶剂中的扩散系数很小，纵向扩散可以忽略。以忽略。因此因此B B项可以略去。项可以略去。nH=A+（Cm+Cs+Csm）unA=2dA=2dp pn 2.液相色谱中速率理论液相色谱中速率理论0.01
3、 0.01 k k2 2(1+k(1+k)2 2 Cm=dp2 Dm 第三页，讲稿共三十四页哦416-2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪流程及主要部件流程及主要部件流程流程组成系统：高压输液系统、进样系统、分离系统、检测和记录系统组成系统：高压输液系统、进样系统、分离系统、检测和记录系统第四页，讲稿共三十四页哦516-2-1 高压输液系统高压输液系统（1）高压输液泵高压输液泵n主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：15015035010350105 5 PaPa。n为为了了获获得得高高柱柱效效而而使使用用粒粒度度很很小小的的固固定定相相（10)甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙
4、醇 丙酮丙酮 二二氧六环氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙异丙醚醚 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 二硫化碳二硫化碳 环己烷环己烷 己烷己烷 煤油煤油(最小最小)溶剂强度溶剂强度指溶剂将组分从色谱柱上洗脱下来的能力。溶剂强度与溶剂指溶剂将组分从色谱柱上洗脱下来的能力。溶剂强度与溶剂的极性有关。正向色谱中溶剂极性越大溶剂强度越大。反相色谱反之。的极性有关。正向色谱中溶剂极性越大溶剂强度越大。反相色谱反之。第十六页，讲稿共三十四页哦17（2 2）溶剂要与检测器匹配。）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意
5、选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。要长。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。溶剂作流动相，以达最高灵敏度。（3 3）高高纯纯度度。由由于于高高效效液液相相灵灵敏敏度度高高，对对流流动动相相溶溶剂剂的的纯纯度度也也要要求求高高。不不纯纯的的溶溶剂剂会会引引起起基基线线不不稳稳，或或产产生生“伪伪峰峰”。痕痕量量杂杂质质的的存存在在，将使截止波长值增加将使截止波长值增加50501OOnm1OOnm。（4 4）化学稳定性好）化学稳定性好。避免
6、与样品或固定相发生反应或聚合。避免与样品或固定相发生反应或聚合。（5 5）低粘度）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。影响分离。（6 6）试样在流动相中应有适宜的溶解度，试样在流动相中应有适宜的溶解度，若试样组分的分配若试样组分的分配比比K K值范围很广，则采用梯度洗脱。值范围很广，则采用梯度
7、洗脱。第十七页，讲稿共三十四页哦18一、液一、液-固吸附色谱固吸附色谱二、液二、液-液分配色谱液分配色谱三、化学键合相色谱三、化学键合相色谱四、离子交换色谱四、离子交换色谱五、排阻色谱五、排阻色谱六、亲和色谱六、亲和色谱(AC)AC)主要分离类型与原理主要分离类型与原理第十八页，讲稿共三十四页哦1916-3 16-3 液液-固吸附色谱固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatography 固固定定相相：固固体体吸吸附附剂剂为为，如如硅硅胶胶、氧氧化化铝铝等等，较较常常使使用用的的是是5 51010mm的硅胶吸附剂；的硅胶吸附剂；流动相流动相：各种不同极性的一元或
8、多元溶剂。：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适适用用于于分分离离相相对对分分子子质质量量中中等等的的油油溶溶性性试试样样，对对具具有有不不同官能团的化合物和异构体有较高选择性；同官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；第十九页，讲稿共三十四页哦2016-4 16-4 液液-液分配色谱液分配色谱liquid-liquid partition chromatography 固定相与流动相均为液体（互不相溶）；固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基
9、本原理基本原理：组分在固定相和流动相上的分配组分在固定相和流动相上的分配；流流动动相相：对对于于亲亲水水性性固固定定液液，采采用用疏疏水水性性流流动动相相，即即流流动动相相的的极极性性小小于于固固定定液液的的极极性性（正正相相 normal normal phasephase），流流动动相相的的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性（反反相相 reverse reverse phasephase）。正正相相与与反反相相的的出出峰峰顺序相反；顺序相反；固定相固定相：（1 1）全多孔型载体）全多孔型载体 （2 2）表面多孔型载体（薄壳型微珠担体）表面多孔型载体（薄壳型微珠担体）（3 3）固定液）
10、固定液 极性：极性：，-氧二丙腈，聚乙二醇氧二丙腈，聚乙二醇 非极性：十八烷（非极性：十八烷（ODSODS），角鲨烷），角鲨烷 第二十页，讲稿共三十四页哦2116-5 16-5 化学键合相色谱化学键合相色谱bonded-phase chromatography1 1键合固定相类型键合固定相类型 用用来来制制备备键键合合固固定定相相的的载载体体，几几乎乎都都用用硅硅胶胶。利利用用硅硅胶胶表表面面的的硅硅醇醇基基(Si(Si一一OH)OH)与与有有机机分分子子成成键键,即即可可得得到到各各种种性性能能的的固固定相。一般可分三类定相。一般可分三类（1 1）疏水基团疏水基团 如不同链长的烷烃（如不同链
11、长的烷烃（C C8 8和和C C1818）和苯基等）和苯基等（2 2）极性基团极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3 3）离离子子交交换换基基团团 如如作作为为阴阴离离子子交交换换基基团团的的胺胺基基，季季铵铵盐盐；作为阳离子交换作为阳离子交换 基团的磺酸等基团的磺酸等.第二十一页，讲稿共三十四页哦22C18硅胶填料结构第二十二页，讲稿共三十四页哦2316-5 16-5 化学键合相色谱化学键合相色谱bonded-phase chromatography 2.2.化学键合固定相化学键合固定相特点：特点：（1 1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；）传质
12、快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2 2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；（3 3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4 4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5 5）有利于梯度洗脱；）有利于梯度洗脱；适用于分离容量因子适用于分离容量因子k k值范围宽的样品。值范围宽的样品。n存在着双重分离机制：存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理键合基团的覆盖率决定分离机理)n高覆盖率：分配为主；高覆盖率：分配为主；n低覆盖率：吸附为主；低覆盖率
13、：吸附为主；第二十三页，讲稿共三十四页哦243反相健合相色谱法反相健合相色谱法 固定相：固定相：极性较小的键合固定相，如硅胶极性较小的键合固定相，如硅胶-C-C1818H H3737、硅胶、硅胶-苯基等；苯基等；流流动动相相：极极性性较较强强的的溶溶剂剂，如如甲甲醇醇、乙乙睛睛-水水、水水和和无无机机盐盐的的缓冲溶液等。缓冲溶液等。多多用用于于分分离离多多环环芳芳烃烃等等低低极极性性化化合合物物；具具有有柱柱效效高高，能能获获得得无拖尾色谱峰的优点。无拖尾色谱峰的优点。分分离离机机理理：疏疏溶溶剂剂作作用用。把把非非极极性性的的烷烷基基键键合合相相看看作作一一层层键键合合在在硅硅胶胶表表面面上
14、上的的十十八八烷烷基基的的“分分子子毛毛”，这这种种“分分子子毛毛”有有较较强强的的疏疏水水特特性性。当当用用极极性性流流动动相相来来分分离离含含有有极极性性官官能能团团的的有有机机化化合合物物时时，一一方方面面，分分子子中中的的非非极极性性部部分分与与固固定定相相表表面面上上的的疏疏水水烷烷基基产产生生缔缔合合作作用用，使使它它保保留留在在固固定定相相中中；而而另另一一方方面面，被被分分离离物物的的极极性性部部分分受受到到极极性性流流动动相相的的作作用用，促促使使它它离离开开固固定定相相，并并减减小小其其保保留留作作用用。两两种种作作用用力力之之差差，决决定定了了分分子子在在色谱中的保留行为
15、。色谱中的保留行为。第二十四页，讲稿共三十四页哦254.4.正相键合相色谱法正相键合相色谱法 固固定定相相:极极性性的的有有机机基基团团，CNCN、NHNH2 2双双羟羟基基等等（表表16-416-4）键键合合在在硅硅胶胶表表面面；流流动动相相:而而以以非非极极性性或或极极性性小小的的溶溶剂剂（如如烃烃类类）中中加加入入适适量量的的极极性性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等）为分离极性化合物。溶剂（如氯仿、醇、乙腈等）为分离极性化合物。主主要要用用于于分分离离异异构构体体、极极性性不不同同的的化化合合物物，特特别别适适用用于于分分离离不不同同类类型的化合物。型的化合物。5.5.离子性键合相色谱法离子性键
16、合相色谱法 固固定定相相:当当以以薄薄壳壳型型或或全全多多孔孔微微粒粒型型硅硅胶胶为为基基质质，化化学学键键合合各各种种离离子子交换基团，如一交换基团，如一SOSO3 3H H 一一CHCH2 2NHNH2 2、C00HC00H、一、一CHCH2 2N N（CHCH3 3）等；）等；流动相流动相:一般采用缓冲溶液。一般采用缓冲溶液。分离原理与离子交换色谱类同分离原理与离子交换色谱类同。第二十五页，讲稿共三十四页哦2616-6 16-6 离子交换色谱离子交换色谱ion-exchange chromatography 流流动动相相：阴阴离离子子交交换换树树脂脂作作固固定定相相，采采用用碱碱性性水水
17、溶溶液液；阳阳离离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；基基本本原原理理：组组分分在在固固定定相相上上发发生生的的反反复复离离子子交交换换反反应应；组组分分与与离离子子交交换换剂剂之之间间亲亲和和力力的的大大小小与与离离子子半半径径、电电荷荷、存存在在形形式等有关。亲和力大，保留时间长；式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：阳离子交换：R RSOSO3 3H+MH+M+=R =RSOSO3 3 M +H M +H+阴离子交换：阴离子交换：R RNRNR4 4OH+XOH+X-=R =RNRNR4 4 X+OHX+OH-应用应用：离子及可离解的化合物，氨基
18、酸、核酸等。：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。第二十六页，讲稿共三十四页哦27离子交换色谱离子交换色谱分离固定相分离固定相 结构类别：结构类别：（1 1）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂 薄薄壳壳玻玻璃璃珠珠为为担担体体，表表面面涂涂约约1%1%的离子交换树脂；的离子交换树脂；（2 2）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相 薄薄壳壳键键合合型型；微微粒粒硅硅胶胶键键合合型（键合离子交换基团）型（键合离子交换基团）树脂类别（表树脂类别（表16-616-6）：）：（1 1）阳阳离离子子交交换换树树脂脂（强强酸酸性性、弱酸性）弱酸性）（2 2）阴阴离离子子交交换换树树脂脂（强强碱碱性、
19、弱碱性）性、弱碱性）第二十七页，讲稿共三十四页哦2816-7 16-7 排阻色谱色谱排阻色谱色谱size-exclusion chromatography 固定相固定相：凝胶凝胶(具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布)；原原理理：按按分分子子大大小小分分离离。小小分分子子可可以以扩扩散散（渗渗透透）到到凝凝胶胶空空隙隙，由由其其中中通通过过，出出峰峰最最慢慢；中中等等分分子子只只能能通通过过部部分分凝凝胶胶空空隙隙，中中速速通通过过；而而大大分分子子被被排排斥斥在在外外，出出峰峰最最快快；溶溶剂剂分分子子小，故在最后出峰。小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；全部在死体积前出峰；可可对对相
20、相对对分分子子质质量量在在100-10100-105 5范范围围内的化合物按质量分离内的化合物按质量分离 第二十八页，讲稿共三十四页哦29 空间排阻分离固定相空间排阻分离固定相（1）软质凝胶）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶）半硬质凝胶 苯乙烯苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；多
21、孔硅胶、多孔玻珠等；化化学学稳稳定定性性、热热稳稳定定性性好好、机机械械强强度度大大，流流动动相相性性质质影影响响小小，可在较高流速下使用。可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。第二十九页，讲稿共三十四页哦3016-8 16-8 亲和色谱亲和色谱(AC)Affinity chromatograph原原理理：利利用用生生物物大大分分子子和和固固定定相相表表面面存存在在的的某某种种特特异异性性亲亲和和力力，进行选择性分离。进行选择性分离。先先在在载载体体表表面面键键合合上上一一种种具具有有一一般般反反应应性性能能的的所所谓谓间间
22、隔隔臂臂(环环氧氧、联联胺胺等等)，再再连连接接上上配配基基(酶酶、抗抗原原等等)，这这种种固固载载化化的的配配基基将将只只能能和和具具有有亲亲和和力力特特性性吸吸附附的的生生物物大大分分子子作作用用而而被被保保留。改变淋洗液后洗脱。留。改变淋洗液后洗脱。第三十页，讲稿共三十四页哦31分离类型分离类型分离类型分离类型分离原理分离原理分离原理分离原理固定相固定相固定相固定相流动相流动相流动相流动相应用对象应用对象应用对象应用对象液液液液-固吸附色谱固吸附色谱固吸附色谱固吸附色谱固定相上吸附解固定相上吸附解固定相上吸附解固定相上吸附解吸吸吸吸硅胶、氧化铝等硅胶、氧化铝等硅胶、氧化铝等硅胶、氧化铝等
23、固体吸附剂固体吸附剂固体吸附剂固体吸附剂不同极性的一不同极性的一不同极性的一不同极性的一元或多元元或多元元或多元元或多元溶剂。溶剂。溶剂。溶剂。不同官能团的化不同官能团的化不同官能团的化不同官能团的化合物和异构合物和异构合物和异构合物和异构体体体体液液液液-液分配色谱液分配色谱液分配色谱液分配色谱在固定相和流动在固定相和流动在固定相和流动在固定相和流动相上分配相上分配相上分配相上分配多孔型载体多孔型载体多孔型载体多孔型载体+极性极性极性极性或非极性固或非极性固或非极性固或非极性固定液定液定液定液与固定液极性与固定液极性与固定液极性与固定液极性相反相反相反相反分析各种不同性分析各种不同性分析各种
24、不同性分析各种不同性质的物质质的物质质的物质质的物质化学键化学键化学键化学键合相色合相色合相色合相色谱谱谱谱反相健合反相健合反相健合反相健合与固定相缔合、与固定相缔合、与固定相缔合、与固定相缔合、解缔作用解缔作用解缔作用解缔作用硅胶键合非极性硅胶键合非极性硅胶键合非极性硅胶键合非极性固定相固定相固定相固定相甲醇、乙睛甲醇、乙睛甲醇、乙睛甲醇、乙睛-水、水、水、水、缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液等等等等分离同系物、多分离同系物、多分离同系物、多分离同系物、多环芳烃等环芳烃等环芳烃等环芳烃等正相健合正相健合正相健合正相健合在固定相和流动在固定相和流动在固定相和流动在固定相和流动相上分配相上分配相
25、上分配相上分配硅胶键合极性固硅胶键合极性固硅胶键合极性固硅胶键合极性固定相定相定相定相非极性或极性非极性或极性非极性或极性非极性或极性小的溶剂小的溶剂小的溶剂小的溶剂分离异构体，极分离异构体，极分离异构体，极分离异构体，极性不同的化性不同的化性不同的化性不同的化合物合物合物合物离子健合离子健合离子健合离子健合反复离子交换反反复离子交换反反复离子交换反反复离子交换反应应应应硅胶键合离子交硅胶键合离子交硅胶键合离子交硅胶键合离子交换基团换基团换基团换基团缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液离子化合物或有离子化合物或有离子化合物或有离子化合物或有机酸碱机酸碱机酸碱机酸碱离子交换色谱离子交换色谱离子交换色
26、谱离子交换色谱反复离子交换反反复离子交换反反复离子交换反反复离子交换反应应应应载体表面涂覆离载体表面涂覆离载体表面涂覆离载体表面涂覆离子交换树脂子交换树脂子交换树脂子交换树脂酸或碱溶液酸或碱溶液酸或碱溶液酸或碱溶液离子化合物或有离子化合物或有离子化合物或有离子化合物或有机酸碱、生机酸碱、生机酸碱、生机酸碱、生物物质物物质物物质物物质排阻色谱色谱排阻色谱色谱排阻色谱色谱排阻色谱色谱按分子大小分离。按分子大小分离。按分子大小分离。按分子大小分离。凝胶凝胶凝胶凝胶(具有一定大具有一定大具有一定大具有一定大小孔隙分布小孔隙分布小孔隙分布小孔隙分布)缓冲液或有机缓冲液或有机缓冲液或有机缓冲液或有机溶剂溶
27、剂溶剂溶剂大分子物质、测大分子物质、测大分子物质、测大分子物质、测量相对分子量相对分子量相对分子量相对分子量量量量第三十一页，讲稿共三十四页哦3216-9 16-9 色谱分离方法的选择色谱分离方法的选择第三十二页，讲稿共三十四页哦33HPLC的的应用应用 application of HPLC 1.1.环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析 固定相固定相：薄壳型硅胶薄壳型硅胶(37(37 5050 m)m)流动相：正己烷流动相：正己烷 流流 速：速：1.5 1.5 mL/minmL/min 色谱柱：色谱柱：5050cmcm 2.5mm(2.5mm(内径内径)检测器：差示折光检测器检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。留量进行分析。第三十三页，讲稿共三十四页哦2022/9/27感感谢谢大大家家观观看看第三十四页，讲稿共三十四页哦