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1、Andrew Z.Fire Craig Cameron Mello 安德鲁法尔和克雷格梅洛1995年，康乃尔大学的Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫（C.elegans）中的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本是利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA（sense RNA）以期观察到基因表达的增强。但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反的。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。直到1998年2月，华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学医学院的Crai
2、g Mello才首次揭开这个悬疑之谜。通过大量艰苦的工作，他们证实，Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference,简称RNAi)。在随后的短短一年中，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早
3、期阶段。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。2000年，RNA的研究进展被美国科学杂志评为重大科技突破；2001年“RNA干扰”作为当年最重要的科学研究成果之一，再次入选“十大科技突破”；2002年12月20日，Science杂志将“Small RNA&RNAi”评为2002年度最耀眼的明星。同时，Nature杂志亦将Small RNA评为年度重大科技成功之一。2003年，小核糖核酸的研究第四次入选“十大科技突破”，排在第四位。RNA研究的突破性进展，是生物医学领域近20年来，可与HGP（人类基因组计划，生物
4、通网站注）相提并论的最重大成果之一。三、基因干预三、基因干预 Gene Interference基因干预的种类：基因干预的种类：1.1.反义反义RNA(antisense RNA)RNA(antisense RNA)2.2.干扰干扰RNA(RNA interference)RNA(RNA interference)3.3.核酶核酶 (ribozyme)反义RNA:与靶核酸（如mRNA或有义DNA）链互补的RNA分子，可抑制核酸的功能反义RNA，根据反义RNA的作用机制可将其分为3类：类反义RNA直接作用于靶mRNA的S D序列和(或)部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，
5、从而易被RNA酶 降解；类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象变化，抑制翻译；类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录。（一）反义（一）反义RNARNA 1.1.反义反义RNARNA与基因表达调控与基因表达调控 利用反义利用反义RNARNA对体外培养的细胞进行基因对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：表达调控，通常采用的方法有两种：（1 1）体外合成反义）体外合成反义RNARNA，直接作用于培养，直接作用于培养细胞，细胞吸收细胞，细胞吸收RNARNA后，发挥作用。后，发挥作用。（2 2）构建能转录反义）构建能转录反义RNARNA的重组质粒，将的重组质粒，将质粒转
6、入细胞，转录出反义质粒转入细胞，转录出反义RNARNA而发挥作用。而发挥作用。反义反义RNARNA的关键技术问题：的关键技术问题：反义反义RNARNA进入靶细胞前的降解问题进入靶细胞前的降解问题专一性转移问题：专一性转移问题：2.2.受体介导反义受体介导反义RNARNA技转移术技转移术 受体介导的受体介导的RNARNA转移十分专一，而且效率高；转移十分专一，而且效率高；被转移的被转移的RNARNA是被保护的，与周围环境之间存是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层在多聚赖氨酸的保护层,可以抵抗环境中的核可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。酸酶的降解作用。将将脱脱唾唾液液酸酸血血清清类类粘
7、粘蛋蛋白白（ASGPASGP）与与多多聚聚赖赖氨氨酸酸（PLPL）共共价价连连接接，得得到到ASGP-PLASGP-PL复复合合物物，成成为为运运载载核核酸酸的的工工具具。ASGP-PLASGP-PL反反义义RNARNA复复合合物物可可以以专专一一性性地地被被肝肝细细胞胞表表面面的的ASGPASGP受受体体所所识识别别，并并吞吞噬噬到到肝肝细细胞胞中中，反反义义RNARNA进进入入肝肝细胞后，可被逐渐释放出来发挥作用。细胞后，可被逐渐释放出来发挥作用。借借助助受受体体介介导导DNADNA转转移移方方法法把把DNADNA换换成成反反义义RNARNA，就就可以实现受体介导的反义可以实现受体介导的反
8、义RNARNA的转移。的转移。3.3.反义反义RNARNA的应用前景的应用前景 受体介导的反义受体介导的反义RNARNA基因治疗有其自身的优点，而在基因治疗有其自身的优点，而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。一定程度上补充了转基因治疗的不足。（l l）安全性高）安全性高 （2 2）反义）反义RNARNA设计和制备方便设计和制备方便 （3 3）具有剂量调节效应）具有剂量调节效应 （4 4）能直接作用于一些）能直接作用于一些RNARNA病毒病毒 反反义义RNARNA只只作作用用于于特特异异的的mRNAmRNA分分子子，不不改改变变所所调调节节基基因因的的结结构构。反反义义RNARNA分分子子无无
9、论论怎怎样样修修饰饰，最最终终将将在在细细胞胞内内部部被被降降解解，不不留留“残渣残渣”。在在治治疗疗RNARNA病病毒毒感感染染性性疾疾病病时时，受受体体介介导导的的反反义义RNARNA基基因因治治疗疗比比一一般般的的DNADNA基基因因治治疗疗有有更更大大的的优优势势。利利用用反反义义RNARNA可以直接作用于病毒可以直接作用于病毒RNARNA，阻断，阻断RNARNA病毒的繁殖。病毒的繁殖。（二）干扰（二）干扰RNARNA 实验结果显示，有义链实验结果显示，有义链RNARNA（sense RNAsense RNA）或反义链）或反义链RNARNA（antisense RNAantisense
10、 RNA）均能抑制线虫基因的表达，双链）均能抑制线虫基因的表达，双链RNARNA比单链比单链RNARNA更为有效。将特异的双链更为有效。将特异的双链RNARNA注入线虫体内注入线虫体内可抑制有同源序列的基因的表达。得到的结果是有义链可抑制有同源序列的基因的表达。得到的结果是有义链RNARNA和反义链和反义链RNARNA都同样阻断基因表达途径。这与传统上都同样阻断基因表达途径。这与传统上对反义对反义RNARNA技术的解释正好相反。而且其抑制基因表达的技术的解释正好相反。而且其抑制基因表达的效率比反义效率比反义RNARNA至少高至少高2 2个数量级。个数量级。1.RNA1.RNA干扰现象干扰现象
11、RNA RNA干扰干扰（RNA interferenceRNA interference，RNAi RNAi）是一种由双链是一种由双链RNARNA诱诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNARNA有同源序列的有同源序列的信使信使RNARNA（mRNAmRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。）被降解，从而抑制该基因的表达。对对RNARNA干扰的认识来源于用线虫（干扰的认识来源于用线虫（C.elegansC.elegans）和果）和果蝇所进行的实验。蝇所进行的实验。http:/2.RNA2.RNA干扰的机制干扰的机制 RNARNA干扰过程主要有干扰过程主要有2
12、 2个步骤：个步骤：（1 1）小干扰性）小干扰性RNARNA（siRNAsiRNA）（2 2）siRNAsiRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为体，称为RNARNA诱导的沉默复合体（诱导的沉默复合体（RNA-induced RNA-induced silencing complex,RISC)silencing complex,RISC)。该复合体可识别与该复合体可识别与siRNAsiRNA有同源序列的有同源序列的mRNAmRNA，并在特异的位点将该，并在特异的位点将该mRNAmRNA切断。切断。长双链长双链RNARNA被细胞内的双链被细胞内的双链RN
13、ARNA特异性核特异性核酸酶酸酶DicerDicer切成切成21-2321-23个碱基对的短双链个碱基对的短双链RNARNA，称为小干扰性，称为小干扰性RNARNA（small small interfering RNAinterfering RNA，siRNAsiRNA）。）。A.贾第鞭毛虫Dicer的晶体结构；RNA干扰机制示意图 1.1.体外化学合成体外化学合成;2.2.用用质质粒粒载载体体或或病病毒毒载载体体可可在在细细胞胞内稳定地生成。内稳定地生成。siRNAsiRNA的产生的产生3.RNA3.RNA干扰的应用前景干扰的应用前景 RNA RNA干扰研究目前已经在功能基因组学干扰研究目
14、前已经在功能基因组学研究、微生物学研究、基因治疗和信号转导研究、微生物学研究、基因治疗和信号转导等广泛领域取得了令人瞩目的进展，使其在等广泛领域取得了令人瞩目的进展，使其在医学、生物学领域的应用有着广阔的前景。医学、生物学领域的应用有着广阔的前景。（1 1）研究基因功能的新工具研究基因功能的新工具 由于由于 RNA RNA干扰技术具有高度的序列专一性干扰技术具有高度的序列专一性和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强有力丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。的研究工具。RNARNA干扰技术能够在哺
15、乳动物中抑制特定干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，建立多种表型；抑制基因表达的时基因的表达，建立多种表型；抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段，间可以控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲产生类似基因敲除的效应除的效应。（2 2）肿瘤的基因治疗肿瘤的基因治疗 传传统统反反义义RNARNA技技术术诱诱发发的的单单一一癌癌基基因因的的阻阻断断，不不可可能能完完全全抑抑制制或或逆逆转转肿肿瘤瘤的的生生长长，而而RNARNA干干扰扰技技术术可可以以利利用用同同一一基基因因家家族族的的多多个个基基因因具具有有一一段段同同源源性性很很高高的的保保守守序序列列这这一一特特性性，设设计计针针对对
16、这这一一区区段段序序列列的的双双链链RNARNA分分子子，只只使使用用一一种种双双链链RNARNA即即可可以以产产生生多多个个基基因因同同时时剔剔除除的的表表型型，也也可可以以同同时时使使用用多多种种双双链链RNARNA而而将将多多个个序序列列不不相相关关的的基基因因同同时时剔剔除除。RNARNA干干扰扰技技术术可可用用于于治治疗疗有有异异常常基基因因表表达达的的恶恶性肿瘤。性肿瘤。K-RASK-RAS蛋蛋白白为为肿肿瘤瘤发发生生所所必必需需，bcr/ab1bcr/ab1融融合合基基因因与与人人白白血血病病有有关关，用用RNARNA干干扰扰技技术术可可以以阻阻碍碍K-RASK-RAS蛋蛋白白的
17、的表表达达从从而抑制肿瘤发生，或杀死有而抑制肿瘤发生，或杀死有bcr/ab1bcr/ab1的人白血病细胞系。的人白血病细胞系。通通过过RNARNA干干扰扰抑抑制制某某些些内内源源性性基基因因的的表表达达，能能促促进进白白血病细胞系的细胞凋亡或增加其对化疗药物的反应性。血病细胞系的细胞凋亡或增加其对化疗药物的反应性。应应用用RNARNA干干扰扰技技术术成成功功地地阻阻断断了了MCF-7MCF-7乳乳腺腺癌癌细细胞胞中中一一种种异异常常表表达达的的与与细细胞胞增增殖殖分分化化相相关关的的核核转转录录因因子子基基因因Sp1Sp1的功能。的功能。“沉默”真的是金 （3 3）病毒性疾病的基因治疗病毒性疾
18、病的基因治疗 RNARNA干干扰扰可可以以被被看看成成是是一一种种与与免免疫疫系系统统类类似似的的防防御御机机制制。用用siRNAsiRNA抑抑制制人人类类免免疫疫缺缺陷陷病病毒毒（HIVHIV）某某些些基基因因的的表表达达，如如P24P24、VifVif、nefnef、tattat或或revrev，阻阻碍碍HIVHIV在在细细胞胞内内复复制制。用用RNARNA干干扰扰技技术术抑抑制制HIVHIV的的受受体体（CD4CD4）或或辅辅助助受受体体（CXCR4CXCR4或或CCR5CCR5）在在细细胞胞内内表表达达，可可阻阻碍碍HIVHIV感感染染细细胞胞。也也可可通通过过RNARNA干干扰扰抑抑
19、制制其其他他病病毒毒在在细细胞胞内内复复制制，如如脊脊髓髓灰灰质质炎炎病病毒毒、人人乳乳头头状状瘤瘤病病毒毒、乙乙型型肝肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。炎病毒和丙型肝炎病毒等。“沉默”真的是金 siRNAsiRNA在病毒感染的在病毒感染的早期阶段早期阶段能有效地抑制病毒的复制能有效地抑制病毒的复制，病毒感，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基染能被针对病毒基因和相关宿主基因的因的siRNAsiRNA所阻断，所阻断，RNARNA干扰技术将干扰技术将成为一种有效的抗病毒治疗手段。成为一种有效的抗病毒治疗手段。这对于许多严重的病毒性疾病的防这对于许多严重的病毒性疾病的防治具有十分重大的意义。治具有十分重大
20、的意义。siRNA的输送（siRNA delivery)siRNA的输送（siRNA delivery)T.Cech S.Altman 1989年，核酶的发现者T.Cech和S.Altman被授予 诺贝尔化学奖。（三）核酶三）核酶(ribozyme)核酶（ribozyme）是具有催化功能的RNA分子（三）核酶（三）核酶(ribozyme)天然核酶多为单一的天然核酶多为单一的RNARNA分子，具有自我剪切作分子，具有自我剪切作 用。但核酶也可以由两个用。但核酶也可以由两个RNARNA分子组成。分子组成。在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNARNA分子中分子中适
21、当的邻位，形成锤头核酶结构，将靶适当的邻位，形成锤头核酶结构，将靶RNARNA分子切断，分子切断，通过破坏靶通过破坏靶RNARNA分子达到治疗疾病（如清除病毒基因组分子达到治疗疾病（如清除病毒基因组RNARNA）的目的。）的目的。只要两个只要两个RNARNA分子通过互补序列相结合，形成锤头分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级结构（状的二级结构（3 3个螺旋区），并能组成核酶的核心序个螺旋区），并能组成核酶的核心序列（列（1313个或个或1111个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应。产生剪切反应。1.核酶的设计核酶的设计 核核酶酶是是通通过过靶
22、靶RNARNA分分子子与与核核酶酶分分子子共共同同组组成成酶酶活活性性结结构构域域，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶。要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶。（1 1）选选择择合合适适的的靶靶部部位位，该该部部位位具具有有核核酶酶切切割割位位点点，能能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。与核酶分子结合并组成酶活性结构域。（2 2）核核酶酶的的基基本本组组成成：用用于于基基因因治治疗疗的的核核酶酶分分子子由由三三个个部部分分组组成成，中中间间是是保保守守序序列列（能能够够组组成成酶酶活活性性结结构构域），两端是引导序列。域），两端是引导序列。在基因治疗中，主要是根据治疗的靶基因序列的在基因治
23、疗中，主要是根据治疗的靶基因序列的特点，设计和合成特定的核酶。设计的基本原则是特点，设计和合成特定的核酶。设计的基本原则是核酶分子与靶部位结合后能形成酶活性结构域。核酶分子与靶部位结合后能形成酶活性结构域。核酶的作用机制 2.2.核酶的应用核酶的应用 与一般的反义与一般的反义RNARNA相比，核酶具有较稳相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到定的空间结构，不易受到RNARNA酶的攻击。更酶的攻击。更重要的是，核酶在切断重要的是，核酶在切断mRNAmRNA后，又可从杂后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNAmRNA分子。分子。四、治疗基因的受
24、控表达四、治疗基因的受控表达 Regulated Expression of Therapeutic Gene 时间时间:要要实实现现治治疗疗基基因因的的受受控控表表达达，必必须须建建立立完完善善的的基基因因表表达达调调控控体体系系。基基因因调调控控策策略略大大致致有有以以下下几几种种：基基因因内内部部调调节节机机制制、基基因因外外部部调调节节机机制制、利利用用病病灶灶微微环环境境使使治治疗疗基基因因特特异性表达以及治疗基因的诱导表达等。异性表达以及治疗基因的诱导表达等。治治疗疗基基因因的的受受控控表表达达包包括括控控制制治治疗疗基基因因表表达达的的时时间间、空间和水平空间和水平三个方面。三个
25、方面。空间空间:表达水平：表达水平：希望治疗基因能在一个适当的水平表达。希望治疗基因能在一个适当的水平表达。1.1.控控制制治治疗疗的的基基因因在在患患者者需需要要实实施施治治疗疗时时才才表表达，而平时不需要进行治疗时则处于关闭状态；达，而平时不需要进行治疗时则处于关闭状态；2.2.根根据据不不同同疾疾病病的的治治疗疗要要求求，控控制制治治疗疗基基因因持持续表达的时间跨度。续表达的时间跨度。是是指指为为了了提提高高基基因因治治疗疗的的专专一一性性和和安安全全性性，严严格格限限制制治治疗疗基基因因只只在在靶靶细细胞胞中中表表达达，避避免免治治疗疗基基因因指指导导合合成成的的蛋蛋白白质质干干扰扰非
26、非靶靶细细胞胞的的正正常常生生活活，产产生毒副作用。生毒副作用。（一）基因内部的调节机制（一）基因内部的调节机制使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件 1.1.使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件 例例如如，酪酪氨氨酸酸酶酶是是皮皮肤肤细细胞胞和和黑黑色色素素瘤瘤细细胞胞产产生生色色素素途途径径中中的的一一种种酶酶，可可利利用用其其启启动动子子驱驱动动治治疗疗基基因因只只在在黑黑色色素素瘤细胞中表达，而不在正常的周边细
27、胞中表达。瘤细胞中表达，而不在正常的周边细胞中表达。不不同同类类型型的的正正常常细细胞胞或或组组织织中中往往往往存存在在某某些些特特有有的的蛋蛋白白质质，它它们们的的基基因因表表达达调调控控元元件件可可用用于于驱驱动动治治疗疗基基因因的特异性表达，从而起到治疗作用。的特异性表达，从而起到治疗作用。前前列列腺腺特特异异性性抗抗原原(PSA)(PSA)是是参参与与精精液液凝凝块块中中蛋蛋白白质质降降解解、使使精精液液液液化化的的一一种种丝丝氨氨酸酸蛋蛋白白酶酶。它它主主要要在在前前列列腺腺中中产产生生，而而在在前前列列腺腺癌癌细细胞胞中中含含量量很很高高，可可以以利利用用PSAPSA基基因因调调控
28、控元元件件驱驱动动治治疗疗基基因因在在PSAPSA阳阳性性的的前前列列腺腺癌癌细细胞胞中中表表达达而而发发挥挥作作用用，而而其其在在PSAPSA阴阴性性细细胞胞和和非非前前列列腺腺癌细胞中不能使治疗基因表达。癌细胞中不能使治疗基因表达。2.2.使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件 某某些些病病变变的的细细胞胞或或组组织织产产生生一一些些特特殊殊的的蛋蛋白白质质，其其基基因表达调节元件也可以用来控制治疗基因的特异性表达。因表达调节元件也可以用来控制治疗基因的特异性表达。甲甲胎胎蛋蛋白白(AFP)(AFP)基基因因正正常常情情况况下下只只在在胚胚胎胎
29、肝肝细细胞胞中中表表达达，不不在在成成年年肝肝脏脏细细胞胞中中表表达达。肝肝细细胞胞腺腺癌癌细细胞胞中中AFPAFP基基因因异异常常激激活活，因因此此可可利利用用该该基基因因启启动动子子驱驱动动治治疗疗基基因因(如如自自杀杀基基因因)在癌细胞中表达，使癌细胞经给药后被杀死。在癌细胞中表达，使癌细胞经给药后被杀死。癌癌胚胚抗抗原原(CEA)(CEA)是是膜膜糖糖蛋蛋白白家家族族的的成成员员，在在许许多多腺腺癌癌细细胞胞中中表表达达很很高高，采采用用其其启启动动子子可可以以使使治治疗疗基基因因只只在在CEACEA阳阳性性的癌细胞中表达，而不会在阴性细胞中表达。的癌细胞中表达，而不会在阴性细胞中表达
30、。（二）基因外部的调节机制（二）基因外部的调节机制 除利用基因内部的调节机制以外，还可通过施加外部刺除利用基因内部的调节机制以外，还可通过施加外部刺激，促进治疗基因在特定细胞或组织中表达。激，促进治疗基因在特定细胞或组织中表达。采用热休克蛋白基因的表达调控元件来启动治疗基因，采用热休克蛋白基因的表达调控元件来启动治疗基因，可以通过对病灶局部进行热处理，达到使治疗基因特异性可以通过对病灶局部进行热处理，达到使治疗基因特异性表达的目的。表达的目的。Egr-1 Egr-1基因是一种编码锌指转录因子的早期基因，包括基因是一种编码锌指转录因子的早期基因，包括电离辐射和细胞因子等在内的多种外部刺激都可以诱
31、导其表电离辐射和细胞因子等在内的多种外部刺激都可以诱导其表达，将其调控序列启动的治疗基因达，将其调控序列启动的治疗基因(如肿瘤坏死因子基因如肿瘤坏死因子基因)导导入肿瘤组织，可在电离辐射等作用下，使治疗基因获得暂时入肿瘤组织，可在电离辐射等作用下，使治疗基因获得暂时性的局部表达，杀死肿瘤细胞。性的局部表达，杀死肿瘤细胞。组织纤溶酶原激活物组织纤溶酶原激活物(t-PA)(t-PA)作为溶解血栓的药剂，在中作为溶解血栓的药剂，在中风和心肌梗死等疾病治疗中起着重要的作用。风和心肌梗死等疾病治疗中起着重要的作用。t-PAt-PA的活性在的活性在辐射后增加辐射后增加5050倍，表明其基因表达调控元件中存
32、在受辐射诱倍，表明其基因表达调控元件中存在受辐射诱导的调控元件，故可利用其调控元件启动治疗基因的表达，导的调控元件，故可利用其调控元件启动治疗基因的表达，增强放疗效果。增强放疗效果。（三）利用病灶微环境使治疗基因特异性表达（三）利用病灶微环境使治疗基因特异性表达 病灶微环境与正常时往往不同，因此可利用这病灶微环境与正常时往往不同，因此可利用这些变化控制治疗基因的表达。些变化控制治疗基因的表达。例如，例如，在肿瘤病灶处在肿瘤病灶处，常常出现葡萄糖缺乏等情，常常出现葡萄糖缺乏等情况，葡萄糖调节蛋白况，葡萄糖调节蛋白GRP78/BipGRP78/Bip的含量也随之增加，的含量也随之增加，使癌细胞能够
33、抵御应激。当采用这种基因的启动子使癌细胞能够抵御应激。当采用这种基因的启动子来控制治疗基因时，可以使治疗基因在肿瘤细胞中来控制治疗基因时，可以使治疗基因在肿瘤细胞中表达，使肿瘤组织坏死。表达，使肿瘤组织坏死。肿瘤细胞生长速度快于形成血管的内皮细胞，造成供血肿瘤细胞生长速度快于形成血管的内皮细胞，造成供血不足，因此在肿瘤内部形成酸性、缺氧和营养缺乏的区域。不足，因此在肿瘤内部形成酸性、缺氧和营养缺乏的区域。缺氧条件可以通过缺氧诱导因子缺氧条件可以通过缺氧诱导因子(HIF-1)(HIF-1)和缺氧响应元件和缺氧响应元件(HRE)(HRE)相互作用，调节一些基因的表达；如果采用缺氧响应元相互作用，调
34、节一些基因的表达；如果采用缺氧响应元件件(HRE)(HRE)来控制治疗基因的表达，即可实现治疗基因只在缺氧来控制治疗基因的表达，即可实现治疗基因只在缺氧的肿瘤组织中表达，而在正常组织中不表达。的肿瘤组织中表达，而在正常组织中不表达。机体发炎时机体发炎时所可产生的许多急性期蛋白，其基所可产生的许多急性期蛋白，其基因的启动子可以控制发炎条件下治疗基因的表达；因的启动子可以控制发炎条件下治疗基因的表达；而一旦炎症消失，治疗基因的表达也随之终止。而一旦炎症消失，治疗基因的表达也随之终止。（四）治疗基因的诱导表达（四）治疗基因的诱导表达 采用组织特异性启动子控制治疗基因的表达，采用组织特异性启动子控制治
35、疗基因的表达，可能造成这些基因在靶细胞中表达，不再受外界可能造成这些基因在靶细胞中表达，不再受外界控制。为了避免这种情况发生，研究人员正在开控制。为了避免这种情况发生，研究人员正在开发和完善一些发和完善一些可诱导性基因表达系统可诱导性基因表达系统。这种系统的必要成分：一种是转录激活剂，这种系统的必要成分：一种是转录激活剂，它只在诱导药物存在时才能与它只在诱导药物存在时才能与DNADNA结合；另一种结合；另一种则是特异性基因表达调控元件，仅对这种转录激则是特异性基因表达调控元件，仅对这种转录激活剂有所响应。活剂有所响应。四环素抗性操纵子系统四环素抗性操纵子系统原理原理四环素抗性基因的转录受四环素
36、抗性基因的转录受TetTet阻遏蛋白的负调控。阻遏蛋白的负调控。无四环素存在时，阻遏蛋白与四环素抗性操纵子序列结无四环素存在时，阻遏蛋白与四环素抗性操纵子序列结合阻断四环素抗性基因的表达；合阻断四环素抗性基因的表达；四环素存在时，阻遏蛋白与四环素具有极高的亲和性，四环素存在时，阻遏蛋白与四环素具有极高的亲和性，造成阻遏蛋白对四环素抗性操纵子阻遏解除，使四环素造成阻遏蛋白对四环素抗性操纵子阻遏解除，使四环素抗性基因的转录得以进行。抗性基因的转录得以进行。五、基因治疗的应用研究五、基因治疗的应用研究The Application of Gene Therapy 世世界界上上第第一一个个正正式式被被
37、批批准准用用于于基基因因治治疗疗的的病病例例是是先先天天性性腺腺苷苷脱脱氨氨酶酶（ADAADA）缺缺乏乏症症。19901990年年9 9月月美美国国BlaeseBlaese博博士士成成功功地地将将正正常常的的人人的的ADAADA基基因因植植入入ADAADA缺缺乏乏症症病病人人的的淋淋巴巴结结内内，完完成成世世界界上上首首例例基基因因治疗试验。治疗试验。（一）遗传病的基因治疗研究（一）遗传病的基因治疗研究 已已知知人人类类有有40004000多多种种遗遗传传病病，在在人人群群中中的的发发病病率率约约为为40405050。但但真真正正了了解解病病因因，能能进进行行产产前前诊诊断断的仅限于那些为数不
38、多的常见遗传病。的仅限于那些为数不多的常见遗传病。1.1.在在DNADNA水平明确其发病原因及机制；水平明确其发病原因及机制；2.2.必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；3.3.该基因的表达不需要精确调控；该基因的表达不需要精确调控；4.4.该该基基因因能能在在一一种种便便于于临临床床操操作作的的组组织织细细胞胞(如如皮皮肤肤细细胞胞，骨髓细胞等骨髓细胞等)中表达并发挥其生理作用；中表达并发挥其生理作用；5.5.该该遗遗传传病病不不经经治治疗疗将将有有严严重重后后果果(如如不不治治疗疗难难以以存存活活等等)。可可供供选选择择并并符符合合上上述述4 4条条以以
39、上上要要求求的的不不过过只只有有3030余余种种遗遗传传病。病。遗传病基因治疗必须符合以下要求：遗传病基因治疗必须符合以下要求：1 1腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶(ADA)(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)(PNP)缺乏症缺乏症 2 2珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病 3 3血友病和其他血浆蛋白缺乏症血友病和其他血浆蛋白缺乏症 4 4苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病 5 5莱莱-纳纳(Lesch-Nyhan)(Lesch-Nyhan)综合征综合征 6 6家族性高胆固醇血症家族性高胆固醇血症 7 7囊性纤维化病囊
40、性纤维化病 （二）恶性肿瘤基因治疗研究（二）恶性肿瘤基因治疗研究 （1 1）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑制癌症的发生、发展和转移；制癌症的发生、发展和转移；肿瘤发生是一个极为复杂的过程，许多基因的突变肿瘤发生是一个极为复杂的过程，许多基因的突变会导致肿瘤的发生。会导致肿瘤的发生。（2 2）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，发挥抑癌作用；发挥抑癌作用；（3 3）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细胞因子修饰，刺激免疫系统产
41、生对肿瘤细胞的溶解和胞因子修饰，刺激免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应；排斥反应；（4 4）通过导入）通过导入“自杀基因自杀基因”杀伤癌细胞。杀伤癌细胞。1.1.肿瘤基因治疗的基本策略肿瘤基因治疗的基本策略 从从实实际际应应用用于于临临床床治治疗疗的的角角度度来来看看，肿肿瘤瘤基基因治疗的策略包括：因治疗的策略包括：(1)(1)直接杀伤肿瘤细胞或抑制其生长。直接杀伤肿瘤细胞或抑制其生长。(2)(2)增增强强机机体体免免疫疫系系统统，间间接接杀杀伤伤或或抑抑制制肿肿瘤细胞。瘤细胞。(3)(3)改善肿瘤常规治疗方法，提高疗效。改善肿瘤常规治疗方法，提高疗效。2.2.肿瘤基因治疗的常用方法肿瘤基
42、因治疗的常用方法 基基因因干干预预技技术术：通通过过基基因因干干预预，使使得得肿肿瘤瘤细细胞胞过过度表达的癌基因得到抑制，从而降低其恶性表型。度表达的癌基因得到抑制，从而降低其恶性表型。自杀基因治疗自杀基因治疗分子化疗：直接杀死分子化疗：直接杀死肿瘤细胞肿瘤细胞。肿瘤的免疫基因治疗：以激发机体肿瘤免疫效应肿瘤的免疫基因治疗：以激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能。或提高免疫效应细胞功能。提高化疗效果的辅助基因治疗：提高化疗效果的辅助基因治疗：药物增敏基因治疗；药物增敏基因治疗；耐药基因治疗。耐药基因治疗。3.3.自杀基因治疗：自杀基因治疗是目前自杀基因治疗：自杀基因治疗是目前肿瘤基因治疗
43、领域中的研究热点之一。肿瘤基因治疗领域中的研究热点之一。基本原理：基本原理：向肿瘤细胞内导入某些真核细胞中不存在向肿瘤细胞内导入某些真核细胞中不存在的酶基因（自杀基因），这些基因表达的特异性酶可的酶基因（自杀基因），这些基因表达的特异性酶可以催化对真核细胞无毒或低毒的药物前体，转变为具以催化对真核细胞无毒或低毒的药物前体，转变为具有抑制核酸合成效应的抗代谢药物，进而选择性地将有抑制核酸合成效应的抗代谢药物，进而选择性地将转染了该基因的肿瘤细胞转染了该基因的肿瘤细胞“自杀自杀”。这些基因也相应。这些基因也相应地被称为地被称为“自杀基因自杀基因”。自杀基因治疗的前提条件是自杀基因治疗的前提条件是“
44、自杀基因自杀基因”的的表达必须局限于肿瘤细胞中，而不伤及正常细胞。表达必须局限于肿瘤细胞中，而不伤及正常细胞。利用免疫脂质体、受体介导等技术利用免疫脂质体、受体介导等技术进行定向基因转移。进行定向基因转移。利用病毒载体进行基因转移。利用病毒载体进行基因转移。肿瘤特异性基因转录。肿瘤特异性基因转录。肿瘤内直接注射。肿瘤内直接注射。自自杀杀基基因因转转移移常常用用方方法法 4.4.肿瘤的免疫基因治疗肿瘤的免疫基因治疗 激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能为目的的一种肿瘤基因治效应细胞功能为目的的一种肿瘤基因治疗方法。主要包括细胞因子（或受体）疗方法。主要包括细胞
45、因子（或受体）基因治疗和抗原抗体基因治疗两大类。基因治疗和抗原抗体基因治疗两大类。5.5.提高化疗效果的辅助基因治疗：提高化疗效果的辅助基因治疗：临临床床上上对对肿肿瘤瘤患患者者进进行行化化疗疗时时，通通常常面面临临两两大难题：大难题：（1 1）是是患患者者机机体体内内的的肿肿瘤瘤细细胞胞对对化化疗疗药药物物的的敏敏感感程程度度存存在在差差异异，特特别别是是某某些些经经过过多多次次化化疗疗的的患患者者，其其体体内内的的肿肿瘤瘤细细胞胞已已经经产产生生了了多多药药耐耐药药性性，对对多多种化疗药物产生交差耐受，最终导致化疗失败。种化疗药物产生交差耐受，最终导致化疗失败。（2 2）是是大大剂剂量量的
46、的化化疗疗可可能能导导致致患患者者的的正正常常细细胞胞，特别是骨髓造血细胞的功能受到抑制。特别是骨髓造血细胞的功能受到抑制。(1)(1)药物增敏基因治疗：药物增敏基因治疗：将将鸡鸡钙钙调调素素（calmodulin,calmodulin,CaMCaM）基基因因导导入入小小鼠鼠乳乳腺腺癌癌细细胞胞株株C127C127，结结果果仅仅需需低低剂剂量量的的长长春春新新碱碱或或长长春春花花碱碱即即可可明明显显抑抑制制该该细细胞胞株株的的生生长长。对对其其作作用用原原理理进进行行研研究究后后发发现现，CaMCaM基基因因的的表表达达产产物物作作为为细细胞胞内内信信号号传传导导系系统统的的重重要要物物质质，
47、明明显显增增加加了了肿肿瘤瘤细细胞胞对对长长春春新新碱碱或或长长春春花花碱碱的的吸吸收收量量而而相相应应减减少少了了排排出出量量，从从而而提提高高了肿瘤细胞内化疗药物浓度，导致肿瘤细胞死亡。了肿瘤细胞内化疗药物浓度，导致肿瘤细胞死亡。为为了了使使化化疗疗药药物物能能够够最最大大程程度度地地杀杀死死肿肿瘤瘤细细胞胞，可可以以考考虑虑将将某某些些药药物物增增敏敏基基因因导导入入肿肿瘤瘤细细胞胞，特特别别是是对对化化疗疗药药物物原原本本不不敏敏感感的的肿肿瘤瘤细细胞胞，使使其其对对抗抗肿肿瘤瘤药药物物的的敏敏感性大大增加，从而达到增强化疗效果的目的。感性大大增加，从而达到增强化疗效果的目的。(2)(
48、2)耐药基因治疗：耐药基因治疗：在在解解决决化化疗疗所所致致骨骨髓髓细细胞胞造造血血功功能能受受到到严严重重抑抑制制的的问问题题方方面面，通通过过向向肿肿瘤瘤患患者者的的骨骨髓髓细细胞胞导导入入某某种种耐耐药药基基因因，如如mdr-1mdr-1基基因因等等，以以增增强强骨骨髓髓细细胞胞的的抗抗药药性性，以以便便耐耐受大剂量的化疗药物，以达到彻底杀灭肿瘤细胞的目的。受大剂量的化疗药物，以达到彻底杀灭肿瘤细胞的目的。肿肿瘤瘤细细胞胞耐耐药药性性的的产产生生与与多多种种糖糖蛋蛋白白或或酶酶有有关关，包包括括多多药药耐耐药药（mdr-1mdr-1）基基因因编编码码的的P-P-糖糖蛋蛋白白、多多药药耐耐
49、药药相相关关蛋蛋白白（MRPMRP）以以及及近近年年来来发发现现的的肺肺耐耐药药相相关关蛋蛋白白等等；还还有有细细胞胞内内氧氧化化和和解解毒毒作作用用的的酶酶系系统统，包包括括细细胞胞色色素素P-P-450450（cytochrome cytochrome P-450P-450）、谷谷胱胱甘甘肽肽S-S-转转移移酶酶（GSTGST）以及谷胱甘肽过氧化物酶（以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PXGSH-PX）等等。）等等。目目前前除除了了开开发发针针对对肿肿瘤瘤细细胞胞耐耐药药性性产产生生机机制制的的拮拮抗抗剂剂，如如用用于于阻阻断断P-P-糖糖蛋蛋白白所所引引发发多多药药耐耐药药的的戊戊脉脉安安
50、（verapamilverapamil）和和用用于于阻阻断断GSHGSH合合成成的的丁丁硫硫氨氨酸酸亚亚砜砜胺胺（BSOBSO）等等。还还采采用用基基因因干干扰扰技技术术，在在基基因因水水平平阻阻断断耐耐药药基基因因的的表表达达，使使肿肿瘤瘤细细胞胞丧丧失失多多药药耐耐药药性性，从从而而易易于于被被化疗药物杀死。化疗药物杀死。（三）病毒性疾病的基因治疗研究（三）病毒性疾病的基因治疗研究 据统计，据统计，75%75%的人类传染病是由病毒引起的。的人类传染病是由病毒引起的。病毒感染人体后不仅可能急性发病，还可以在人病毒感染人体后不仅可能急性发病，还可以在人体内长期潜伏，造成终身伤害。病毒还是造成先