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1、关于基因诊断和基因治疗现在学习的是第1页，共73页概念：概念：基因基因是携带生物遗传信息的基本功能单位，是位是携带生物遗传信息的基本功能单位，是位于染色体上的一段特定于染色体上的一段特定DNA序列。基因的改变，会导致序列。基因的改变，会导致各种表型的改变，进而引起疾病的发生。各种表型的改变，进而引起疾病的发生。将基因或其组成部分发生异常的疾病统将基因或其组成部分发生异常的疾病统称为称为基因病基因病。现在学习的是第2页，共73页基因病分为三大类：基因病分为三大类：一、一、单基因病单基因病：由单个基因突变引起的一类疾病。由单个基因突变引起的一类疾病。如：血友病、地中海贫血等。如：血友病、地中海贫血
2、等。二、二、多基因病多基因病：由多个基因突变综合作用引起的：由多个基因突变综合作用引起的 疾病。如：恶性肿瘤、高血压、动脉硬化、疾病。如：恶性肿瘤、高血压、动脉硬化、糖尿病、先天畸形等、糖尿病、先天畸形等、三、三、获得性基因病获得性基因病：指外源基因（：指外源基因（DNA）侵入，）侵入，在机体产生疾病，一旦将其清除便可痊愈。在机体产生疾病，一旦将其清除便可痊愈。如：艾滋病及各种微生物感染病。如：艾滋病及各种微生物感染病。现在学习的是第3页，共73页第一节第一节 基因诊断基因诊断 （DNA diagnosis）一、基因诊断的概念和基本概况一、基因诊断的概念和基本概况临床诊断临床诊断生化学诊断生化
3、学诊断免疫学诊断免疫学诊断临床疾病诊断四种方式：临床疾病诊断四种方式：以疾病表型改变为依据。以疾病表型改变为依据。（细胞形态结构变化、代谢产物（细胞形态结构变化、代谢产物异常、特定蛋白分子识别差异等）异常、特定蛋白分子识别差异等）基因诊断基因诊断对患者基因直接分析对患者基因直接分析现在学习的是第4页，共73页基因诊断定义（概念）：基因诊断定义（概念）：基因诊断基因诊断是利用现代分子生物学和分子遗传学的是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测患者体内基因结构及其表达水平技术方法，直接检测患者体内基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断或辅助诊断。是否正常，从而对疾病作出诊断或
4、辅助诊断。基因诊断是在基因诊断是在DNA/RNA水平检测分析基因的存在、水平检测分析基因的存在、结构变异和表达状态，与结构变异和表达状态，与传统诊断方法传统诊断方法比较有其特比较有其特点：点：现在学习的是第5页，共73页基因诊断的特点：基因诊断的特点：1、病因诊断：、病因诊断：直接瞄准病理基因，不仅对表型出现的疾病作出诊断，还可能发现直接瞄准病理基因，不仅对表型出现的疾病作出诊断，还可能发现潜在的致病因素，如潜在的致病因素，如:确定有遗传家族史的人携带致病基因。确定有遗传家族史的人携带致病基因。2、特异性强、灵敏度高：、特异性强、灵敏度高：选用特定基因序列作为选用特定基因序列作为探针，单拷贝基
5、因采用高度扩增探针，单拷贝基因采用高度扩增PCR技术技术。3、稳定性高、稳定性高4、诊断范围广，适应性强、诊断范围广，适应性强目的基因是否处于活化状态均可。样品可长期保存。目的基因是否处于活化状态均可。样品可长期保存。可检测正在生长的病原体或潜在病原体。可检测正在生长的病原体或潜在病原体。（与以疾病表型改变为依据的（与以疾病表型改变为依据的 诊断技术相比）诊断技术相比）现在学习的是第6页，共73页基因诊断的基本概况：基因诊断的基本概况：伴随分子生物学理论技术的发展而建立和发展。伴随分子生物学理论技术的发展而建立和发展。DNA双螺旋双螺旋 遗传密码破译遗传密码破译 DNA重组重组 癌基因与抑癌基
6、因研究癌基因与抑癌基因研究 地中海贫血病基因治疗和逆转录病毒载体开发地中海贫血病基因治疗和逆转录病毒载体开发 PCR、分子杂交等一系列技术发展、分子杂交等一系列技术发展现在学习的是第7页，共73页二、基因诊断的对象二、基因诊断的对象1、病原生物的侵入、病原生物的侵入病原体：病毒、支原体、病原体：病毒、支原体、细菌、寄生虫细菌、寄生虫检查诊断方法：显微镜、免疫学方法、基因诊断等。检查诊断方法：显微镜、免疫学方法、基因诊断等。尤其是当无抗体时，基因诊断成为唯一手段。尤其是当无抗体时，基因诊断成为唯一手段。2、先天遗传性疾病、先天遗传性疾病遗传性疾病遗传性疾病:发病的原因为特定基因的突变。发病的原因
7、为特定基因的突变。现在学习的是第8页，共73页肿瘤的发生：肿瘤的发生：发病机理尚不请。发病机理尚不请。初步认为是个别细胞基因突变而引起的初步认为是个别细胞基因突变而引起的 细胞无限增殖细胞无限增殖.（包括抑癌基因和癌基因）（包括抑癌基因和癌基因）3、后天基因突变引起的疾病、后天基因突变引起的疾病二、基因诊断的对象二、基因诊断的对象现在学习的是第9页，共73页（1）用核心顺序的串联重复序列组成探针进行杂交研）用核心顺序的串联重复序列组成探针进行杂交研 究，可同时检出具有高度究，可同时检出具有高度多态性位点多态性位点。（2）用）用southern 杂交得到杂交得到DNA指纹图谱指纹图谱个体识别、亲
8、子鉴定、法医物证个体识别、亲子鉴定、法医物证4、其他、其他二、基因诊断的对象二、基因诊断的对象遗传稳定，个体特异，因而用于法医和亲子鉴定。遗传稳定，个体特异，因而用于法医和亲子鉴定。现在学习的是第10页，共73页基因诊断的基本策略：基因诊断的基本策略：1、检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因、检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因 这些基因根据其特定功能已被克隆，并被定位在这些基因根据其特定功能已被克隆，并被定位在染色体上，基因序列亦被测定，致病时的基因改变亦染色体上，基因序列亦被测定，致病时的基因改变亦较清楚。较清楚。如：已被克隆的病毒、细菌、霉菌和寄生虫的基因、如：已被克隆的病毒、细菌、
9、霉菌和寄生虫的基因、与致病有关的癌基因、抗癌基因、与致病有关的癌基因、抗癌基因、地中海贫血、苯丙酮尿症等遗传病基因。地中海贫血、苯丙酮尿症等遗传病基因。现在学习的是第11页，共73页2、检测与某种遗传标志连锁的致病基因、检测与某种遗传标志连锁的致病基因遗传连锁遗传连锁同一染色体相邻的二个或二个以上的基因或同一染色体相邻的二个或二个以上的基因或限制性酶切位点，由于位置十分靠近，在遗传时分离几率限制性酶切位点，由于位置十分靠近，在遗传时分离几率很低，常一起遗传很低，常一起遗传-称称连锁连锁。染色体遗传连锁图染色体遗传连锁图用限制性内切酶酶切位点作遗传用限制性内切酶酶切位点作遗传标志，定位与之相连锁
10、的正常基因与致病基因，建立相应的遗传标志，定位与之相连锁的正常基因与致病基因，建立相应的遗传连锁图谱。连锁图谱。定位性克隆定位性克隆根据遗传连锁图进行定位性克隆。比较正常根据遗传连锁图进行定位性克隆。比较正常和异常基因的差别，可找出导致遗传病的分子缺陷。和异常基因的差别，可找出导致遗传病的分子缺陷。定位性克隆定位性克隆策略是当前基因诊断的重要基础。策略是当前基因诊断的重要基础。现在学习的是第12页，共73页3、检测表型克隆基因、检测表型克隆基因针对多基因病（如：重度肥胖、哮喘、高血压、癫痫、针对多基因病（如：重度肥胖、哮喘、高血压、癫痫、精神病、多种自身免疫性疾病）。精神病、多种自身免疫性疾病
11、）。表型克隆技术表型克隆技术是将有关表型与基因结构结合，直接是将有关表型与基因结构结合，直接分离该表型的相关基因，并对疾病相关的分离该表型的相关基因，并对疾病相关的一组基因一组基因进行进行克隆，然后用作多种探针，来诊断多基因遗传病。克隆，然后用作多种探针，来诊断多基因遗传病。该策略既不需预先知道基因的生该策略既不需预先知道基因的生化功能或图谱定位，也不受化功能或图谱定位，也不受基因数目及其相互作用方式的影基因数目及其相互作用方式的影响。响。方法：方法：1、DD-RT-PCR：分析正常和异常基因组分析正常和异常基因组寻找两者之间的差异序列寻找两者之间的差异序列2、基因组错配筛选技术：、基因组错配
12、筛选技术：寻找两者的全同序列，分离、鉴寻找两者的全同序列，分离、鉴定与疾病相关的基因，确定导致疾病的分子缺陷定与疾病相关的基因，确定导致疾病的分子缺陷现在学习的是第13页，共73页基因诊断的基本步骤：基因诊断的基本步骤：1、获得待检样品：提取核酸、获得待检样品：提取核酸（PCR提高灵敏度提高灵敏度)2、制备和标记核酸探针、制备和标记核酸探针3、基因检测分析、基因检测分析 现在学习的是第14页，共73页三、基因诊断的常用技术三、基因诊断的常用技术l核酸分子杂交核酸分子杂交l聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）l限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RELP）l扩增片段长度多态性（扩增片段长
13、度多态性（AFLP）l等位基因特异的寡核苷酸（等位基因特异的寡核苷酸（ASO）l单链构象多态性（单链构象多态性（SSCP）l基因芯片基因芯片现在学习的是第15页，共73页1、核酸分子杂交、核酸分子杂交原理：原理：利用核酸的变性、复性及碱基互补的性质，用利用核酸的变性、复性及碱基互补的性质，用已知基因的核酸序列作已知基因的核酸序列作探针探针，与变性后的单链，与变性后的单链基因组基因组DNA/RNA杂交，检测核酸样品中是否杂交，检测核酸样品中是否存在与探针互补的同源核酸序列，进行存在与探针互补的同源核酸序列，进行DNA或或RNA定性定量分析。定性定量分析。基因检验的两个必要条件：基因检验的两个必要
14、条件：1、必需的特异探针（、必需的特异探针（标记的标记的）2、必需的基因组、必需的基因组DNA现在学习的是第16页，共73页核酸分子杂交核酸印迹杂交核酸分子杂交核酸印迹杂交lDNA印迹杂交（印迹杂交（Southern blot）lRNA印迹杂交印迹杂交 （Nouthern blot）l斑点印迹杂交斑点印迹杂交 （Dot-blot）l原位杂交原位杂交 (situ hybridization)现在学习的是第17页，共73页核酸印迹杂交基本过程：核酸印迹杂交基本过程：提取提取DNA或或RNA 酶切酶切 凝胶电泳凝胶电泳 胶变胶变 性处理（性处理（DNA）转印核酸片段到转印核酸片段到NC膜上。膜上。（
15、RNA可直接用可直接用变性胶电泳变性胶电泳，转膜），转膜）1、制备样品：、制备样品：现在学习的是第18页，共73页核酸印迹杂交基本过程：核酸印迹杂交基本过程：（2）制备探针：）制备探针：探针：一段能和待检测核酸分子按碱基互补配对探针：一段能和待检测核酸分子按碱基互补配对 原则而结合的核酸分子片段。原则而结合的核酸分子片段。探针需要标记可直接检测的元素或分子。探针需要标记可直接检测的元素或分子。如：同位素、荧光、生物素等如：同位素、荧光、生物素等现在学习的是第19页，共73页核酸印迹杂交基本过程：核酸印迹杂交基本过程：核酸印迹杂交可检测核酸印迹杂交可检测pg水平的靶分子水平的靶分子（4）检测：）
16、检测：方法依标记的探针而不同方法依标记的探针而不同 *放射性同位素放射性同位素 *生物素生物素 *地高辛地高辛 *荧光素荧光素（3）杂交：）杂交：预杂交封闭非特异性结合位点预杂交封闭非特异性结合位点 杂交探针与核酸分子结合杂交探针与核酸分子结合现在学习的是第20页，共73页核酸印迹杂交基本过程：核酸印迹杂交基本过程：现在学习的是第21页，共73页2、聚合酶链反应（、聚合酶链反应（PCR)原理：原理：以待扩增以待扩增DNA为模板为模板，在互补模板两端序列的，在互补模板两端序列的寡核苷酸引寡核苷酸引物物介导下，通过介导下，通过耐高温耐高温DNA聚合酶聚合酶催化下，按半保留复制机催化下，按半保留复制
17、机制延模板链延伸，快速、特异地扩增特定的制延模板链延伸，快速、特异地扩增特定的DNA。一种体外模拟自然一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术。复制过程的核酸扩增技术。（无细胞分子克隆技术）。（无细胞分子克隆技术）。现在学习的是第22页，共73页耐高温耐高温DNA聚合酶聚合酶Taq酶酶寡核苷酸引物：寡核苷酸引物：设计引物和确定退火温度是设计引物和确定退火温度是PCR 成功的关键成功的关键。PCR的基本过程：（循环程序）的基本过程：（循环程序）变性（变性（95）退火（退火（555565）延伸（延伸（72）35分分401分分100bp/1分分源自水栖高温菌，最适反应温度为源自水栖高温菌，最适反
18、应温度为72，且经，且经90以上加温后仍可在温度恢复后复性。以上加温后仍可在温度恢复后复性。现在学习的是第23页，共73页（呈（呈2n 扩增速度）扩增速度）PCR基本过程和原理特点：特异性强特点：特异性强 灵敏度高灵敏度高样品可以是：样品可以是：毛发、血痕毛发、血痕 单细胞、单细胞、病原体、病原体、肿瘤残留物、肿瘤残留物、犯罪现场遗留物犯罪现场遗留物现在学习的是第24页，共73页基因诊断中常用的基因诊断中常用的PCR技术：技术：（1）、）、DNA PCR：（2）、）、RT-PCR：以以DNA为模板，扩增特定核苷酸序列。用于检测特为模板，扩增特定核苷酸序列。用于检测特定基因片段的存在，分析鉴定基
19、因突变。定基因片段的存在，分析鉴定基因突变。以总以总RNA或或mRNA为模板，逆转录为为模板，逆转录为cDNA后扩增。用后扩增。用于检测特定基因表达水平的主要方法之一。于检测特定基因表达水平的主要方法之一。（3）、）、PCR-SSCP：检测基因未知突变的常用技术。简单、快捷、灵敏。检测基因未知突变的常用技术。简单、快捷、灵敏。现在学习的是第25页，共73页（4）、多重）、多重 PCR：指在一次指在一次PCR反应中加入多对引物，同时扩增反应中加入多对引物，同时扩增DNA序列上不同序列片段的一种序列上不同序列片段的一种PCR技术。用于一些技术。用于一些“超大超大”基因中大片段缺失分析。基因中大片段
20、缺失分析。（5）、原位）、原位 PCR：直接用组织切片和细胞进行直接用组织切片和细胞进行PCR或或RT-PCR，在组织、，在组织、细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特点基因序列。细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特点基因序列。（6）、实时定量）、实时定量 PCR：借助特异性结合借助特异性结合DNA的荧光染料，实时动态检测的荧光染料，实时动态检测PCR扩增的扩增的DNA量的变化。量的变化。现在学习的是第26页，共73页其他重要的其他重要的PCR衍生技术衍生技术反向反向PCR（IPCR）标记引物标记引物PCR（labelled primers PCR）锚定锚定PCR（anchored PCR）差异展示差异展示
21、PCR（DD-PCR）（见书（见书“分子生物学技术分子生物学技术”章节）章节）现在学习的是第27页，共73页3、限制性片段长度多态性（、限制性片段长度多态性（RFLP）检出方法：检出方法：Southern 印迹印迹概念：概念：用同一限制性内切酶完全切割同一物种的不同个体的基因组用同一限制性内切酶完全切割同一物种的不同个体的基因组DNA，出现分子质量不同的同源片段，这种由限制性内切酶酶切，出现分子质量不同的同源片段，这种由限制性内切酶酶切位点变化导致的位点变化导致的DNA片段差异，称限制性片段长度多态性片段差异，称限制性片段长度多态性（RFLP）。）。人类基因组中由人类基因组中由中性突变中性突变
22、导致个体间核苷酸导致个体间核苷酸的差异称的差异称DNA多态性多态性现在学习的是第28页，共73页RFLP类型：类型：2、由于链内发生较大片段的缺失、重复、插入和、由于链内发生较大片段的缺失、重复、插入和重重 排导致排导致DNA顺序的变化，因而酶切片段改变顺序的变化，因而酶切片段改变 序列多态性序列多态性。1、单个碱基的突变引起酶切位点的变化、单个碱基的突变引起酶切位点的变化 点多态性点多态性致病基因附近或内部一般存在致病基因附近或内部一般存在RFLP,可用于连锁可用于连锁分析的基因诊断。分析的基因诊断。现在学习的是第29页，共73页（四）扩增片段长度多态性（四）扩增片段长度多态性（AFLP）应
23、用于基因突变性质不明的连锁分析。应用于基因突变性质不明的连锁分析。AFLP串联重复的短片段的长度多态性通过串联重复的短片段的长度多态性通过PCR扩增扩增,经限制性内切酶酶切后电泳经限制性内切酶酶切后电泳,产生显示产生显示扩增片段多态性。扩增片段多态性。现在学习的是第30页，共73页AFLP原理：原理：首先利用可产生首先利用可产生粘性末端粘性末端的限制性内切酶酶切研究对的限制性内切酶酶切研究对象的基因组序列，产生不同长度的酶切片段。然后，将象的基因组序列，产生不同长度的酶切片段。然后，将这些酶切片段与含有与其有共同粘性末段的这些酶切片段与含有与其有共同粘性末段的人工接头连接人工接头连接，形成形成
24、模板模板。为达到。为达到选择性选择性扩增的目的，再在模板末端添加具有扩增的目的，再在模板末端添加具有选择性核苷酸（选择性核苷酸（13个）的不同引物个）的不同引物，然后，然后PCR扩增，结果扩增，结果只有那些两端序列与选择性核苷酸配对的酶切片段被扩增。最后只有那些两端序列与选择性核苷酸配对的酶切片段被扩增。最后将被扩增的片段在高分辨率的测序凝胶上电泳，这样其多态性即将被扩增的片段在高分辨率的测序凝胶上电泳，这样其多态性即根据扩增片段的长度与数量的不同而被分开。根据扩增片段的长度与数量的不同而被分开。PCR扩增产物即等位片段之间扩增产物即等位片段之间差别只有几个差别只有几个bp。现在学习的是第31
25、页，共73页5、等位基因特异的寡核苷酸（、等位基因特异的寡核苷酸（ASO）方方法法：1、合成两种探针：、合成两种探针：已知突变位点的核苷酸序列（已知突变位点的核苷酸序列（M M）正常基因碱基序列（正常基因碱基序列（N N）2、杂交实验结果：、杂交实验结果：M+N-受检者是突变基因的纯合子受检者是突变基因的纯合子 M-N+受检者是不存在突变基因受检者是不存在突变基因M-N-受检者的缺陷基因可能是一种新的突变类型受检者的缺陷基因可能是一种新的突变类型M+N+受检者是突变基因的杂合子受检者是突变基因的杂合子原理：原理：已知基因突变部位和性质，合成基因特异的核苷酸探针（已知基因突变部位和性质，合成基因
26、特异的核苷酸探针（20bp），标记后与受检者），标记后与受检者DNA杂交诊断。（可与杂交诊断。（可与PCR联用：联用：PCR-ASO）现在学习的是第32页，共73页6、单链构象多态性（、单链构象多态性（SSCP）日本日本Orita等研究发现，单链等研究发现，单链DNA片段呈复杂的片段呈复杂的空间折叠构象，当有一个碱基发生改变时，会或空间折叠构象，当有一个碱基发生改变时，会或多或多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变，少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同凝胶中受排阻大小不同.因此，通过因此，通过非
27、变性聚丙非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常可以非常 敏锐地将构敏锐地将构象上有差异的分子分离开象上有差异的分子分离开.PCR-SSCP现在学习的是第33页，共73页PCR-SSCP基本过程基本过程PCR扩增靶扩增靶DNA将特异的将特异的PCR扩增产物变性后快速复性扩增产物变性后快速复性;将单将单 链链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显 色分色分析结果析结果.若发现单链若发现单链DNA带迁移率与正常对照带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改的相比发生改变
28、，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该变，进而推断该DNA片段中有碱基突变片段中有碱基突变.现在学习的是第34页，共73页7、基因芯片、基因芯片 将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测根据杂交分子和与标记的样品进行杂交，通过检测根据杂交分子和未杂交分子信号的强弱进而判断样品中靶分子的数未杂交分子信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。量。基本原理：基本原理：（生物集成模片、（生物集成模片、DNA阵列、或寡核苷酸微芯片）阵列、或寡核苷酸微芯片）现在学习的是第35页，共73页基因芯片技术：基因芯片技术：现在学习的是第36页，共
29、73页目的：检测外源性基因的侵入目的：检测外源性基因的侵入目标：1 1、微生物、微生物2 2、病毒、病毒 如：如：HIVHIV（致艾滋病（致艾滋病 AIDSAIDS）3 3、寄生虫、寄生虫、4 4、不易体外培养的病原体（毒性大肠杆菌、麻风分枝、不易体外培养的病原体（毒性大肠杆菌、麻风分枝 杆菌）杆菌）5 5、实验室培养的病原体（克立氏体）、实验室培养的病原体（克立氏体）四、基因诊断的四、基因诊断的 临床应用临床应用:1、在感染性疾病检测中应用、在感染性疾病检测中应用现在学习的是第37页，共73页艾滋病与艾滋病与HIV病毒病毒艾滋病由艾滋病由HIV通过接触、血液、血制品及母婴传播通过接触、血液、
30、血制品及母婴传播感染所致。感染所致。HIV特异地侵犯辅助性特异地侵犯辅助性T细胞（细胞（CD4），），引起人体细胞免疫严重缺陷，导致顽固的机会性感引起人体细胞免疫严重缺陷，导致顽固的机会性感染，恶性肿瘤和神经系统损伤。染，恶性肿瘤和神经系统损伤。HIV 感染后，感染后，95%感染者感染者5个月可检出抗体（也有个月可检出抗体（也有3-4年仍不能检出抗体）。有必要进行年仍不能检出抗体）。有必要进行PCR技术检测。技术检测。现在学习的是第38页，共73页艾滋病与艾滋病与HIV病毒病毒检测技术：检测技术：巢式巢式-PCR、Southern、DNA序列分析序列分析引物的设计引物的设计：应在保守区（基因：
31、应在保守区（基因：pol,env,gag,tat)病毒特点：病毒特点：HIV病毒由两条单链病毒由两条单链RNA组成，组成，9.7k/RNA，主要基因结构和组成形成与其他逆转录病毒相同，但较主要基因结构和组成形成与其他逆转录病毒相同，但较之复杂，故称复杂反转录病毒之复杂，故称复杂反转录病毒HIV属反转录病毒即单链属反转录病毒即单链RNA反转录成双链反转录成双链DNA，进入宿主细胞染色体。进入宿主细胞染色体。现在学习的是第39页，共73页非典型性肺炎（非典型性肺炎（SARS）由一种新型冠状病毒（由一种新型冠状病毒（SARS-CoV）引起，多种）引起，多种途径传播，传染性强、高致死率的急性疾病。途径
32、传播，传染性强、高致死率的急性疾病。诊断依靠：诊断依靠：流行病学、临床表现、放射诊断、流行病学、临床表现、放射诊断、血清学（荧光免疫、血清学（荧光免疫、ELISA）PCR作为一种灵敏的早期病原学诊断必不可少作为一种灵敏的早期病原学诊断必不可少 （关键是引物的合成）（关键是引物的合成）现在学习的是第40页，共73页2、在遗传病检测中的应用、在遗传病检测中的应用 产前诊断产前诊断 检测妊娠检测妊娠812周的绒毛周的绒毛DNA或羊水细胞或羊水细胞 PCR诊断一系列遗传疾病诊断一系列遗传疾病 镰刀状细胞贫血的诊断镰刀状细胞贫血的诊断 方法：方法：RFLP诊断诊断 Mst酶切识别序列：酶切识别序列：CC
33、TCCTNANAGGGG 切割正常切割正常链序列：链序列：CCTCCTGAGAGG GG 不切割突变序列：不切割突变序列：CCTCCTG GT TGGGG ASOASO探针诊断探针诊断现在学习的是第41页，共73页3、在肿瘤检测中的应用、在肿瘤检测中的应用原癌基因原癌基因 生物正常细胞基因中编码关键性调控蛋白的生物正常细胞基因中编码关键性调控蛋白的 癌基因癌基因抑癌基因抑癌基因 一类抑制细胞增殖的基因，其失活可引起细一类抑制细胞增殖的基因，其失活可引起细 胞转化。胞转化。两类基因协同调控，使细胞生长处于平衡状态。两类基因协同调控，使细胞生长处于平衡状态。现在学习的是第42页，共73页癌基因激活
34、变化及检测：癌基因激活变化及检测：1、基因扩增：即染色体某区段基因拷贝数增加，或癌基、基因扩增：即染色体某区段基因拷贝数增加，或癌基 因的扩增。因的扩增。检测方法：检测方法：Southern 杂交杂交 定量定量PCR2、基因的过量表达：包括基因扩增基础上的过量表达及非、基因的过量表达：包括基因扩增基础上的过量表达及非 DNA水平的过量表达。水平的过量表达。检测方法：检测方法：Northern 杂交杂交 RT-PCR3、点突变：、点突变：检测方法为各种基于检测方法为各种基于PCR的方法。的方法。现在学习的是第43页，共73页抑癌基因的检测：抑癌基因的检测：Southern PCR大片段的缺失、和
35、点突变大片段的缺失、和点突变*两个等位抑癌基因突变才能引起肿瘤，需检两个等位抑癌基因突变才能引起肿瘤，需检出两个等位抑癌基因。出两个等位抑癌基因。方法：方法：RFLP结合结合PCR，进行缺失检测，进行缺失检测 点突变主要采用点突变主要采用PCR现在学习的是第44页，共73页肿瘤标志物：肿瘤标志物：指特征性存在于恶性肿瘤或由恶性肿瘤细指特征性存在于恶性肿瘤或由恶性肿瘤细 胞异常产生的物质或宿主对肿瘤反应而产胞异常产生的物质或宿主对肿瘤反应而产 生的物质。生的物质。（1）酶类肿瘤标志物）酶类肿瘤标志物（2）激素类标志物）激素类标志物（3）胚胎抗原）胚胎抗原（4）特殊蛋白标志物）特殊蛋白标志物（5）
36、糖蛋白类抗原）糖蛋白类抗原（6）血中癌基因蛋白）血中癌基因蛋白（7）唾液酸和唾液酸酰基转移酶）唾液酸和唾液酸酰基转移酶（8）多胺）多胺免疫组化筛选提高检出率免疫组化筛选提高检出率现在学习的是第45页，共73页法医学鉴定法医学鉴定针对人类针对人类DNA 遗传差异进行的个体识别和亲子鉴定。遗传差异进行的个体识别和亲子鉴定。常用技术常用技术:DNA指纹分析（指纹分析（VNTR）短串联重复序列（短串联重复序列（STR）遗传特征分析）遗传特征分析PCR-扩增片段长度多态性（扩增片段长度多态性（AmP-FLP)PCR-mtDNA技术技术根据根据可变串联重复序列可变串联重复序列（小卫星（小卫星DNA）多态性
37、）多态性 高度的个体特异性高度的个体特异性现在学习的是第46页，共73页DNA指纹（图谱）分析：指纹（图谱）分析：、选择核心序列作探针，选在核心序列上无切割、选择核心序列作探针，选在核心序列上无切割 位点的限制性内切酶，酶解样品，位点的限制性内切酶，酶解样品，Southern blot得到得到DNA指纹图谱指纹图谱。针对可变串联重复序列（针对可变串联重复序列（VNTR）（VNTR是判断个体的遗传标志）是判断个体的遗传标志）、针对、针对VNTR侧翼保守区侧翼保守区序列设计探针，用序列设计探针，用PCR 对该区扩增，电泳得到个体之间长度不同的条对该区扩增，电泳得到个体之间长度不同的条 带图谱。（带
38、图谱。（VNTR片段较长片段较长PCR不易扩增）。不易扩增）。现在学习的是第47页，共73页第二节第二节 基因治疗（基因治疗（gene therapuy)概念：概念：将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因缺陷和异常基因引起的疾病，达到治疗目的。缺陷和异常基因引起的疾病，达到治疗目的。导入的基因可以与缺陷基因对应、在体内表达具有特异功能的同源基因、导入的基因可以与缺陷基因对应、在体内表达具有特异功能的同源基因、也可以是与缺陷基因无关的治疗基因。也可以是与缺陷基因无关的治疗基因。概念的扩展：概念的扩展：凡是采用分子生物学方法原理，将某种遗传物质转移凡是采用
39、分子生物学方法原理，将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，达到治疗目的到患者细胞内，使其在体内发挥作用，达到治疗目的的方法，都可称为基因治疗。的方法，都可称为基因治疗。现在学习的是第48页，共73页基因治疗策略基因治疗策略:总原则：总原则：直接补替缺陷基因直接补替缺陷基因抑制非正常基因产物表达抑制非正常基因产物表达间接调节机体本身免疫系统的抗病能力。间接调节机体本身免疫系统的抗病能力。利用外源基因对病变细胞造成特异性杀伤利用外源基因对病变细胞造成特异性杀伤现在学习的是第49页，共73页1、基因矫正将致病基因的碱基进行纠正，而正常部分予以保留。、基因矫正将致病基因的碱基进行纠正，而
40、正常部分予以保留。2、基因置换用正常基因通过体内基因同源重组，原位置换病变细、基因置换用正常基因通过体内基因同源重组，原位置换病变细 胞内的致病基因，使细胞内的胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常完全恢复正常3、基因增补将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常、基因增补将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常 基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达 产物补偿缺陷基因的功能或使原有功能得以加强。产物补偿缺陷基因的功能或使原有功能得以加强。4、基因失活利用反义技术特异封闭基因表达，抑制有害基因、基因失活利用反义技术特异封闭基因表达，
41、抑制有害基因 的表达。的表达。5、免疫调节将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内，、免疫调节将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内，改变病人免疫状态，达到预防和治疗的目的。改变病人免疫状态，达到预防和治疗的目的。基因治疗的策略：基因治疗的策略：现在学习的是第50页，共73页6、调节性基因治疗：、调节性基因治疗：导入编码调控蛋白的基因，治疗导入编码调控蛋白的基因，治疗 基因表答异常的疾病基因表答异常的疾病7、化疗保护性基因治疗：、化疗保护性基因治疗：导入单相或多相细胞毒性药导入单相或多相细胞毒性药 物的抗性基因，使正常细胞耐受化疗药物的能力大物的抗性基因，使正常细胞耐受化疗药物的能力大 大提
42、高。大提高。8、特异性细胞杀伤性基因治疗：利用、特异性细胞杀伤性基因治疗：利用DNA重组技术构建重组技术构建 特异性杀伤靶细胞为目标的特异性杀伤靶细胞为目标的“奇异弹头奇异弹头”，“弹头弹头”部分是部分是 分子重组的各种生物细胞毒素，它们以酶催化方式发挥分子重组的各种生物细胞毒素，它们以酶催化方式发挥 抑制蛋白合成作用，造成细胞杀伤。抑制蛋白合成作用，造成细胞杀伤。9、生殖细胞基因治疗：生殖细胞或胚胎干细胞补偿性治疗、生殖细胞基因治疗：生殖细胞或胚胎干细胞补偿性治疗现在学习的是第51页，共73页基因治疗基本程序基因治疗基本程序;方法：方法：1、体外法、体外法（ex vivo):2、体内法、体内
43、法 (in vivo):将受体细胞在体外培养，转入外源基因，经适当选择将受体细胞在体外培养，转入外源基因，经适当选择系统，将重组的受体细系统，将重组的受体细 胞回输患者体内，以改善症胞回输患者体内，以改善症状。（普遍采用）状。（普遍采用）直接将外源基因导入体内有关的组织器官直接将外源基因导入体内有关的组织器官,使其进入相应的使其进入相应的细胞并转录、表达而发挥治疗作用。细胞并转录、表达而发挥治疗作用。基本程序：基本程序：选择目的基因选择目的基因选择基因载体选择基因载体选择靶细胞选择靶细胞基因转移基因转移外源基因表达及检测外源基因表达及检测回输体内回输体内现在学习的是第52页，共73页治疗基因的
44、来源：治疗基因的来源：1、野生型基因：、野生型基因：-单基因缺陷遗传病基因单基因缺陷遗传病基因 -反义核酸封闭活化的原癌基因反义核酸封闭活化的原癌基因 -转入相关的抑癌基因，抑制肿瘤转入相关的抑癌基因，抑制肿瘤2、重组、重组DNA和分子克隆技术，人工合成特异和分子克隆技术，人工合成特异 基因。基因。1、选择治疗的目的基因、选择治疗的目的基因现在学习的是第53页，共73页用于基因治疗的基因应满足以下条件：用于基因治疗的基因应满足以下条件：（1）体内仅少量表达就可显著改善症状。）体内仅少量表达就可显著改善症状。（2）该基因的过量表达不会对机体造成危害、）该基因的过量表达不会对机体造成危害、（3）在
45、抗病毒和抗病原体的基因治疗中，所选）在抗病毒和抗病原体的基因治疗中，所选 择的靶基因应在病毒和病原体的生活史中择的靶基因应在病毒和病原体的生活史中 起重要作用，并且该序列是特异的。起重要作用，并且该序列是特异的。现在学习的是第54页，共73页理想的载体具有以下特征：理想的载体具有以下特征：1 1、容易生产、容易生产-商业化生产，广泛应用，易运输，易保存商业化生产，广泛应用，易运输，易保存2 2、持续表达、持续表达-一旦转入体内，应能在一定时间内持续表达基因产一旦转入体内，应能在一定时间内持续表达基因产 物，或能通过某种方法精细调节其表达。物，或能通过某种方法精细调节其表达。3 3、弱免疫源、弱
46、免疫源-转入后不应引起免疫反应。转入后不应引起免疫反应。4 4、组织靶向性、组织靶向性-定向输入某种细胞。定向输入某种细胞。5 5、包装容量载体对转染基因的大小应没有限制。、包装容量载体对转染基因的大小应没有限制。6 6、复制、分裂和整合能力：特异性定位整合，或以游离基因形式、复制、分裂和整合能力：特异性定位整合，或以游离基因形式 存在于细胞核内。存在于细胞核内。7 7、能感染分裂期细胞和未分裂期细胞、能感染分裂期细胞和未分裂期细胞2、选择基因载体：、选择基因载体：现在学习的是第55页，共73页基因载体：基因载体：非病毒载体非病毒载体（裸（裸DNA、脂质体）、脂质体）病毒载体病毒载体 （反转录
47、病毒、腺病毒、腺相关病毒）（反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒）分类：分类：优点：优点：大量生产，毒性小，低免疫性大量生产，毒性小，低免疫性缺点：效率低。缺点：效率低。优点：多数病毒可感染特异细胞，不易降解，优点：多数病毒可感染特异细胞，不易降解，RNARNA病毒能整合到宿主染色体，表达病毒能整合到宿主染色体，表达 水平高等。水平高等。现在学习的是第56页，共73页病毒介导的基因转移病毒介导的基因转移1、逆转录病毒：、逆转录病毒：正链正链RNA病毒病毒现在学习的是第57页，共73页逆转录病毒结构逆转录病毒结构:基因组组成：基因组组成：（1）5帽子；帽子；3尾巴；尾巴；（2）每个单链每个单链RNA含
48、含6个区：个区：5-LTR（长末端重复序列）（长末端重复序列）+（组装所需的非编码序列）（组装所需的非编码序列）gag（编码衣壳结构蛋白基因）（编码衣壳结构蛋白基因）pol（编码反转录酶基因）（编码反转录酶基因）env（编码外壳蛋白基因）（编码外壳蛋白基因）3-LTR现在学习的是第58页，共73页逆转录病毒生活周期逆转录病毒生活周期:1、感染靶细胞、感染靶细胞2、利用自身编码的逆反转录酶，以、利用自身编码的逆反转录酶，以RNA为模板合成为模板合成DNA。3、将病毒、将病毒DNA转运至宿主细胞核转运至宿主细胞核4、病毒、病毒DNA整合到宿主染色体整合到宿主染色体5、以病毒、以病毒DNA为模板转录
49、为模板转录RNA6、在细胞中翻译、在细胞中翻译Gag、Pol和和Env蛋白蛋白7、形成衣壳，、形成衣壳，RNA单链和反转录酶一起包装进衣壳。单链和反转录酶一起包装进衣壳。8、形成病毒颗粒并分泌到胞外。、形成病毒颗粒并分泌到胞外。现在学习的是第59页，共73页逆转录病毒逆转录病毒病毒病毒RNARNA宿主细胞宿主细胞RTRTRT逆转录酶逆转录酶cDNAcDNA双链双链双链双链插入插入插入插入基因组基因组基因组基因组DNADNA逆转录病毒感染过程逆转录病毒感染过程病毒病毒病毒病毒RNARNA现在学习的是第60页，共73页构建逆转录病毒载体：构建逆转录病毒载体：（1）构建）构建重组重组野生性病毒：插野
50、生性病毒：插入相关外源基因，改造成入相关外源基因，改造成DNA载体（包括插入选择性载体（包括插入选择性标记），替代病毒的编码基因。标记），替代病毒的编码基因。（2）制备辅助细胞（）制备辅助细胞（293T细胞细胞），为载体），为载体DNA提供其丧失提供其丧失的功能。的功能。（3）载体）载体DNA导入辅助细胞，导入辅助细胞，产生病毒载体。产生病毒载体。（4）用病毒载体感染细胞，外源）用病毒载体感染细胞，外源基因在宿主细胞中表达。基因在宿主细胞中表达。现在学习的是第61页，共73页逆转录病毒载体的缺陷：逆转录病毒载体的缺陷：1、只能转染处于增殖状态的细胞、只能转染处于增殖状态的细胞2、所携带的外源基